Production of recombinant protein hLIF in static and dynamic systems of animal cell culture

Thesis for the Degree of Master of Science in Biotechnology Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia

A detecção remota e os SIG na produção animal - análise da contribuição e situação actual

Dissertação apresentada como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciência e Sistemas de Informação Geográfica

Terapêuticas antigénio-especificas no tratamento das doenças desmielinizantes: estudos sobre a vacinação com ADN e a descoberta de um novo alvo antigénico

RESUMO A Esclerose Múltipla (EM) é uma doença desmielinizante crónica do Sistema Nervoso Central (SNC), provocada, em grande parte, por um ataque imuno-mediado contra diversos elementos da bainha de mielina. Dentro dos alvos antigénicos desta resposta autoimune, vários componentes proteicos e lipídicos da mielina têm vindo a ser identificados ao longo dos anos, entre os quais se destacam a proteína básica de mielina(MBP), glicoproteína ligodendrocitária da mielina (MOG), proteína proteolipídica (PLP) e glicoproteína associada à mielina (MAG). Com o desenvolvimento do modelo animal de Encefalomielite Autoimune Experimental (EAE), diversas terapias antigénio-específicas foram desenhadas, baseadas na modificação benéfica da resposta autoimune contra a mielina, tais como a administração de mielina ou seus componentes, os copolímeros terapêuticos, os ligandos peptídeos alterados e, recentemente, a vacinação com ácido desoxirribonucleico (ADN) codificador de proteínas de mielina, integrado em plasmídeos e purificado para administração parentérica. Neste trabalho, apresentamos os resultados de um extenso conjunto de experiências, subordinadas a dois temas fundamentais: 1) avaliação do potencial terapêutico, e dos mecanismos de acção, da vacinação tolerizadora com ADN codificador de proteínas de mielina (MBP, MOG, PLP, MAG) na EAE, e da associação desta vacinação com a administração de ADN de citocinas Th2, ou de oligonucleótidos imunomoduladores; 2) identificação e caracterização da resposta imune contra um novo componente da mielina com potencial antigénico, a proteína inibidora do recrescimento axonal, Nogo-A. No que respeita à vacinação com ADN, os nossos resultados comprovam a eficácia desta terapêutica antigénio-específica na prevenção e tratamento da EAE. Os seus mecanismos de acção incluem, entre outros, a supressão anérgica da proliferação antigénioespecífica dos linfócitos T anti-mielina (no modo de prevenção da doença), o enviesamento Th2 da resposta imune (quando co-administrada com a vacina de ADN codificadora da citocina IL-4, funcionando como terapia génica local), e a redução da diversificação de epítopos da resposta humoral anti-mielina, avaliada através de myelin spotted arrays. A associação das vacinas de ADN com oligonucleótidos imunomoduladores GpG, desenvolvidos para contrariar as sequências CpG imunoestimuladoras presentes no vector de vacinação, levou à melhoria da sua eficácia terapêutica, devida, provavelmente, ao efeito estimulador preferencial dos oligonucleótidos GpG sobre linfócitos Th2 e sobre células reguladoras NK-T. Com base nestes resultados a vacinação com ADN foi desenvolvida para o tratamento da EM em humanos, com ensaios clínicos a decorrerem neste momento. Em relação à proteína Nogo-A, estudos de estrutura primária e de previsão de antigenicidade identificaram a região Nogo-66 como alvo antigénico potencial para a EAE. Nas estirpes de ratinho SJL/J e C57BL/6, fomos capazes de induzir sinais clínicos e histológicos de EAE após imunização com os epítopos encefalitogénicos Nogo1-22, Nogo23- 44 e Nogo45-66, utilizando protocolos de quebra de tolerância imune. Ao mesmo tempo, identificámos e caracterizámos uma resposta linfocitária T específica contra os antigénios contidos na região Nogo-66, e uma resposta linfocitária B com diversificação intra e intermolecular a vários determinantes presentes noutras proteínas da mielina. A transferência adoptiva de linhas celulares Th2 anti-Nogo45-66, levou à melhoria clínica e histológica da EAE em animais recipientes induzidos com outros antigénios de mielina, após migração destas células para o SNC. Estes dados comprovam a importância da Nogo-66 como antigénio na EAE, e a eficácia de terapias antigénio-específicas nela baseadas. No seu conjunto, os nossos resultados confirmam o potencial terapêutico das vacinas de ADN codificadoras de proteínas de mielina, bem como a importância dos encefalitogénios contidos na proteína