Schistosomose em modelo murino: estudo sobre granuloma hepático causado por ovos de Schistosoma mansoni

A schistosomose é uma doença parasitária que afecta cerca de 200 milhões de pessoas, com alta prevalência nos trópicos e que origina um grave problema de saúde pública. Ao longo da infecção, o sistema imunitário tenta de várias formas combater a presença do parasita. Inicialmente ocorre uma resposta imune mediada por células do tipo Th1, com o progresso da infecção, a resposta é substituída por uma resposta do tipo Th2 induzida durante a formação de granulomas. Este surge como resposta à presença de produtos tóxicos libertados pelos ovos do parasita retido nos tecidos. O fígado é o principal alvo do depósito de ovos, sofrendo alterações fisiopatológicas, e histológicas. O Mus musculus tem sido muito utilizados na infecção experimental por Schistosoma mansoni, para melhor se conhecer o papel da resposta imunitária na formação de granulomas hepáticos. No decorrer da infecção o granuloma sofre alterações desencadeadas pelas citocinas que o sistema imunitário produz. Estas alterações dividem-se em cinco fases: reacção inicial, exsudativa, exsudativa-produtiva, produtiva e involutiva granuloma. O presente trabalho, estudou as alterações sofridas pelo granuloma hepático (quantidade, dimensão e fase do granuloma), em três diferentes períodos de infecção (55, 90 e 125 dias) no modelo animal Mus musculus infectado com Schistosoma. mansoni, estirpe SmBh distribuídos por três grupos experimentais com diferente número de cercárias (50, 80, e 100). Verificou-se que ao longo da infecção a quantidade de granulomas aumenta, as dimensões têm uma tendência inicial para aumentar mas a partir dos 90 dias após a exposição sofrem uma diminuição. No grupo experimental com maior intensidade de infecção inicial a diminuição deu-se mais cedo. Em relação às fases de desenvolvimento do granuloma este sofre alterações ao longo de toda a infecção. Assim, aos 55 dias predomina a fase exsudativa, aos 90 todos os grupos apresentam maior percentagem de granulomas na fase produtiva e por fim aos 125 dias prevalece a fase involutiva. Todos estes resultados sugerem que a caracterização do granuloma nas diferentes fases de infecção pode depender do número de cercárias da exposição.

Thomsen-Friedenreich antigens in bladder cancer: evaluation of their prognostic value

RESUMO: Introdução. O cancro de bexiga é uma patologia comum que representa o 6° e o 5° cancro mais incidente em Portugal e na Itália, respetivamente. Em mais de metade dos casos ocorre reincidência durante o primeiro ano, requerendo acompanhamento clínico ao longo da vida. A instilação intravesical de Bacillus Calmette-Guérin (BCG) (uma estirpe atenuada do Mycobacterium bovis) representa uma imunoterapia eficaz no combate ao cancro de bexiga, no entanto, muitos aspetos da interação de BCG com as células tumorais bem como com as células do sistema imunitário permanecem por desvendar. As células tumorais de bexiga expressam frequentemente as formas sialiladas dos antigénios de Thomsen-Friedenreich (TF), i.e., sialil-T (sT) e sialil-Tn (sTn). Contudo ainda se desconhece o significado da sua expressão na malignidade tumoral e se afeta a eficácia da terapêutica BCG. Objetivo do estudo. Investigar o papel dos antigénios sT e sTn no fenótipo maligno de células de cancro de bexiga bem como na resposta mediada pelo sistema imunitário à terapia com BCG. Metodologia. Para tal, foram utilizadas as linhas celulares de cancro da bexiga HT1376 e MCR, geneticamente modificadas por transdução com vetores codificantes para as sialiltransferases ST3GAL1 ou ST6GALNAC1, de forma a expressar homogeneamente os antigénios sT ou sTn respetivamente. Estes modelos celulares foram estudados após confronto com BCG. O nível de BCG internalizado foi avaliado por citometria de fluxo. O perfil global de expressão genética dos modelos celulares antes e após incubação com BCG foi analisado pela tecnologia de microarray. O perfil de citocinas secretadas pelos modelos celulares após incubação com BCG, bem como de macrófagos estimulados pelo secretoma de células de cancro de bexiga que por sua vez foram estimuladas previamente por BCG, foi estudado pelo sistema multiplex de “imuno-esferas”. Resultados. A análise do transcritoma dos modelos celulares revelou que grupos de genes envolvidos em funções específicas foram modulados em paralelo nos dois modelos celulares, após transdução, independentemente da sialiltransferase expressa. Ou seja, em células que expressavam a sialiltransferase ST3GAL1 ou ST6GALNAC1, os genes envolvidos na regulação da segregação cromossómica e na reparação do DNA foram consistentemente regulados negativamente. Genes descritos na literatura como marcadores para o cancro de bexiga foram também modulados. A incubação com BCG resultou numa tendência ao aumento da expressão de genes relevantes na preservação e estabilidade genómica e menor malignidade, no entanto, apenas em células que expressavam sT ou sTn. Entre as dez citocinas testadas, apenas a IL-6 e IL-8 foram expressas pelas linhas celulares de cancro da bexiga, com indução destas após estimulação com BCG, e principalmente em células que expressavam ST3GAL1 ou ST6GALNAC1. Em macrófagos, citocinas inflamatórias, tais como IL-1β, IL-6 e TNFα, e a citocina anti-inflamatória IL-10, foram induzidas apenas pelo secretoma de células de cancro da bexiga confrontadas com BCG, com maior relevância quando estas expressavam ST3GAL1 ou ST6GALNAC1, prevendo a estimulação de macrófagos semelhantes aos de tipo M1 e uma melhor resposta à terapia com BCG. Conclusões. O efeito geral da expressão destas sialiltransferases e dos produtos enzimáticos sT ou sTn nas células de cancro de bexiga conduz a um fenótipo de maior malignidade. Contudo, a maior avidez de estas na produção de citocinas inflamatórias após confronto com BCG, bem como a maior capacidade de estimulação de macrófagos, predirá uma resposta à terapia com BCG mais eficaz em tumores que expressem os antigénios de TF sialilados. Tais conclusões são totalmente concordantes com os nossos mais recentes dados clínicos obtidos em colaboração, que mostram que em doentes com cancro de bexiga que expressam sTn respondem melhor a terapia BCG. ----------ABSTRACT: Background. Bladder cancer is a common malignancy representing the 6th and the 5th most incident cancer in Portugal and in Italy, respectively. More than half of the cases relapse within one year, requiring though a lifelong follow-up. Intravesical instillation of Bacillus Calmette-Guérin (BCG) (an attenuated strain of Mycobacterium bovis) represents an effective immunotherapy of bladder cancer, although many aspects of the interaction of BCG with cancer cells and host immune cells remain obscure. Bladder cancer cells often express the sialylated forms of the Thomsen-Friedenreich (TF), i.e., sialil-T (sT) e sialil-Tn (sTn). However, it’s still unknown the sense of such expression in tumour malignancy and in the BCG therapy efficacy. Aim of the study. To investigate the role of the sT and sTn antigens on the malignant phenotype of bladder cancer cells and the immune mediated response to BCG therapy. Experimental. We have utilized populations of the bladder cancer cell lines HT1376 and MCR, genetically modified by transduction with the sialyltransferases ST3GAL1 or ST6GALNAC1 to express homogeneously sT or sTn antigens. The level of BCG internalized was assessed by flow cytometry. The whole gene expression profile of BCG-challenged or unchallenged bladder cancer cell lines was studied by microarray technology. The profile of cytokines secreted by BCG-challenged bladder cancer cells and that of macrophages challenged by the secretome of BCG-challenged bladder cancer cells was studied by multiplex immune-beads assay. Results. Transcriptome analysis of the sialyltransferase-transduced cells revealed that groups of genes involved in specific functions were regulated in parallel in the two cell lines, regardless the sialyltransferase expressed. Namely, in sialyltransferase-expressing cells, genes involved in the proper chromosomal segregation and in the DNA repair were consistently down-regulated, while genes reported in literature as markers for bladder cancer were modulated. BCG-challenging induced a tendency to up-regulation of the genes preserving genomic stability and reducing malignancy, but only in cells expressing either sT or sTn. Among the ten cytokines tested, only IL-6 and IL-8 were expressed by bladder cancer cell lines and up-regulated by BCG-challenging, mainly in sialyltransferases-expressing cells. In macrophages, inflammatory cytokines, such as IL-1β, IL-6 and TNFα, and the antinflammatory IL-10 were induced only by the secretome of BCG-challenged bladder cancer cells, particularly when expressing either sialyltransferase, predicting the stimulation of M1-like macrophages and a better response to BCG therapy. Conclusions. The general effect of the expression of the two sialyltransferases and their products in the bladder cancer cells is toward a more malignant phenotype. However, the stronger ability of sialyltransferase expressing cells to produce inflammatory cytokines upon BCG-challenging and to stimulate macrophages predicts a more effective response to BCG in tumours expressing the sialylated TF antigens. This is fully consistent with our recent clinical data obtained in collaboration, showing that patients with bladder cancer expressing sTn respond better to BCG therapy.

