Avaliação de desempenho ambiental no sector público: estudo do sector da defesa

Dissertação apresentada para obtenção do Grau de Doutor em Engenharia do Ambiente pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia

Melanosome transfer between melanocytes and keratinocytes

RESUMO: A pele é o maior órgão do corpo humano e a sua pigmentação é essencial para a sua coloração e proteção contra os efeitos nocivos da radiação ultravioleta (UV). A pigmentação da pele resulta essencialmente de três processos: a síntese e o armazenamento de melanina pelos melanócitos, em organelos especializados denominados melanossomas; o transporte dos melanossomas dentro dos melanócitos; e finalmente, a transferência dos melanossomas para os queratinócitos adjacentes. Nos queratinócitos, a melanina migra para a região perinuclear apical da célula para formar um escudo protetor,responsável pela proteção do DNA dos danos causados pela radiação UV. Os melanócitos estão localizados na camada basal da epiderme e contactam com 30-40 queratinócitos. Em conjunto, estas células formam a “unidade melano-epidérmica”. Apesar dos processos de síntese e transporte de melanina nos melanócitos estarem bastante bem caracterizados, os mecanismos moleculares subjacentes à transferência inter-celular de melanina são menos conhecidos e ainda controversos. Dados preliminares obtidos pelo nosso grupo, que se basearam na observação de amostras de pele humana por microscopia electrónica, indicam que a forma predominante de transferência de melanina na epiderme consiste na exocitose dos melanossomas pelos melanócitos e subsequente endocitose da melanina por queratinócitos. Para além disso sabe-se que as proteínas Rab, que controlam o tráfego membranar, estão envolvidas em várias etapas de pigmentação da pele, nomeadamente na biogénese e no transporte de melanina. Assim, dado o seu papel fundamental nestes processos, questionámo-nos sobre o seu envolvimento na transferência de melanina. Com este trabalho, propomo-nos a expandir o conhecimento atual sobre a transferência de melanina na pele, através do estudo detalhado dos seus mecanismos moleculares, identificando as proteínas Rab que regulam o processo. Pretendemos também confirmar o modelo de exo/endocitose como sendo o mecanismo principal de transferência de melanina. Primeiro, explorámos a regulação da secreção de melanina pelos melanócitos e analisámos o papel de proteínas Rab neste processo. Os resultados foram obtidos recorrendo a um método in vitro, desenvolvido previamente no laboratório, que avalia a quantidade de melanina segregada para o meio de cultura por espectrofotometria, e ainda por microscopia, contando o número de melanossomas transferidos para os queratinócitos. Através de co-culturas de melanócitos e queratinócitos, verificou-se que os queratinócitos estimulam a libertação de melanina dos melanócitos para o meio extra-celular, bem como a sua transferência para os queratinócitos. Além disso, a proteína Rab11b foi identificada como um regulador da exocitose de melanina e da sua transferência para os queratinócitos. De facto, a diminuição da expressão de Rab11b em melanócitos provocou a redução da secreção de melanina estimulada por queratinócitos, bem como da transferência desta. Em segundo lugar, para complementar o nosso estudo, centrámos a nossa investigação na internalização de melanina por queratinócitos. Especificamente, usando uma biblioteca de siRNA, explorámos o envolvimento de proteínas Rab na captação de melanina por queratinócitos. Como primeira abordagem, usámos esferas fluorescentes como substituto de melanina, avaliando os resultados por citometria de fluxo. No entanto, este método revelou-se ineficaz uma vez que a internalização destas esferas é independente do recetor PAR-2 (recetor 2 ativado por protease), que foi previamente descrito como essencial na captação de melanina por queratinócitos Posteriormente, foi desenvolvido um novo protocolo de endocitose baseado em microscopia, usando melanossomas sem a membrana envolvente (melanocores) purificados do meio de cultura de melanócitos, incluindo um programa informático especialmente desenhado para realizar uma análise semi-automatizada. Após internalização, os melanocores acumulam-se na região perinuclear dos queratinócitos, em estruturas que se assemelham ao escudo supranuclear observado na pele humana. Seguidamente, o envolvimento do recetor PAR-2 na captação de melanocores por queratinócitos foi confirmado, utilizando o novo protocolo de endocitose desenvolvido. Para além disso, a necessidade de quatro proteínas Rab foi identificada na internalização de melanocores por queratinócitos. A redução da expressão de Rab1a ou Rab5b em queratinócitos diminuiu significativamente o nível de internalização de melanocores, enquanto o silenciamento da expressão de Rab2a ou Rab14 aumentou a quantidade de melanocores internalizados por estas células. Em conclusão, os resultados apresentados corroboram as observações anteriores, obtidas em amostras de pele humana, e sugerem que o mecanismo de transferência predominante é a exocitose de melanina pelos melanócitos, induzida por queratinócitos, seguida por endocitose pelos queratinócitos. A pigmentação da pele tem implicações tanto ao nível da cosmética, como ao nível médico, relacionadas com foto-envelhecimento e com doenças pigmentares. Assim sendo, ao esclarecer quais os mecanismos moleculares que regulam a transferência de melanina na pele, este trabalho pode conduzir ao desenvolvimento de novas estratégias para modular a pigmentação da pele.