Nogo-A para a fisiopatologia da EAE e da EM, com eventual relevância para o desenvolvimento de novas terapias antigénio-específicas. O aperfeiçoamento futuro destas terapias poderá levar, eventualmente, a uma capacidade de manipulação da resposta imune que permita o tratamento eficaz das doenças inflamatórias desmielinizantes, como a Esclerose Múltipla. ABSTRACT Multiple Sclerosis (MS) is a chronic demyelinating disease of the Central Nervous System (CNS), caused, mainly, by an immune-mediated attack against several elements of the myelin sheath. Among the antigenic targets for this autoimmune response, several proteic and lipidic myelin components have been identified throughout the years, of which myelin basic protein (MBP), myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG), proteolipidic protein (PLP), and myelin associated glycoprotein (MAG) are the best characterized. With the development of the animal model for MS, Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE), several antigen-specific therapies have been designed, based on beneficial modifications of the autoimmune response against myelin. These have included myelin and myelin component administration, therapeutic copolymers, altered peptide ligands and, more recently, vaccination with myelin-protein encoding deoxyribonucleic acid (DNA), integrated into plasmids and purified for parenteral administration. In this work we present the results of an extensive series of experiments, subordinate to two fundamental areas: 1) evaluating the therapeutic potential, and mechanisms of action, of tolerizing myelin protein (MBP, MOG, PLP, MAG) DNA vaccination in EAE, alone and in association with Th2 cytokine DNA administration, or immunomodulatory oligonucleotides; 2) identifying and characterizing the immuneresponse against a new myelin component with antigenic potential, the axonal regrowth inhibitor Nogo-A. Regarding DNA vaccination, our results prove the efficacy of this antigen-specific therapy for the prevention and treatment of EAE. Its mechanisms of action include, among others, anergic suppression of antigen-specific T-cell proliferation against myelin (in prevention mode), Th2 biasing of the immune response (when co-administered with the IL- 4 codifying DNA vaccine, acting as local gene therapy), and reduction of epitope spreading of the anti-myelin antibody response, assessed by myelin spotted arrays. The combination of myelin DNA vaccination with the administration of GpG immunomodulatory oligonucleotides, designed to counteract immunostimulatory CpG motifs present in the vaccination vector, led to an improvement in therapeutic efficacy, probably due to the preferential stimulatory effect of GpG oligonucleotides on Th2 lymphocytes and on regulatory NK-T cells. Based on these results, tolerizing DNA vaccination is being developed for human use, with ongoing clinical trials. As concerns the Nogo-A protein, based on studies of primary structure and prediction of antigenicity, we identified the Nogo-66 region (responsible for the most of the inhibitory capacity of this protein) as a potential antigenic target for EAE. In the SJL/Jand C57BL/6 mouse strains, we were able to induce clinical and histological signs of EAE,after immunization with the encefalitogenic epitopes Nogo1-22, Nogo23-44 and Nogo45-66,using a tolerance breakdown protocol. Concomitantly, we identified and characterized a specific T cell response against these antigens, together with a B cell response which showed extensive intra and intermolecular epitope spread to several determinants present in other myelin proteins. Adoptive transfer of nti-Nogo45-66 Th2 cell lines resulted in clinical and histological improvement of EAE in recipient animals induced with other myelin antigens, after intraparenchymal CNS migration of anti-Nogo cells. These data confirm the relevance of Nogo-66 as an antigen in EAE, as well as the efficacy of antigenspecific therapies based on the response against this protein.In conclusion, our results substantiate the therapeutic potential of myelin-encoding DNA vaccination, as well as the importance of encefalitogenic epitopes present in the Nogo-A protein for the pathophysiology of EAE and MS, with potential relevance for the creation of new antigen specific-therapies. The future development of these therapies may eventually lead to a degree of manipulation of the immune response that allows the effective treatment of autoimmune, inflammatory, demyelinating diseases, such as Multiple Sclerosis.