The role of α2,3- and α2,6-sialylation

RESUMO: Os glicoconjugados que decoram a superfície celular e os lípidos e proteínas secretados ocupam o ponto de encontro onde normalmente ocorrem interacções críticas homólogas (hospedeiro-hospedeiro) e heterólogas (hospedeiro-patogénio). Apesar de ser largamente aceite que os glicanos são parte integrante do processo de imunidade, continua a não ser claro qual o papel que os glicanos, em toda a sua diversidade, tomam no quadro geral da imunidade. Os glicanos, que são frequentemente terminados por resíduos de ácido siálico, podem ser alterados por factores externos, tais como patogénios, ou por acontecimentos fisiológicos celulares específicos. Normalmente em posição terminal, as glico-estruturas que contêm ácido siálico assumem um papel fundamental numa quantidade substancial de receptores imunes envolvidos na adesividade e tráfico celular, tal como as Selectinas e as Siglecs, das quais se sabe apresentarem uma relevante função imune. À altura do início desta tese, era sabido que os ácidos siálicos expressos à superfície das células poderiam modular mecanismos importantes nas respostas imunes adaptativas. Considerando a posição de charneira que as células dendríticas (DCs) ocupam na transição da resposta imune inata para a adaptativa, antecipámos que os ácidos siálicos poderiam também modular mecanismos relevantes nas DCs humanas. As DCs têm uma função muito relevante na verificação e captura antigénica, migração para os gânglios linfáticos e apresentação antigénica aos linfócitos, uma sequência de funções que conduz, em ultima instância, à indução da resposta inata adaptativa. Considerando estas premissas, a nossa hipótese principal foi que os ácidos siálicos podem influenciar funções relevantes das DCs, tais como captura de antigénios, maturação, migração para os gânglios linfáticos e apresentação antigénica às células Para testar esta hipótese, dividimos o trabalho em quatro partes: 1) Analisámos os glicanos sialilados de superfície, expressos durante a diferenciação de monócitos humanos em DCs (moDCs). Os nossos dados mostraram que a expressão dos glicanos com ligações em O (O-glicanos) e sialilados em α2,3, assim como glicanos com ligações em N (N-glicanos) sialilados em α2,6 e α2,3 aumentou durante o processo de diferenciação das moDCs. Contribuindo para esta nova configuração glicosídica, três sialiltransferases (STs) poderão estar envolvidas: a ST6Gal-1 correlaciona-se com a expressão aumentada de N-glicanos sialilados em α2,6; a ST3Gal-1 contribui para a sialilação em α2,3 de O-glicanos, em especial de antigénios T; e a ST3Gal-4 poderá ser responsável pelo aumento de N-glicanos sialilados em α2,3. Após estímulo e consequente maturação das moDCs, ambos os níveis de expressão génica de ST6Gal-1 e ST3Gal-4 são negativamente modificados sendo, também, que a expressão de ST3Gal-1 varia consoante o estímulo. 2) Estudámos posteriormente as consequências da modulação dos ácidos siálicos de superfície nas funções das DCs. Observámos que a remoção dos ácidos siálicos de superfície diminui significativamente a capacidade de macropinocitose e endocitose mediada por receptores nas moDCs. Em contrapartida, o tratamento com sialidase aumentou significativamente a capacidade das moDCs para fagocitar Escherichia coli. Determinou-se também que este mecanismo requer a existência de ácido siálico presente nas E. coli indicando um mecanismo de interacção hospedeiro-patogénio dependente de ácido siálico em ambas as partes envolvidas. As moDCs tratadas com sialidase também apresentam um nível superior de expressão de moléculas de MHC e moléculas co-estimulatórias, sugerindo um fenótipo celular mais maduro. Recorrendo ao modelo de ratinho, utilizaram-se DCs derivadas de células da medula (BMDCs) de ratinhos deficientes em ST3Gal-1 e ST6Gal-1. Estes ensaios revelaram que quer a endocitose quer a maturação são influenciadas por modificações 37 nos glicanos sialilados em α2,3 ou α2,6. A detecção e quantificação de proteínas Nglicosiladas e sialiladas em α2,6 apontou para um potencial envolvimento de integrinas β2 nestes mecanismos. 3) O efeito da sialilação em α2,6 na migração das DCs para os gânglios linfáticos foi também analisado. Observámos que BMDCs deficientes para ST6Gal-1 apresentam uma redução de cerca de 50% nos níveis de migração das DCs para os gânglios linfáticos, tal como aferido em ensaios de inflamação in situ e estudos de transferência adoptiva de células. Uma redução dos níveis deste tipo de migração foi também observada quando BMDCs nativas foram transferidas para ratinhos receptores deficientes em ST6Gal-1. São, contudo, necessários mais ensaios de forma a identificar as moléculas envolvidas neste processo. 4) Por último, analisámos o impacto da sialilação na estimulação antigénica das DCs às células T. Assim, concluiu-se que moDCs tratadas com sialidase apresentam um nível de expressão superior de IL-12, TNF-ɑ, IL-6 e IL-10, e activação do factor de transcrição nuclear kappa B (NF-κB). As DCs tratadas com sialidase induziram uma maior proliferação nas células T, com expressão correspondente de interferão-γ. Este dado sugere que a remoção de ácidos siálicos de superfície contribui para o desenvolvimento de uma resposta pro-inflamatória do tipo 1 por células T auxiliares (resposta Th1). Considerando estes dados no seu todo, concluímos que o ácido siálico tem um papel marcante nas funções imunes das DCs. Alterações à concentração de ácido siálico à superfície das células podem alterar a endocitose/fagocitose, maturação, migração para os tecidos e gânglios linfáticos e capacidade estimulatória para com as células T. Complementando estes dados, as ligações glicosídicas de ácidos siálicos criados por ST6Gal-1 e ST3Gal-1 são funcionalmente relevantes. A modulação programada da sialilação do glicocálice, mediada por sialidases individuais ou sialiltransferases é uma possibilidade aceitável para a melhoria da fagocitose por DCs e da sua potência imunológica. Este facto tem um significado particular para imunoterapias baseadas em DCs, podendo provar-se decisivo para a sua eficiência e aplicabilidade num futuro muito próximo.