----------------ABSTRACT: Skin pigmentation is achieved through the highly regulated production of the pigment melanin in specialized organelles, termed melanosomes within melanocytes. These are transported from their site of synthesis to the melanocyte periphery before being transferred to keratinocytes where melanin forms a supra-nuclear cap to protect the DNA from UVinduced damage. Together, melanocytes and keratinocytes form a functional complex, termed “epidermal-melanin unit”, that confers color and photoprotective properties to the skin. Skin pigmentation requires three processes: the biogenesis of melanin; its intracelular transport within the melanocyte to the cell periphery; and the melanin transfer to keratinocytes. The first two processes have been extensively characterized. However, despite significant advances that have been made over the past few years, the mechanisms underlying inter-cellular transfer of pigment from melanocytes to keratinocytes remain controversial.Preliminary studies from our group using electron microscopy and human skin samples found evidence for a mechanism of coupled exocytosis-endocytosis. Rab GTPases are master regulators of intracellular trafficking and have already been implicated in several steps of skin pigmentation. Thus, we proposed to explore and characterize the molecular mechanisms of melanin transfer and the role of Rab GTPases in this process. Moreover, we investigated whether the exo/endocytosis model is the main mechanism of melanin transfer. We first focused on melanin exocytosis by melanocytes. Then, we started to investigate the key regulatory Rab proteins involved in this step by establishing an in vitro tissue culture model of melanin secretion. Using co-cultures of melanocytes and keratinocytes, we found that keratinocytes stimulate melanin release and transfer. Moreover, depletion of Rab11b decreases keratinocyte-induced melanin exocytosis by melanocytes. In order to determine whether melanin exocytosis is a predominant mechanism of melanin transfer, the amount of melanin transferred to keratinocytes was then assayed in conditions where melanin exocytosis was inhibited. Indeed, Rab11b depletion resulted in a significant decrease in melanin uptake by keratinocytes. Taken together, these observations suggest that Rab11b mediates melanosome exocytosis from melanocytes and transfer to keratinocytes. To complement and extend our study, we of melanin by keratinocytes. Thus, we aimed to explore the effect of depleting Rab GTPases on melanin uptake and trafficking within keratinocytes. As a first approach, we used fluorescent microspheres as a melanin surrogate. However, the uptake of microspheres was observed to be independent of PAR-2, a receptor that is required for melanin uptakecentred our attention in the internalization of melanin by keratinocytes. Thus, we aimed to explore the effect of depleting Rab GTPases on melanin uptake and trafficking within keratinocytes. As a first approach, we used fluorescent microspheres as a melanin surrogate. However, the uptake of microspheres was observed to be independent of PAR-2, a receptor that is required for melanin uptake.Therefore, we concluded that microspheres were uptaken by keratinocytes through a different pathway than melanin. Subsequently, we developed a microscopy-based endocytosis assay using purified melanocores (melanosomes lacking the limiting membrane) from melanocytes, including a program to perform a semi-automated analysis. Melanocores are taken up by keratinocytes and accumulate in structures in the perinuclear area that resemble the physiological supranuclear cap observed in human skin. We then confirmed the involvement of PAR-2 receptor in the uptake of melanocores by keratinocytes, using the newly developed assay. Furthermore, we identified the role of four Rab GTPases on the uptake of melanocores by keratinocytes. Depletion of Rab1a and Rab5b from keratinocytes significantly reduced the uptake of melanocores, whereas Rab2a, and Rab14 silencing increased the amount the melanocores internalized by XB2 keratinocytes. In conclusion, we present evidence supporting keratinocyte-inducedmelanosome exocytosis from melanocytes, followed by endocytosis of the melanin core by keratinocytes as the predominant mechanism of melanin transfer in skin. Although advances have been made, there is a need for more effective and safer therapies directed at pigmentation disorders and also treatments for cosmetic applications. Hence, the understanding of the above mechanisms of skin pigmentation will lead to a greater appreciation of the molecular machinery underlying human skin pigmentation and could interest the pharmaceutical and cosmetic industries.

