Matching CO2 large point sources and potential geological storage sites in mainland Portugal

Disserta����o apresentada na Faculdade de Ci��ncias e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obten����o do grau de Mestre em Engenharia do Ambiente, Perfil Gest��o e Sistemas Ambientais

Development of biocompatible and ���smart��� porous structures using CO2-assisted processes

Disserta����o apresentada para a obten����o do grau de Doutor em Engenharia Qu��mica, especialidade Engenharia da Reac����o Qu��mica, pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ci��ncias e Tecnologia

An��lise do balan��o entre sequestro e emiss��o de CO2 resultante do circuito de produ����o e consumo de biomassa florestal numa central de co-gera����o

Disserta����o apresentada na Faculdade de Ci��ncias e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obten����o do grau de Mestre em Bioenergia

O2/CO2-sensitive cyclic AMP-signalling pathway in peripheral chemoreceptors

RESUMO: O corpo carot��deo (CB) �� um pequeno ��rg��o sens��vel a varia����es na PaO2, PaCO2 e pH. As c��lulas tipo I (c��lulas gl��micas) do corpo carot��deo, as unidades sensoriais deste ��rg��o, libertam neurotransmissores em resposta ��s varia����es dos gases arteriais. Estes neurotransmissores atuam quer em recetores pr��-sin��pticos, localizados nas c��lulas tipo I, quer em recetores p��ssin��pticos, localizados nas termina����es do nervo do seio carot��deo, ou em ambos. A activa����o dos recetores pr��-sin��pticos modula a atividade do corpo carot��deo, enquanto que, a activa����o dos recetores p��s-sin��pticos, de carater excitat��rio, desencadeia um aumento da frequ��ncia de descarga das fibras do CSN, com subsequente despolariza����o dos neur��nios do g��nglio petroso, e posterior despolariza����o de um grupo espec��fico de neur��nios do centro respirat��rio central, desencadeando, como resposta final, hiperventila����o. Estes recetores pr��- e p��s-sin��pticos podem ser classificados em ionotr��picos ou metabotr��picos, estando os ��ltimos acoplados a adenilatos ciclases transmembranares (tmAC). O mecanismo exato pelo qual as varia����es dos gases arteriais s��o detetadas pelo CB n��o se encontra ainda completamente elucidado, mas tem sido sugerido que altera����es nos n��veis de cAMP estejam associadas ao mecanismo de dete����o de varia����es de O2 e CO2. Os n��veis de cAMP podem ser regulados atrav��s da sua via de s��ntese, mediada por dois tipos de adenilatos ciclases: tmAC sens��vel aos eurotransmissores e adenilato ciclase sol��vel (sAC)sens��vel a varia����es de HCO3/CO2, e pela sua via de degrada����o mediada por fosfodiesterases. A via de degrada����o do cAMP pode ser manipulada farmacologicamente, funcionando enquanto alvo terap��utico para o tratamento de patologias do foro respirat��rio (e.g. asma, hipertens��o pulmonar, doen��a pulmonar obstructiva cr��nica e apneia do sono), que induzem um aumento da actividade do CB.O trabalho descrito nesta disserta����o partiu da hip��tese de que a actividade do CB �� manipulada por f��rmacos, que interferem com a via de sinaliza����o do cAMP, tendo sido nosso objectivo geral, investigar o papel do cAMP na quimiotransdu����o do CB de rato, e determinar se a actividade dos enzimas respons��veis pela via de sinaliza����o do cAMP �� ou n��o regulada por varia����es de O2/CO2. Assim, a relev��ncia deste trabalho �� a de estudar e identificar poss��veis alvos moleculares (sAC, isoformas de tmAC e PDE) com potencial para serem usados no tratamento de patologias relacionadas com o controlo respirat��rio. A primeira parte do presente trabalho, centrou-se na caracteriza����o farmacol��gica da PDE4 no CB e em tecidos n��o quimiorecetores (e.g. g��nglio cervical superior e art��rias car��tidas), e na observa����o do efeito de hip��xia aguda na acumula����o dos n��veis de cAMP, induzidos pelos inibidores de PDE, nestes tecidos. A quantifica����o de cAMP foi efectuada por t��cnica imunoenzim��tica (EIA), tendo sido elaboradas curvas de dose-resposta para os efeitos de