-------------------------------ABSTRACT: Glycans decorating cell surface and secreted proteins and lipids occupy the junction where critical host–host and host-pathogen interactions occur. In spite of the wide acceptance that glycans are centrally implicated in immunity, exactly how glycans and their variety and variability contribute to the overall immune response remains poorly defined. Glycans, frequently terminated by sialic acid residues, may be modified by external factors such as pathogens or upon specific physiological cellular events. The terminal, privileged positions of sialic acid-modified structures makes them key, fundamental determinants for a number of immune receptors with known involvement in cellular adhesiveness and cell trafficking, such as Selectins and Siglecs, with known relevant immune functions. At the time this thesis was initiated, it was established that sialic acids expressed at cell surface could modulate important mechanisms of the adaptive immune responses. Given the key role of dendritic cells (DCs) in the transition from innate to the adaptive immune responses, we anticipated that sialic acids could also modulate important mechanisms of human DCs. DCs have a relevant role in antigen screening and uptake, migration to lymph nodes and antigen presentation to lymphocytes, ultimately triggering the adaptive immune response. Therefore, our primary hypothesis was that sialic acids may modulate DC functions, such as antigen uptake, maturation, homing to lymph nodes and antigen presentation to T cells. To test this hypothesis, we divided our work in four parts. 1) Surface sialylated glycans expressed during differentiation from human monocytes to DCs (moDCs) were analyzed. Our data showed that α2,3-sialylated O-glycans and α2,6- and α2,3-sialylated N-glycans expression increased during moDC differentiation. Three main sialyltransferases (STs) are committed with this new glycan configuration: ST6Gal- 1 correlates with the increased expression of α2,6-sialylated N-glycans; ST3Gal-1 32 contributes for the α2,3-sialylation of O-glycans, especially T antigens; and ST3Gal-4 may contribute for the increased α2,3-sialylated N-glycans. Upon moDC maturation, ST6Gal-1 and ST3Gal-4 are downregulated and ST3Gal-1 is altered in a stimulus dependent manner. 2) We subsequently analyzed the consequences of the modulation of cell surface sialic acids in DC functions. We observed that removing surface sialic acid by sialidase significantly decreased the capacity of moDCs to micropinocytose and receptormediated endocytose. In contrast, treatment with a sialidase significantly improved the capacity of moDCs to phagocytose Escherichia coli. The improved phagocytosis mechanism required E. coli sialic acids, indicating a mechanism of host–pathogen interaction dependent on sialic acid moieties. Sialidase-treated moDCs have increased expression of MHC and co-stimulatory molecules, suggesting a more mature phenotype. Experiments using mouse bone marrow-derived DCs (BMDCs) from ST3Gal-1-/- and ST6Gal-1-/- strains indicated that endocytosis and maturation are influenced by changes in either α2,3 or α2,6-sialylated glycans. The analysis of α2,6-sialylated, N-glycosylated proteins, strongly suggested the potential involvement of β2 integrins, underlying these mechanisms. 3) The effect of α2,6-sialylation in DC homing to lymph nodes was also analyzed. We observed that BMDCs deficient for ST6Gal-1 have an almost 50% reduction in DC homing, as assayed by in situ inflammation and adoptive transfer studies. A reduction in DC homing was also observed when wild type BMDCs were transferred into ST6Gal-1-/- recipient mice. Further investigations are necessary to identify the molecules involved in this process. 4) Finally, we also analyzed the impact of sialylation on DCs ability to prime T cells. Sialidase-treated moDCs show increased gene expression of IL-12, TNF-α, IL-6 and IL- 10 cytokines, and activation of the transcription factor nuclear factor-κB. Sialidase33 treated DCs induced a higher proliferative response of T cells with concomitant higher expression of interferon-γ, suggesting that the clearance of cell surface sialic acids contributes to the development of a T helper type 1 proinflammatory response. Together, our data strongly support sialic acid’s relevance in DC immune functions. Alterations of cell surface sialic acid content can alter the endocytosis/phagocytosis, maturation, migration/homing and the ability for T cell priming in human DCs. Moreover, sialic acid linkages created by ST6Gal-1 and ST3Gal-1 are functionally relevant. The engineering of cell surface sialylation, mediated by individual sialidases or sialyltransferases is a likely possibility to fine tune DC phagocytosis and immunological potency, with particular significance to DC-based therapies.