Direito a ser esquecido na internet

With the recent technological development, we have been witnessing a progressive loss of control over our personal information. Whether it is the speed in which it spreads over the internet or the permanent storage of information on cloud services, the means by which our personal information escapes our control are vast. Inevitably, this situation allowed serious violations of personal rights. The necessity to reform the European policy for protection of personal information is emerging, in order to adapt to the technological era we live in. Granting individuals the ability to delete their personal information, mainly the information which is available on the Internet, is the best solution for those whose rights have been violated. However, once supposedly deleted from the website the information is still shown in search engines. In this context, “the right to be forgotten in the internet” is invoked. Its implementation will result in the possibility for any person to delete and stop its personal information from being spread through the internet in any way, especially through search engines directories. This way we will have a more comprehensive control over our personal information in two ways: firstly, by allowing individuals to completely delete their information from any website and cloud service and secondly by limiting access of search engines to the information. This way, it could be said that a new and catchier term has been found for an “old” right.

O incumprimento do contrato de crédito ao consumo pelo consumidor

Consumer relations, established between the Consumer and the Creditor, which carry a consequent inequality of contractual positioning between the parties, have been pushing the legislator to adopt more rigid regulations with regard to lending for the purchase of goods or services of consum issues. In this sense, the Decree-Law 359/91 was approved, meanwhile repealed by the Decree-Law 133/2009, which regulates the consumer credit agreement’s regime in the portuguese legal system. Through this contract, the financier makes available to the consumer a certain amount of money, which the consumer must repay, plus the respective remuneration (interest) and other charges, according to a refund plan agreed by the parties. The consumer will be in delay if he breaches this stipulation. In case of default, the creditor, notwithstanding, can choose to wait for the performance by the debtor, promote the loss of benefit of the term or the termination of the contract. From the outset it would seem that, in one way or another, the financier, by imposing a forced shortening of the contract duration initially agreed, will lose the right to remuneration for the provision of capital agreed, but not verified. Nevertheless, unlike presently, the previous regime allowed the parties to rule otherwise, being permitted to agree to the payment of interest of outstanding installments. On the other hand, in the consumer credit contract the principle of freedom of contractual provision of the parties is strongly mitigated by the special legislation, which prevents the waiver of rights by the consumer, and by the regime of general contractual terms, which restricts the freedom of the financier to stipulate the contractual content freely and the freedom of the consumer to negotiate. For all these reasons, associated with the growing need of credit resource to satisfy their needs of consumption, it is confirm the relevance of legislative intervention on consumers protection in the context of hiring credit.