Massive shift in the pneumococcal nasopharyngeal flora after the 7-valent conjugate vaccine: epidemiological studies and testing pathogenic potential in animal models

Dissertation presented to obtain the PhD degree in Biology/Molecular Biology by Universidade Nova de Lisboa, Instituto de Tecnologia Química e Biológica

Pesquisa de factores de virulência em estirpes de Escherichia coli em resíduos de produção animal

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do grau de Mestre em Biotecnologia

Eu animal, a ordem do fílmico na consciencialização ecocrítica e na mudança de paradigma

Tese de doutoramento em Ciências da Comunicação, Cinema e Televisão

Epidemiological characterization, antimicrobial resistance and virulence mechanisms of human and animal streptococci

Dissertação para obtenção do Grau de Doutor em Biologia

Spatial analysis of suicide attack incidences in Kabul City

Dissertation submitted in partial fulfillment of the requirements for the Degree of Master of Science in Geospatial Technologies.

Avaliação da segurança química das carnes e produtos de origem animal produzidos em Portugal: análise dos resultados obtidos pelo plano nacional de controlo de resíduos para o triénio 2006-2008

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa, para obtenção do Grau de Mestre em Tecnologia e Segurança Alimentar

Nevirapine in an animal model of pre-diabetes: study of drug pharmacokinetic and its effects on fasting glycemia and insulin resistance

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Biotecnologia

Disclosing the caffeine dose to be administered that restores insulin sensitivity in prediabetes animal

The results discussed in this thesis originated the following communications in International and National congresses: Sacramento JF, Coelho JC, Melo BF, Guarino MP and Conde SV. (2014) Assessment of caffeine dose and time of administration required for resetting insulin sensitivity in high sucrose diet in rats. 50th Meeting of EASD (European Association for the study of Diabetes), 14-19 September, Vienna, Austria Coelho JC, Melo BF, Sacramento JF, Guarino MP and Conde SV (2014). Establishing the caffeine dose that chronically restores insulin sensitivity in animal model of prediabetes. Fundação Astrazeneca Innovate Competition, iMed conference 6.0®, 10-12 October, Lisboa, Portugal Also, during the last year I was involved in other ongoing projects that originated the following communications: Coelho JC, Melo BF, Sacramento JF, Ribeiro MJ, Guarino MP and Conde SV (2014). Are the effects of carotid sinus nerve resection on insulin sensitivity mediated by an increase in Glut4 expression in skeletal muscle?. XLIV Reunião Anual da Sociedade Portuguesa de Farmacologia, XXXII Reunião de Farmacologia Clínica e XIII Reunião de Toxicologia, 5-7 February, Coimbra, Portugal Sacramento JF, Rodrigues T, Coelho JC, Matafome P, Ribeiro MJ, Seiça RM, Guarino MP, Conde SV (2014). Elucidating the mechanism by which carotid sinus nerve resection restores insulin sensitivity in pre-diabetes animal models. International Society for Arterial Chemoreception (ISAC) XIX University of Leeds, 29th June - 3rd July, Leeds, United Kingdom

Brucelose na Província do Namibe, Angola, 2012 : prevalências humana (profissionais da pecuária) e animal, factores de risco, conhecimento e práticas