Terapia celular com células mesenquimais por via intracoronária: contributos do estudo invasivo da microcirculação coronária

RESUMO: Introdução - A utilização de células e das suas propriedades para o tratamento das doenças cardiovasculares, é uma promessa para o futuro e talvez a única forma de ultrapassar algumas das insuficiências das terapêuticas atuais. A via de entrega das células mais utilizada na investigação tem sido a intracoronária, ganhando a microcirculação especial relevância, por ser onde ocorre a primeira interação com o tecido nativo. As células estaminais mesenquimais (CEM) têm propriedades que as tornam particularmente aptas para a Terapia Celular, mas as suas dimensões, superiores ao diâmetro dos capilares, tem motivado controvérsia quanto à sua entrega intracoronária. A cardiologia de intervenção tem atualmente técnicas que permitem a avaliação em tempo real e in vivo do estado da microcirculação coronária. A determinação do índice da resistência da microcirculação (IRM) fornece informação sobre a circulação dos pequenos vasos, de forma independente da circulação coronária e do estado hemodinâmico, mas a aplicabilidade clínica deste conhecimento encontra-se ainda por definir. Objectivos Esclarecer o potencial do IRM no estudo dos efeitos do transplante de CEM por via intracoronária. População e Métodos . Estudo pré-clínico com modelo animal (suíno) desenvolvido em 3 fases. Na Primeira Fase foram utilizados 8 animais saudáveis para estudar e validar a técnica de determinação de estudo da microcirculação. Efetuou-se a determinação do IRM com duas doses diferentes de papaverina para a indução da resposta hiperémica máxima (5 e 10 mg) e após a disfunção da microcirculação com injeção intracoronária de microesferas de embozene com 40 μm de diâmetro. Na Segunda Fase foram utilizados 18 animais saudáveis, randomizados em grupo controlo e grupo recetor de 30 x 106 CEM por via intracoronária. Foram avaliados de forma cega o IRM, a pressão aórtica, o fluxo coronário epicárdico e a ocorrência de alterações electrocardiográficas. Na Terceira Fase foram utilizados 18 animais, com enfarte agudo do miocárdio provocado (EAM), randomizados em grupo controlo, grupo recetor de CEM expandidas de forma convencional e grupo recetor de CEM expandidas com metodologia inovadora e de menores dimensões. Foi realizada uma exploração da dose/efeito com infusão faseada de 10 x 106, 15 x 106 e 20 x 106 CEM, com determinação do IRM, da pressão aórtica, do fluxo coronário epicárdico e da ocorrência de alterações eletrocardiográficas. Quatro semanas após a entrega das células foi novamente avaliado o IRM e foi efetuado o estudo anatomopatológico dos animais na procura de evidência de neoangiogénese e de regeneração miocárdica, ou de um efeito positivo da resposta reparadora após o enfarte. Resultados Nas 3 fases todos os animais mantiveram estabilidade hemodinâmica e eletrocardiográfica, com exceção da elevação de ST de V1-V3 verificada após a injeção das microesferas. Na Primeira Fase as duas doses de papaverina induziram uma resposta hiperémica eficaz, sem tradução com significado na determinação do IRM (variação da pressão distal de - 11,4 ± 5 e de - 10,6± 5 mmHg com as doses de 5 e 10 mg respetivamente (p=0,5). Com a injeção das microesferas o IRM teve uma elevação média de 310 ± 190 %, para um valor médio de 41,3 ± 16 U (p = 0,001). Na Segunda Fase não houve diferenças significativas dos parâmetros hemodinâmicos, do fluxo epicárdico e da avaliação eletrocardiográfica entre os dois grupos. O IRM de base foi semelhante e após a infusão intracoronária observou-se uma elevação expressiva do IRM nos animais que receberam células em comparação com o grupo controlo (8,8 U ± 1 vs. 14,2 U ± 1,8, P=0,02) e quanto ao seu valor de base (aumento de 112%, p=0,008). Na terceira Fase não houve novamente diferenças significativas dos parâmetros hemodinâmicos, do fluxo epicárdico e da avaliação eletrocardiográfica entre os três grupos. Houve uma elevação do IRM nos animais que receberam células a partir da 2ª dose (72% nas células convencionai e 108% nas células inovadoras) e que se manteve com a 3ª dose (100% nas células convencionais e 88% nas inovadoras) com significado estatístico em comparação com o grupo controlo (p=0,034 com a 2ªdose e p=0,024 com a 3ª dose). Quatro semanas após a entrega das CEM observou-se a descida do IRM nos dois grupos que receberam células, para valores sobreponíveis aos do grupo controlo e aos valores pós-EAM. Na avaliação anatomopatológica e histológica dos corações explantados não houve diferenças entre os três grupos. Conclusões O IRM permite distinguir alterações da microcirculação coronária motivadas pela entrega intracoronária de CEM, na ausência de alterações de outros parâmetros clínicos da circulação coronária utilizados em tempo real. As alterações do IRM são progressivas e passíveis de avaliar o efeito/dose, embora não tenha sido possível determinar diferenças com os dois tipos de CEM. No nosso modelo a injeção intracoronária não se associou a evidência de efeito benéfico na reparação ou regeneração miocárdica após o EAM.---------------------------- ABSTRACT: ABSTRACT Introduction The use of cells for the treatment of cardiovascular disease is a promise for the future and perhaps the only option to overcome some of the shortcomings of current therapies. The strategy for the delivery of cells most often used in current research has been the intracoronary route and due to this microcirculation gains special relevance, mainly because it is the first interaction site of transplanted cells with the native tissue. Mesenchymal stem cells (MSC) have properties that make them suitable for Cell Therapy, but its dimensions, larger than the diameter of capillaries, have prompted controversy about the safety of intracoronary delivery. The interventional cardiology currently has techniques that allow for real-time and in vivo assessment of coronary microcirculation state. The determination of the index of microcirculatory resistance index (IMR) provides information about small vessels, independently of the coronary circulation and hemodynamic status, but the clinical applicability of this knowledge is yet to be defined. Objectives To clarify the potential use of IMR in the study of the effects of MSC through intracoronary transplantation. Population and Methods Preclinical study with swine model developed in three phases. In Phase One 8 healthy animals were used to study and validate the IMR assessment in our animal model. IMR was assessed with two different doses of papaverine for inducing the maximal hyperaemic response (5 and 10 mg) and microcirculation dysfunction was achieved after intracoronary injection with embozene microspheres with 40 μm in diameter. In Phase Two we randomized 18 healthy animals divided between the control group and the one receiving 30 x 106 MSC through an intracoronary infusion. There we blindly evaluated IMR, the aortic pressure, the epicardial coronary flow and the occurrence of ECG changes. In Phase Three we used 18 animals with a provoked acute myocardial infarction (AMI), randomized into a control group, a MSC expanded conventionally receiver group and a MSC expanded with an innovative methodology receiver group. There was a stepwise infusion with doses of 10 x 106, 15 x 106 and 20 x 106 MSC with determination of IMR, the aortic pressure, the epicardial coronary flow and occurrence of electrocardiographic abnormalities. Four weeks after cell delivery we again measured the IMR and proceeded with the pathological study of animals in the search for evidence of neoangiogenesis and myocardial regeneration, or a positive effect in the reparative response following the infarction. Results All animals remained hemodynamically stable and with no electrocardiographic abnormalities, except for the ST elevation in V1-V3 observed after injection of the microspheres. In Phase One the two doses of papaverine achieved an hyperemic and effective response without significant differences in IMR (variation of the distal pressure -11.4 ± 5 and -10.6 ± 5 mmHg with the doses of 5 and 10 mg respectively (p = 0.5). With the injection of the microspheres the IMR had an average increase of 310 ± 190% for an average value of 41.3 ± 16 U (p = 0.001). In the second phase there were no significant differences in hemodynamic parameters, epicardial flow and electrocardiographic assessment between the two groups. The baseline IMR was similar and after intracoronary infusion there was a significant increase in animals receiving cells compared with the control group (8.8 ± U 1 vs. 14.2 ± 1.8, p = 0.02) and with their baseline (112% increase, p = 0.008). In the third phase again there were no significant differences in hemodynamic parameters, the epicardial flow and electrocardiographic evaluation between the three groups. There was a significant increase in IMR in animals that received cells from the 2nd dose (72% in conventional cells and 108% in the innovative cells) that remained with the 3rd dose (100% in conventional cells and 88% in the innovative) with statistical significance compared with the control group (p = 0.034 with 2nd dose, p = 0.024 with 3rd dose). Four weeks after delivery of the MSC we observed the fall of the IMR in the two groups that received cells with values overlapping those of the control group. In pathological and histological evaluation of removed hearts there were no differences among the three groups. Conclusions The IMR allows for the differentiation of changes in coronary microcirculation motivated by intracoronary delivery of MSC in the absence of modification in other clinical parameters. IMR changes are progressive and enable the evaluation of the effect / dose, though it has not been possible to determine differences in the two types of MSC. In our model, intracoronary injection of MSC was not associated with evidence of repair or myocardial regeneration after AMI.