O incumprimento do contrato de crédito ao consumo pelo consumidor

Consumer relations, established between the Consumer and the Creditor, which carry a consequent inequality of contractual positioning between the parties, have been pushing the legislator to adopt more rigid regulations with regard to lending for the purchase of goods or services of consum issues. In this sense, the Decree-Law 359/91 was approved, meanwhile repealed by the Decree-Law 133/2009, which regulates the consumer credit agreement’s regime in the portuguese legal system. Through this contract, the financier makes available to the consumer a certain amount of money, which the consumer must repay, plus the respective remuneration (interest) and other charges, according to a refund plan agreed by the parties. The consumer will be in delay if he breaches this stipulation. In case of default, the creditor, notwithstanding, can choose to wait for the performance by the debtor, promote the loss of benefit of the term or the termination of the contract. From the outset it would seem that, in one way or another, the financier, by imposing a forced shortening of the contract duration initially agreed, will lose the right to remuneration for the provision of capital agreed, but not verified. Nevertheless, unlike presently, the previous regime allowed the parties to rule otherwise, being permitted to agree to the payment of interest of outstanding installments. On the other hand, in the consumer credit contract the principle of freedom of contractual provision of the parties is strongly mitigated by the special legislation, which prevents the waiver of rights by the consumer, and by the regime of general contractual terms, which restricts the freedom of the financier to stipulate the contractual content freely and the freedom of the consumer to negotiate. For all these reasons, associated with the growing need of credit resource to satisfy their needs of consumption, it is confirm the relevance of legislative intervention on consumers protection in the context of hiring credit.

Hospital-empresa : crónica de um nascimento retardado : Políticas de saúde : Em foco

RESUMO - A gestão empresarial dos hospitais é uma velha aspiração do sistema e dos profissionais da saúde em Portugal. Já o Estatuto Hospitalar de 1968 previa a organização e a gestão dos hospitais «em termos de gestão empresarial». A Lei de Bases da Saúde, de 1990, relembrava que a administração das unidades de saúde deveria obedecer a «regras de gestão empresarial». O Hospital Fernando da Fonseca, criado desde 1991, foi objecto de concessão de gestão por contrato, precedendo concurso público, a uma entidade privada, em 1995. Em 1997, o relatório do Grupo de Trabalho sobre o Estatuto Jurídico do Hospital recomendava a adopção da figura de instituto público com natureza empresarial, adequada autonomia de gestão e forte responsabilidade, podendo regular-se, em alguns domínios, por normas de direito privado. Em 1998 foi criado o Hospital de São Sebastião, em Santa Maria da Feira, com formas inovadoras de gestão, utilizando meios de gestão maleáveis. Em 1999 foi criada a Unidade Local de Saúde de Matosinhos, englobando não apenas o Hospital de Pedro Hispano, naquela cidade, mas também os quatro centros de saúde da sua área de atracção. Em 2001 foi criado o Hospital do Barlavento Algarvio, em moldes semelhantes aos do Hospital de São Sebastião. Os restantes hospitais públicos mantiveram a estrutura e regras de funcionamento convencionais. Observa-se que o modelo de gestão convencional do hospital público tem hoje consequências desfavoráveis para os cidadãos, para os profissionais que nele trabalham e também para o sistema de saúde no seu conjunto. Em 2002, uma nova lei alterou disposições da Lei de Bases da Saúde de 1990 e aprovou um novo regime jurídico de gestão hospitalar. De acordo com ele, a rede de prestação de cuidados de saúde passou a integrar vários modelos de hospitais: hospitais SPA, hospitais EPE, hospitais SA, clínicas privadas com ou sem nome de hospital, instituições e serviços geridos por entidades públicas ou privadas, mediante contrato de gestão e hospitais PPP. Analisam-se os ganhos introduzidos pelo modelo inovador de hospital SA, no que respeita ao estatuto, dotação de capital, poderes especiais, regras de controlo financeiro, regimes laborais, órgãos sociais, instrumentos de gestão e direcção técnica. Finalmente, antecipa-se um quadro analítico de oportunidades e riscos sobre este modelo. As críticas têm-se concentrado sobre a estratégia de mudança e sobre o mecanismo de escolha dos dirigentes e das respectivas chefias intermédias. Em relação à estratégia, conclui-se ser a questão mais empírica do que conceptual. Em relação à forma de identificação dos dirigentes, recomenda-se o acompanhamento crítico da experiência, salientando-se, a par do que ela pode trazer de positivo, os riscos de partidarização e instabilidade.