inibidores, n��o espec��ficos (IBMX) e espec��ficos para a PDE2 e PDE4 (EHNA, Rolipram e Ro 20-1724), nos n��veis de cAMP acumulados, em situa����es de norm��xia (20%O2/5%CO2) e hip��xia (5%O2/5%CO2). A caracteriza����o das PDE no g��nglio cervical superior foi aprofundada, utilizando-se a t��cnica de transfer��ncia de energia de resson��ncia por fluoresc��ncia (FRET) em culturas prim��rias de neur��nios, na presen��a de inibidores n��o espec��ficos (IBMX) e espec��ficos para a PDE3 e PDE4 (milrinone e rolipram, respetivamente). Foram igualmente estudadas, atrav��s de RT-qPCR, as altera����es na express��o de PDE3A-B e PDE4A-D, no g��nglio cervical superior, em resposta a diferentes percentagens de oxig��nio. Na segunda parte do trabalho investigou-se a via de s��ntese do cAMP no CB em resposta a varia����es na concentra����o de HCO3/CO2. Em concreto, o protocolo experimental centrou-se na caracteriza����o da sAC, dado que a sua actividade �� regulada por varia����es de HCO3/CO2. A caracteriza����o da express��o e regula����o da sAC, em resposta a varia����es de HCO3/CO2 ,foi efectuada no CB e em tecidos n��o quimioreceptores perif��ricos (e.g. g��nglio cervical superior, petroso e nodoso) por qRT-PCR. A actividade deste enzima foi caracterizada indirectamente atrav��s da quantifica����o dos n��veis de cAMP (quantifica����o por EIA), induzidos por diferentes concentra����es de HCO3/CO2, na presen��a de MDL-12,33-A, um inibidore da tmAC. A express��o das isoformas da tmAC no CB e g��nglio petroso foi determinada por RT-qPCR. Adicionalmente, estud��mos a contribui����o relativa da tmAC e sAC no mecanismo de sensibilidade ao CO2 no CB. Para o efeito foram estudadas as altera����es: 1) nos n��veis de cAMP (quantificado por EIA) na presen��a de diferentes concentra����es de HCO3/CO2 e ao longo do tempo (5-30 min); 2) na ativa����o da prote��na cinase A (PKA, FRET baseado em sensores) em c��lulas tipo I do CB; e 3) na frequ��ncia de descarga do CSN (registos) na presen��a e aus��ncia de ativadores e inibidores da sAC,tmAC e PKA. Por ��ltimo, foi caracterizada a express��o e actividade da sAC nos quimioreceptors centrais (locus ceruleus, rafe e medula ventro-lateral) atrav��s de t��cnicas de RT-qPCR e EIA. A express��o das isoformas da tmAC foi aprofundada no locus coeruleus atrav��s de RT-qPCR. Por fim, compar��mos a contribui����o da tmAC e sAC nos n��veis de cAMP no locus coeruleus em condi����es de normocapnia e hipercapnia.O nosso trabalho teve os seguintes resultados principais: 1) PDE4 est�� funcional no corpo carot��deo, art��rias car��tidas e g��nglio cervical superior de rato, embora a PDE2 s�� se encontre funcional neste ��ltimo; 2) Os efeitos dos inibidores de PDE nos n��veis de acumula����o de cAMP foram exacerbados em situa����es de hip��xia aguda no CB e art��rias car��tidas, mas foram atenuados no g��nglio cervical superior; 3) No g��nglio cervical superior, diferentes tipos de c��lulas apresentaram uma caracteriza����o espec��fica de PDEs, sugerindo uma subpopula����o de c��lulas neste g��nglio com fun����es fisiol��gicas distintas; 4) Embora todas as isoformas de PDE4 e PDE3 estivessem presentes no g��nglio, a PDE3a, PDE4b e a PDE4d foram as isoformas mais expressas. Por outro lado, incuba����es de g��nglio cervical superior, em diferentes percentagens de oxig��nio, n��o alteraram (n��o regularam) significativamente a express��o das diferentes isoformas de PDE neste ��rg��o; 5) a sAC encontra-se expressa e funcional no CB e nos quimiorecetores centrais estudados (locus coeruleus, rafe e medula ventrolateral). A sAC apresenta maior express��o no CB comparativamente aos restantes org��os estudados, exceptuando os test��culos, org��o controlo. Varia����es de HCO3/CO2 de 0/0 para 24/5 aumentaram os n��veis de cAMP no CB e quimiorecetores centrais, tendo sido o aumento mais significativo observado no CB. Concentra����es acima dos 24mM HCO3/5%CO2 n��o induziram altera����es nos n��veis de cAMP, sugerindo que a actividade da sAC se encontra saturada em condi����es fisiol��gicas (normocapnia) e que este enzima n��o desempenha qualquer papel na dete����o de situa����es de hipercapnia; 6) No CB, a express��o das isoformas tmAC1, tmAC4, tmAC6 e tmAC9 �� mais elevada comparativamente �� express��o da sAC; 7) Utilizamos diferentes inibidores da tmAC (MDL 12-330A, 500��M, 2���5���-ddADO, 30-300��M, SQ 22536, 200��M) e da sAC (KH7, 10-100��M) para estudar a contribui����o relativa destes enzimas na acumula����o do cAMP no CB. Tanto a tmAC como a sAC contribuem para a acumula����o dos n��veis de cAMP em condi����es de hipercapnia. Contudo, existe um maior efeito destes inibidores nas condi����es de 12 mM HCO3/2.5%CO2 do que em condi����es de normocapnia e hipercapnia, sugerindo um papel relevante destes enzimas na atividade do CB em situa����es de hipocapnia; 8) N��o se observaram varia����es nos n��veis de cAMP em resposta a diferentes concentra����es de HCO3/CO2 ao longo do tempo (5-30 min). O efeito inibit��rio induzido por ddADO e KH7 foi sobrepon��vel ap��s 5 ou 30 minutos de incuba����o em todas as concentra����es de HCO3/CO2 estudadas; 9) Por ��ltimo, verificou-se um aumento na frequ��ncia da descarga do nervo do seio carot��deo entre as condi����es de normocapnia e hipercapnia ac��dica. Ao contr��rio do KH7 (10��M), o 2���5���-ddADO reduziu significativamente a frequ��ncia de descarga do nervo, quer em condi����es de normocapnia quer de hipercapnia ac��dica. Contudo, n��o se verificou aumento na frequ��ncia de descarga do nervo entre normocapnia e hipercapnia isoh��drica, sugerindo que a sensibilidade �� hipercapnia no CB �� mediada por varia����es de pH. Em conclus��o, os resultados decorrentes deste trabalho permitiram demonstrar que, embora os enzimas que medeiam a via de sinaliza����o do cAMP possam ser bons alvos terap��uticos em condi����es particulares, a sua actividade n��o �� espec��fica para o CB. Os resultados sugerem ainda que o cAMP n��o �� um mediador espec��fico da transdu����o �� hipercapnia neste org��o. Contudo, os nossos resultados demonstraram que os n��veis de cAMP s��o mais elevados em condi����es fisiol��gicas, o que sugere que o cAMP possa ter uma fun����o homeost��tica neste org��o. Por ��ltimo, o presente trabalho demonstrou que os aumentos de cAMP descritos por outros em condi����es de hipercapnia, n��o s��o observ��veis quando o pH se encontra controlado. ------------------ ABSTRACT: The work presented in this dissertation was aimed to establish how specific is cAMP-signaling pathways in the CB mainly in different CO2 conditions and how O2 concentrations alter/drives the manipulation of cAMP signaling in the CB. The experimental studies included in this thesis sought to investigate the role of cAMP in the rat CB chemotransduction mechanisms and to determine whether the enzymes that participate in cAMP signal transduction in the CB are regulated by O2/CO2. We characterized the enzymes involved in the cAMP-signaling pathway in the CB (sAC, tmAC, PDE) under different O2/CO2 conditions. Our results demonstrated that many of these enzymes are involved in CO2/O2 sensing and while they may be useful in treating conditions with alterations in CO2/O2 sensing,they will not be specific to chemoreception within the CB: 1) PDE4 is ubiquitously expressed in CB and non-chemoreceptor related tissues and their affinity to inhibitors change with O2 tensions in both CB and carotid arteries, and 2) sAC and tmAC are expressed in peripheral and central chemo- and non-chemoreceptor tissues and their effect on cAMP levels do not change between normocapnic and isohydric hypercapnic conditions. Our results provide evidence against a specific role of cAMP as a mediator for O2 and CO2 chemotransduction in the rat CB and emphasized the role of pH in CO2 sensitivity of the CB. Furthermore, our results demonstrate that cAMP levels are maintained higher under physiological conditions, supporting recent finding from our lab, which all together suggests that cAMP has a homeostatic function in this organ.

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