Estudo de novas técnicas de caracterização da resposta eléctrica em (Bio)sensores (para detecção de componentes agrícolas)

Faculdade de Ciências e Tecnologia – Universidade Nova de Lisboa Departamento de Engenharia Electrotécnica Tese de mestrado

Opções de utilização sequencial de anti-retrovíricos em doentes com falência terapêutica em Angola

A infecção pelo VIH/SIDA constitui um dos principais problemas de saúde no Mundo e em África. A África Sub-sahariana detém actualmente 67% das infecções a nível global. Angola, localizada na sub-região central de África (OMS) tem uma prevalência actual média estimada em 2.4%, estando rodeada a Sul e Leste por países de prevalências mais elevadas. Em Angola, predomina o VIH-1. Os dados publicados sobre a epidemiologia molecular do VIH em Angola mostram uma grande diversidade de subtipos e formas recombinantes circulantes (CRF), recombinantes circulantes únicas (URF) e amostras não tipificadas. A motivação para o estudo presente foi o conhecimento ainda limitado sobre a infeção por VIH em Angola, desde a epidemiologia molecular às características clínicas, imunológicas, virológicas, resposta à terapêutica anti-retrovírica combinada (TARVc) e perfil de resistência do VIH à TARVc. Foi estudado um coorte de 300 doentes adultos, com infecção por VIH, de 15 de Junho de 2006 a 15 de Junho de 2010. Predomina o género feminino, 65% (194/300) e o grupo etário dos 25 aos 39 anos, 62% (186/300). A mediana de idades é 33 anos, residem em Luanda 98% (295/300), 94% são angolanos, sendo os estrangeiros de S. Tomé e RDC. A Classificação CDC de 1993 na linha de base mostrou um predomínio de doentes da categoria clínica C, 53% (160/300), com uma ou duas doenças definidoras; 34% (101/300) dos doentes eram da Categoria C3 do CDC e 49% (147/300) tinham linfócitos T CD4+ abaixo das 200 cel/l. A doença definidora mais frequente foi a Tuberculose, em 39% dos doentes (117/300). A mediana de linfócitos T CD4+ na linha de base foi de 195 cel/μl [1-1076]. Apenas 12,2% dos doentes (37/302) tinha T CD4+ de base superior a 500 células/l. Determinou-se a carga vírica na linha de base, em 213 dos doentes (71%), verificando-se que 46% destes doentes (97/213) tinham cargas virícas superiores a 100.000 cp/ml, 32% (69/213) entre 10001 e 100000, 21% (45/213) entre 400 e 10000, 0,9% (2/213) abaixo de 400 cp/ml. Iniciaram terapêutica anti-retrovírica no período de estudo 206 doentes (69%) com esquemas terapêuticos baseados em NNRTI, sendo 131 (64%) medicados com a associação d4t+3TC+ NVP. Ao fim de 4 anos, em Junho de 2010, havia 126 doentes monitorizados com contagem de linfócitos T CD4+ e CV, estando 62% dos doentes com CV indetectável (79/126). Os doentes em falência virológica corresponderam a 16% (20/126), 9% (11/126) tinham resultados discordantes (boa resposta imunológica mas carga viral detectável) e 13% (16/126) foram inconclusivos. Foi mudada a terapêutica para esquema de 2ª linha em 5 doentes, 4 dos 5 doentes com critérios de falência virológica e 1 sem critérios de falência virológica, por toxicidade ao EFV. Os doentes com critérios de falência imunológica ou virológica segundo a OMS e os doentes com dados inconclusivos foram seleccionados para testes genotípicos de resistência aos anti-retrovíricos (TR). Foram realizados TR e subtipagem em 37 doentes. Nos doentes que realizaram TR sob TARVc, as mutações de resistência mais frequentemente encontradas foram a M184V, em 16 doentes, a K103N em 12 doentes e a Y181C em 7 doentes. O subtipo C, foi o subtipo predominante em 30% (11/37) dos casos. Para avaliar a adesão à TARVc, foram estudados 63 doentes, faltosos a consultas ou demonstrado sinais de falência clínica, imunológica ou virológica. O método realizado foi o auto-relato por entrevista. Verificou-se uma adesão à TARVc de 100% em 33% (21/63), adesão entre 100% e 90% em 7% (4/63), de 50 a 90% em 7% (4/63) e inferior a 50% em 54% (34/63). Como factores de não-adesão, predominavam a mobilidade no emprego Opções de utilização sequencial de anti-retrovíricos em doentes com falência terapêutica em Angola X e factores familiares e sociais, apontados como razão para a falta às consultas que davam acesso aos medicamentos ARV. Fazendo corresponder os resultados dos testes de resistência realizados à adesão de todos os doentes entrevistados, verifica-se que o grupo de 34 doentes com menos de 50% de adesão, 19 realizaram TR e desses, 13 mostraram mutações de resistência, sendo 10 resistentes a 2 classes de ARV, NITR e NNITR, 2 a NNITR e 1 a NITR. Os restantes 6 doentes deste grupo eram aparentemente susceptíveis às 3 classes de ARV. Actualmente, estão em seguimento 58% dos doentes (176/300), 26 % (77/300) perderam-se no seguimento e 16% (47/300) faleceram. O estudo realizado salienta a fase tardia da chegada aos cuidados médicos; mostra a tuberculose como doença indicadora mais frequente e mostra que a maioria dos doentes foi medicada com D4T+3TC+NVP. Os critérios de sucesso terapêutico descem ao longo do estudo de 71% para 62%. Indica a necessidade de acções urgentes para acesso mais precoce aos cuidados de saúde e intervenção social para ultrapassar as limitações à adesão à TARVc e tornar esta mais eficaz. As opções de segunda linha já disponíveis são muito reduzidas (tenofovir, lopinavir potenciado com ritonavir e saquinavir), havendo necessidade de continuar estes estudos para uma avaliação mais profunda da eficácia destas terapêuticas.

Caracterização do papel do gene bola: consequências na motilidade bacteriana e formação de biofilmes

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Microbiologia Médica

Cellular reprogramming strategies for degenerative disorders involving the retinal pigment epithelium