RESUMO - Enquadramento: A Brucelose é uma antropozoonose prevalente no Mundo e é uma das mais negligenciadas. A sua transmissão ao ser humano é directa e indirecta, e acontece por via de contacto com animal infectado, o consumo de leite e seus derivados não pasteurizados e a não observância de uso de equipamentos de protecção individual e colectiva, entre outros factores. O conhecimento da prevalência e incidência da brucelose animal e humana no Namibe, uma província de Angola, é muito escasso sendo poucos os estudos que evidenciam esta doença no seio dos profissionais da pecuária expostos: trabalhadores de matadouros, veterinários e criadores de gado. É assim pertinente, com base em estudos científicos específicos, caracterizar esta situação. Objectivos: Caracterizar os ambientes dos profissionais (matadouro, talhos e salas municipais de abate e explorações); estimar a seroprevalência da brucelose humana em profissionais da pecuária (trabalhadores de matadouros e criadores de gado bovino) na província do Namibe, Angola em 2012; determinar a associação da presença da brucelose humana com variáveis sócio-demográficas, de conhecimento, de práticas e de características das explorações; determinar a prevalência da Brucelose em animais e em explorações; caracterizar os factores associados à presença da Brucelose em explorações bovinas; caracterizar o conhecimento e práticas sobre a Brucelose dos profissionais da pecuária e analisar a relação entre as prevalências nas explorações (infectadas versus não infectadas) e nos criadores (infectados versus não infectados). Métodos e materiais: estudos observacional e transversal seroepidemiológico em 131 trabalhadores de talhos, salas de abate e matadouro e 192 criadores amostrados aleatoriamente em toda província do Namibe. Os dados foram obtidos através da colheita de sangue e da aplicação de um questionário. Os testes laboratoriais utilizados foram o Rosa de Bengala (RBT) e a Aglutinação Lenta em Tubos (SAT). O estudo de conhecimento foi principalmente centrado na pergunta “Já ouviu falar de Brucelose” e nas questões relativas ao nível de conhecimento e práticas (indicadores baseados nas percentagens de respostas correctas ou práticas adequadas) dos factores de risco da Brucelose. Também foram investigados 1344 animais (em 192 explorações) com recurso ao método de diagnóstico laboratorial RBT para análise de soro sanguíneo e, complementarmente, foi aplicado um questionário aos respectivos criadores. Em termos de análise estatística, para além da abordagem descritiva, foram utilizados os testes de Independência do Quiquadrado, Fisher, Teste não paramétrico de Mann-Whitney, Teste de correlação de Spearman. Adicionalmente, com base em modelos de regressão logística, foram determinados odds ratio e os respectivos intervalos de confiança utilizando um nível de significância de 5%. Resultados: os ambientes dos profissionais (matadouro, talhos e salas municipais de abate e explorações) não reuniram as condições higio-sanitárias definidas internacionalmente como adequadas. Nos profissionais a infecção geral ponderada da Brucelose foi de 15.56% (IC95% : 13.61-17.50), sendo 5.34% em trabalhadores e 16.66% (IC95% : 11.39-21.93) em criadores. A significância estatística foi observada entre a seroprevalência humana e a categoria (trabalhador e criador) (p< 0.001) e o nível de instrução (p= 0.032), início de actividade (p= 0.079) e local de serviço (p= 0.055). Num contexto multivariado o factor positivamente associado à brucelose em profissionais foi a categoria profissional (OR = 3.54, IC95%: 1.57-8.30, relativo aos criadores em relação a trabalhadores). As taxas gerais aparentes de prevalência em animais e explorações foram respectivamente de 14.96% (IC 95%, 12.97-17.19) e de 40.10% (IC 95%, 32.75-47.93). Encontrou-se uma correlação positiva moderada entre o número de animais infectados por exploração com a média do número de abortos na exploração = 0.531, p< 0.001). Em média os profissionais tiveram um conhecimento global muito insuficiente (16.1%), tendo os trabalhadores apresentado valores mais elevados que os criadores (20.2% e 13.8%), diferença não estatisticamente significativa (p= 0.170). As perguntas “o leite in natura é fervido antes do consumo humano?”, “contacto com materiais fetais animais?”, “contacto com aerossóis no local de trabalho?” e “já fez alguma vez o teste de Brucelose humana?” (relacionadas com práticas) e as perguntas “já ouviu falar da Brucelose?”, “Brucelose é doença zoonótica/só animal/só humana? e “como a Brucelose se transmite aos humanos?” apresentaram níveis médios de práticas adequadas e conhecimentos correctos inferiores a 20%. Nas explorações infectadas, 39% dos criadores foram positivos (infectados) e nas não infectadas apenas 1.7%. O risco de um criador ser infectado estando numa exploração infectada foi significativamente mais elevado (OR= 36, IC95%: 8.28-157.04). Conclusões: os ambientes dos profissionais (matadouros, salas municipais de abate e talhos e explorações) propiciam o risco à brucelose. O estudo permite aferir que a Brucelose humana em profissionais da pecuária e a Brucelose animal são prevalentes na província do Namibe. Os níveis de seroprevalência detectados são elevados comparandoos com outros encontrados em algumas localidades africanas que possuem condições similares às do Namibe. Perto de duas em cada cinco (40.10%) explorações estão infectadas por esta doença. O número de abortos (média) está claramente relacionado com as explorações infectadas. O conhecimento geral dos profissionais da pecuária sobre a Brucelose é muito insuficiente, tendo os trabalhadores mostrado um maior conhecimento em relação aos criadores, mas ambos com níveis alarmantes. Os criadores infectados estão relacionados com as explorações infectadas. Há necessidade de controlar a doença e de informar e educar os profissionais sobre a brucelose, sendo fundamental que os serviços provinciais de veterinária reforcem acções de divulgação e de fiscalização.