RESUMO: A reprogramação celular permite que uma célula somática seja reprogramada para outra célula diferente através da expressão forçada de factores de transcrição (FTs) específicos de determinada linhagem celular, e constitui uma área de investigação emergente nos últimos anos. As células somáticas podem ser experimentalmente manipuladas de modo a obter células estaminais pluripotentes induzidas (CEPi), ou convertidas directamente noutro tipo de célula somática. Estas descobertas inovadoras oferecem oportunidades promissoras para o desenvolvimento de novas terapias de substituição celular e modelos de doença, funcionando também como ferramentas valiosas para o estudo dos mecanismos moleculares que estabelecem a identidade celular e regulam os processos de desenvolvimento. Existem várias doenças degenerativas hereditárias e adquiridas da retina que causam deficiência visual devido a uma disfunção no tecido de suporte da retina, o epitélio pigmentar da retina (EPR). Uma destas doenças é a Coroideremia (CHM), uma doença hereditária monogénica ligada ao cromossoma X causada por mutações que implicam a perda de função duma proteína com funções importantes na regulação do tráfico intracelular. A CHM é caracterizada pela degenerescência progressiva do EPR, assim como dos foto-receptores e da coróide. Resultados experimentais sugerem que o EPR desempenha um papel importante na patogénese da CHM, o que parece indicar uma possível vantagem terapêutica na substituição do EPR nos doentes com CHM. Por outro lado, existe uma lacuna em termos de modelos in vitro de EPR para estudar a CHM, o que pode explicar o ainda desconhecimento dos mecanismos moleculares que explicam a patogénese desta doença. Assim, este trabalho focou-se principalmente na exploração das potencialidades das técnicas de reprogramação celular no contexto das doenças de degenerescência da retina, em particular no caso da CHM. Células de murganho de estirpe selvagem, bem como células derivadas de um ratinho modelo de knockout condicional de Chm, foram convertidos com sucesso em CEPi recorrendo a um sistema lentiviral induzido que permite a expressão forçada dos 4 factores clássicos de reprogramação, a saber Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc. Estas células mostraram ter equivalência morfológica, molecular e funcional a células estaminais embrionárias (CES). As CEPi obtidas foram seguidamente submetidas a protocolos de diferenciação com o objectivo final de obter células do EPR. Os resultados promissores obtidos revelam a possibilidade de gerar um valioso modelo de EPR-CHM para estudos in vitro. Em alternativa, a conversão directa de linhagens partindo de fibroblastos para obter células do EPR foi também abordada. Uma vasta gama de ferramentas moleculares foi gerada de modo a implementar uma estratégia mediada por FTs-chave, seleccionados devido ao seu papel fundamental no desenvolvimento embrionário e especificação do EPR. Conjuntos de 10 ou menos FTs foram usados para transduzir fibroblastos, que adquiriram morfologia pigmentada e expressão de alguns marcadores específicos do EPR. Adicionalmente, observou-se a activação de regiões promotoras de genes específicos de EPR, indicando que a identidade transcricional das células foi alterada no sentido pretendido. Em conclusão, avanços significativos foram atingidos no sentido da implementação de tecnologias de reprogramação celular já estabelecidas, bem como na concepção de novas estratégias inovadoras. Metodologias de reprogramação, quer para pluripotência, quer via conversão directa, foram aplicadas com o objectivo final de gerar células do EPR. O trabalho aqui descrito abre novos caminhos para o estabelecimento de terapias de substituição celular e, de uma maneira mais directa, levanta a possibilidade de modelar doenças degenerativas da retina com disfunção do EPR numa placa de petri, em particular no caso da CHM.---------------ABSTRACT: Cellular reprogramming is an emerging research field in which a somatic cell is reprogrammed into a different cell type by forcing the expression of lineage-specific transcription factors (TFs). Cellular identities can be manipulated using experimental techniques with the attainment of pluripotency properties and the generation of induced Pluripotent Stem (iPS) cells, or the direct conversion of one somatic cell into another somatic cell type. These pioneering discoveries offer new unprecedented opportunities for the establishment of novel cell-based therapies and disease models, as well as serving as valuable tools for the study of molecular mechanisms governing cell fate establishment and developmental processes. Several retinal degenerative disorders, inherited and acquired, lead to visual impairment due to an underlying dysfunction of the support cells of the retina, the retinal pigment epithelium (RPE). Choroideremia (CHM), an X-linked monogenic disease caused by a loss of function mutation in a key regulator of intracellular trafficking, is characterized by a progressive degeneration of the RPE and other components of the retina, such as the photoreceptors and the choroid. Evidence suggest that RPE plays an important role in CHM pathogenesis, thus implying that regenerative approaches aiming at rescuing RPE function may be of great benefit for CHM patients. Additionally, lack of appropriate in vitro models has contributed to the still poorly-characterized molecular events in the base of CHM degenerative process. Therefore, the main focus of this work was to explore the potential applications of cellular reprogramming technology in the context of RPE-related retinal degenerations. The generation of mouse iPS cells was established and optimized using an inducible lentiviral system to force the expression of the classic set of TFs, namely Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc. Wild-type cells, as well as cells derived from a conditional knockout (KO) mouse model of Chm, were successfully converted into a pluripotent state, that displayed morphology, molecular and functional equivalence to Embryonic Stem (ES) cells. Generated iPS cells were then subjected to differentiation protocols towards the attainment of a RPE cell fate, with promising results highlighting the possibility of generating a valuable Chm-RPE in vitro model. In alternative, direct lineage conversion of fibroblasts into RPE-like cells was also tackled. A TF-mediated approach was implemented after the generation of a panoply of molecular tools needed for such studies. After transduction with pools of 10 or less TFs, selected for their key role on RPE developmental process and specification, fibroblasts acquired a pigmented morphology and expression of some RPE-specific markers. Additionally, promoter regions of RPE-specific genes were activated indicating that the transcriptional identity of the cells was being altered into the pursued cell fate. In conclusion, highly significant progress was made towards the implementation of already established cellular reprogramming technologies, as well as the designing of new innovative ones. Reprogramming into pluripotency and lineage conversion methodologies were applied to ultimately generate RPE cells. These studies open new avenues for the establishment of cell replacement therapies and, more straightforwardly,raise the possibility of modelling retinal degenerations with underlying RPE defects in apetri dish, particularly CHM.

Caracterização do papel dos genes TYMS e MTR no desenvolvimento de Cancro Colo-Rectal

RESUMO: O cancro colo-rectal (CCR) é um dos cancros que possui maior taxa de mortalidade a nível mundial. Em Portugal esta patologia é responsável pela morte de cerca de 3700 pessoas por ano, sendo que estes números aumentam de ano para ano. Ao longo das últimas décadas o papel das alterações genéticas na etiologia das patologias oncológicas tem vindo a ter cada vez mais um maior destaque. O número de estudos que avaliam a importância de polimorfismos, mutações, alterações na regulação génica e interacções entre genes no desenvolvimento destas patologias tem aumentado exponencialmente. Com o aumento do conhecimento da forma como estas alterações influenciam o desenvolvimento do cancro surgiram os primeiros meios de diagnóstico genético, levando assim a uma alteração da forma como são encarados o diagnóstico e a prevenção destas doenças. No CCR as formas hereditárias com alterações genéticas inequivocamente identificadas representam apenas 5% dos casos. Existem cerca de 25% que representam formas hereditárias para as quais ainda não foram estabelecidos os padrões de alterações genéticas subjacentes. Desta forma, estudos que venham contribuir para um maior conhecimento dos mecanismos moleculares responsáveis pelo aumento da susceptibilidade dos indivíduos para o desenvolvimento de CCR são extremamente importantes. O CCR é uma patologia multifactorial, onde factores genéticos interagem com factores ambientais no surgimento e desenvolvimento da doença. Assim, torna-se essencial integrar o estudo das alterações genéticas no contexto ambiental onde os indivíduos em estudo se encontram. No caso desta patologia um dos principais factores ambientais estudado é a nutrição. Vários estudos têm sido realizados ao longo dos últimos anos de forma a compreender como pode a ingestão dos nutrientes influenciar o desenvolvimento de CCR e de que forma interage com as alterações genéticas individuais. O ciclo do folato é um dos processos metabólicos onde o papel da nutrição em interacção com alterações genéticas mais tem sido estudado nos últimos anos. Deste cruzamento entre o estudo das alterações genéticas e ambientais surge a Nutrigenética. O conjunto de estudos da presente tese tem como objectivo aumentar o conhecimento do papel das alterações em genes do ciclo do folato, em interacção com factores nutricionais e de estilo de vida, não só no desenvolvimento de CCR, mas também de outra patologia do tracto gastrointestinal, a Doença de Crohn (DC), uma doença inflamatória muitas vezes associada como factor de risco para o desenvolvimento de CCR. Este estudo debruçou-se essencialmente no estudo dos genes timidilato sintetase (TYMS) e metionina sintetase (MTR) em populações com CCR e DC, bem como no padrão nutricional destas populações com particular incidência nos nutrientes envolvidos no ciclo do folato (folato, metionina, vitamina B6, vitamina B12). Analisando o conjunto de resultados obtidos para os estudos do CCR podemos concluir que quer a TYMS quer a MTR possuem um papel relevante na susceptibilidade para desenvolver esta patologia, assim como têm destaque no funcionamento do ciclo celular durante o processo oncogénico. Os resultados demonstram que os factores que levam a uma menor disponibilidade de grupos metil no ciclo de folato (baixos níveis de folato, alteração da actividade de MTR, elevada expressão de TYMS) constituem factores de risco, muito provavelmente por contribuírem para uma desregulação dos níveis de metionina disponível para a metilação do DNA da célula. Demonstram ainda que em células tumorais ocorrem alterações na regulação do ciclo do folato de forma a favorecer a síntese de DNA em detrimento da metilação do mesmo, alterando para isso a expressão dos genes de forma a que o fluxo de grupos metil provenientes do folato sejam encaminhados para a enzima TYMS. O polimorfismo de deleção 6pb da TYMS surge como um factor de diagnóstico e de prognóstico de CCR para a população portuguesa. Dos factores nutricionais analisados apenas o folato aparenta ter um papel relevante na modelação do risco de desenvolver CCR. Na doença de Crohn (DC) podemos verificar que a homocisteína e o seu metabolismo poderão contribuir para o aparecimento e desenvolvimento da patologia. O aumento da homocisteína poderá ser o responsável por um aumento da resposta auto-imune do organismo, promovendo o aparecimento da DC. O polimorfismo A2756G MTR desempenha um papel preponderante como factor de diagnóstico da DC, tendo sido associado pela primeira vez a esta patologia. Tem também um papel importante no desenvolvimento da doença, uma vez que está associado a uma idade de diagnóstico mais baixa, sugerindo assim que o desenvolvimento da doença ocorre de forma mais precoce. Concluindo, com este estudo pensamos ter contribuído para um melhor entendimento do papel do ciclo do folato no desenvolvimento de CCR e DC, sendo um ponto de partida para futuras investigações que possam revelar cada vez melhor as complexas interacções metabólicas desta via e a sua influência nas patologias estudadas. Do nosso estudo destacamos a importância de uma análise global das várias etapas do ciclo do folato para que se possa compreender a dinâmica que se estabelece no desenvolvimento destas patologias, podendo diversas alterações, quer a nível genético quer a nível nutricional, exercerem efeitos diferentes consoante o estado dos restantes intervenientes do ciclo do folato. Acreditamos que no futuro este estudo permitirá que o conhecimento do ciclo do folato tenha cada vez mais uma relevância fundamental a nível de diagnóstico e terapêutica destas patologias.------------ ABSTRACT: Colorectal Cancer (CRC) is one of the cancers that have a higher rate of mortality worldwide. In Portugal this pathology is responsible for the deaths of about 3700 people per year, and these numbers increase each year. Over the past few decades the role of genetic changes in the etiology of oncological pathologies has had an increasingly greater emphasis. The number of studies that evaluate the importance of polymorphisms, mutations, changes in gene regulation and gene interactions in the development of these diseases has increased exponentially. With the increased knowledge of how these changes influence the development of cancer, appeared the first means for genetic diagnostic, leading to a change in the way diagnosis is seen and in the prevention of these diseases. In CRC the hereditary forms with clearly identified genetic changes represent only 5% of cases. There are about 25% representing hereditary forms for which the patterns of genetic changes haven’t been established. In this way, studies that will contribute to a greater understanding of the molecular mechanisms responsible for increased susceptibility of individuals to the CRC development are extremely important. CRC is a multifactorial pathology, where genetic factors interact with environmental factors in the emergence and development of the disease.Thus, it is essential to integrate the study of genetic changes in the environmental context of the individuals under study. In the case of this pathology one of the main environmental factors studied is nutrition. Several studies have been conducted over the past few years in order to understand how the intake of nutrients can influence the development of CRC and how nutrients interact with the individual genetic changes. The folate cycle is one of the metabolic processes where the role of nutrition in interaction with genetic alterations has been studied in recent years. This cross between the study of genetic and environmental changes developed Nutrigenetics. The set of studies of this thesis aims to increase awareness of the role of changes in genes of the folate cycle, in interaction with nutritional factors and lifestyle, not only in the development of CRC, but also of another pathology of the gastrointestinal tract, Crohn's disease (CD), an inflammatory disease often associated as a risk factor for the development of CRC. This study dealt mainly in the study of genes thymidylate synthase (TYMS) and methionine synthase (MTR) in populations with CRC and CD, as well as in the nutritional pattern of these populations with particular focus on nutrients involved in the folate cycle (folate, methionine, vitamin B6, vitamin B12). Analyzing the results obtained for the CRC studies we conclude that either the MTR TYMS have a relevant role in susceptibility to develop this pathology, and have an important role in the functioning of the cell cycle during oncogenesis. The results show that the factors that lead to a lower availability of methyl groups in folate cycle (low levels of folate, change the activity of MTR, high expression of TYMS) constitute risk factors, most likely by contribute to a dysregulation of methionine levels available for DNA methylation of the cell. Our results also demonstrate that in tumor cells occur changes in the regulation of the folate cycle in order to promote the synthesis of DNA, to the detriment of methylation of the same by changing the expression of genes so that the methyl groups from folate are forwarded to the TYMS enzyme reaction. The deletion polymorphism 6bp of TYMS emerges as a diagnostic and prognostic factor of CCR for the Portuguese population. Nutritional factors analyzed only folate appears to have a major role in modulating the risk of developing CCR.In Crohn’s disease (CD) we can check that homocysteine and its metabolism may contribute to the emergence and development of this pathology. Increased homocysteine may be responsible for an increase in the body's autoimmune response, promoting the emergence of CD. The polymorphism A2756G MTR plays a leading role as a factor of diagnosis of DC, having been associated with this pathology for the first time. It also has an important role in the development of the disease, since it is associated with a lower diagnostic age, suggesting that the development of the disease occurs earlier. In conclusion, our study has contributed to a better understanding of the role of folate cycle in the development of CRC and CD, being a starting point for future research that may prove increasingly complex metabolic interactions in this via and its influence on the pathologies studied. In our study we highlight the importance of a comprehensive analysis of the various steps of the folate cycle in order to understand the dynamics that settles in the development of these pathologies, and a number of amendments, whether at the genetic level or at the nutritional level, exercise different effects depending on the stage of the remaining participants in the folate cycle. We believe that in the future this study will allow the knowledge of folate cycle to have increasingly a fundamental relevance at the level of diagnosis and treatment of these diseases.

Study of glycosidic changes in lung cancer: potential effectors in hematogenous metastasis

RESUMO: O cancro do pulmão (LC), uma das principais causas de mortalidade relacionada com cancro em Portugal, pode levar à formação de metástases hematogénicas. A adesão das células tumorais ao endotélio é considerada um dos passos fundamentais envolvidos na metástase. Em células sanguíneas, esta adesão é mediada por ligandos de E-selectina (E-SL), glicoproteínas ou glicolípidos decorados principalmente com sialyl-Lewis x (sLex) e sialyl-Lewis a (sLea). Tem sido descrito a expressão destes antigénios em LC, contudo o seu papel funcional em permitir a adesão das células de LC ao endotélio é ainda pouco compreendido. Foram analisadas amostras emparelhadas normais e tumorais de pacientes com cancro de pulmão de não-pequenas células (NSCLC) e três linhas celulares de LC. Immunoblotting assays com anti-sLex/sLea e molécula quimérica de E-selectina demonstraram que tecidos tumorais de LC sobreexpressam significativamente E-SL e resultados de citometria de fluxo demonstraram uma expressão elevada de E-SL nas linhas celulares. Para compreender o mecanismo da sobreexpressão de E-SL em tecidos tumorais e linhas celulares de LC, foi analisada a expressão de genes envolvidos na biossíntese de E-SL, nomeadamente FUT3, FUT4, FUT6, FUT7, ST3GAL3, ST3GAL4, ST3GAL6, β4GALT1, GCNT1 e GALNT3. Observou-se a sobreexpressão das fucosiltransferases FUT3, FUT6 e FUT7 em tecidos tumorais de LC e FUT3 em linhas celulares de LC, sendo que neste último, esta expressão é correlacionada com um aumento da adesão das células de LC às selectinas endoteliais. Foi observado que uma baixa expressão de FUT4 em tecidos tumorais está associada com estadios menos avançados de NSCLC. Foram analisadas ainda proteínas decoradas com sLex/sLea, tendo-se identificado como E-SL o antigénio carcinoembrionário em NSCLC. Em resumo, esta tese contribuiu para uma melhor compreensão das alterações glicosídicas e moléculas que podem influenciar a progressão tumoral do LC, podendo permitir identificar futuramente novos biomarcadores de diagnóstico/prognóstico e potenciais alvos terapêuticos para o NSCLC.--------------------------ABSTRACT: Lung cancer (LC), one of the major causes of mortality related to cancer in Portugal, may lead to hematogenous metastasis. Adhesion of cancer cells to endothelium is considered one of the crucial steps involved in metastasis. In blood cells, this adhesion is initiated by endothelial selectin ligands (E-SL) that are glycoproteins or glycolipids decorated mostly with sialyl-Lewis x (sLex) and sialyl-Lewis a (sLea). While LC has been described as expressing these sialyl Lewis antigens, its functional role in allowing LC adhesion to endothelium is still poorly understood. We analyzed paired tumor and normal tissues samples from non-small cell lung cancer (NSCLC) patients and three LC cell lines. Immunoblotting assays with anti-sLex/sLea and E-selectin chimera demonstrated that LC tumor tissues significantly overexpress E-SL and flow cytometry results indicated that E-SL are also abundantly expressed in LC cell lines. To understand the mechanism behind the overexpression of E-SL in LC tissues and cell lines, we analyzed the expression of genes involved in its biosynthesis, namely FUT3, FUT4, FUT6, FUT7, ST3GAL3, ST3GAL4, ST3GAL6, β4GALT1, GCNT1 and GALNT3. It was observed the overexpression of fucosyltransferases FUT3, FUT6 and FUT7 in LC tumor tissues and FUT3 in LC cell lines, being this last one correlated with an increased reactivity of the LC cells to endothelial selectins. It was described that low expression of FUT4 in tumor tissues is correlated with early stages of NSCLC. We also analyzed scaffolds proteins of sLex/sLea and it was identified the carcinoembryonic antigen as an E-SL in NSCLC. In summary, this thesis contributed to a better understanding of the glycosidic changes and molecules that can influence tumor progression of LC, allowing identifying in the future new diagnosis/prognosis biomarkers and potential therapeutic targets for NSCLC.

Elucidating the role of glycans in leucocyte function

RESUMO:O processo de glicosilação é a modificação pós-traducional de proteínas mais comum e está envolvido em vários processos fisiológicos e patológicos. Especificamente, certos perfis glicosídeos estão correlacionados a estados específicos de diferenciação celular, e podem modular vários eventos celulares, como sinalização celular, migração celular e interações hospedeiro-patogénio. Assim sendo, a glicosilação desempenha um papel crucial na modulação de vários processos imunológicos. No entanto, permanece por esclarecer como as estruturas glicosídicas influenciam a imunidade. Especificamente, algumas estruturas glicosídicas terminais que estão modificadas pela ligação de ácido siálico desempenham um papel importante em várias funções do sistema imune, nomeadamente migração leucocitária em contexto de inflamação e ativação de células imunes. Como tal, este trabalho teve como objectivo investigar como a expressão de certos glicanos influencia componentes importantes da resposta imune inata e adaptativa. Este trabalho está dividido em três componentes principais: 1) A imunidade está amplamente dependente da habilidade das células circulantes migrarem para os tecidos inflamados, sendo que a ligação de leucócitos à Eselectina endotelial é o primeiro passo. Assim, nós analisámos a estrutura e função dos ligandos de E-selectina que são expressos pelas células humanas mononucleares de sangue periférico (PBMCs), fornecendo novos conhecimentos para a compreensão dos intervenientes moleculares que mediam a ligação dos monócitos, células CD4+ e CD8+T e células B ao endotélio vascular. Surpreendentemente, os monócitos apresentaram maior capacidade de ligação à E-selectina comparativamente aos linfócitos. Esta observação pode ser explicada pelo facto de os monócitos humanos expressarem, uniformemente, um vasto reportório de glicoproteínas que exibem afinidade de ligação à E-selectina, nomeadamente: as glicoformas do CD43 (CD43E) e do CD44 (HCELL), em adição à já previamente reportada glicoforma da PSGL-1 (CLA). Consistentemente, a diferente capacidade que as diversas populações linfocitárias apresentam de se ligar à E-selectina, está integralmente relacionada com a sua expressão de glicoproteínas com afinidade de ligação à E-selectina. Enquanto que as células CD4+T apresentam uma elevada reatividade à E-selectina, as células CD8+T e B demonstram pouca ou nenhuma capacidade de ligação à E-selectina. Esta atividade de ligação à E-selectina das células CD4+T é conferida pela expressão de HCELL, em adição às já previamente reportadas CLA e CD43E. As células CD8+ T não expressam HCELL e apenas expressam pequenas quantidades de CLA e CD43E, enquanto que as células B não expressam ligandos de Eselectina. Mais, a exofucosilação da superfície destas células, levou ao dramático aumento da expressão dos ligandos de E-selectina em todos as populações leucocitárias, verificando-se que a criação de certos ligandos de E-selectina está dependente do tipo de célula, após fucosilação. Colectivamente, estes resultados redefinem o nosso conhecimento acerca dos mecanismos moleculares que governam o tráfico das células mononucleares de sangue periférico em contexto de inflamação. 2) A habilidade das células dendríticas (DCs) para extravasarem em locais de inflamação é crucial para o sucesso da terapia com DCs. Assim, analisámos a estrutura e função das moléculas de adesão que mediam a migração transendotelial (TEM) das DCs. Para isso, foram usadas DCs geradas a partir da diferenciação de monócitos (mo-DCS), obtidos quer pelo métodos de separação imuno-magnética de células CD14+ (CD14-S) ou por isolamento por aderência ao plástico (PA-S). Os resultados obtidos indicam que as glicoformas de ligação à Eselectina de PSGL-1, CD43 e CD44 são expressas pelas CD14-S mo-DCs, enquanto que as PA-S mo-DCs expressam apenas CLA. É importante notar que a ligação do CD44 nas mo-DCs, mas não nas PA-S mo-DCs, desencadeia a ativação e consequente adesão da VLA-4 ao endotélio na ausência de um gradiente de quimiocinas. Procedeu-se também à análise dos ligandos E-selectina expressos em mo-DCs geradas a partir de monócitos do sangue do cordão umbilical (UCB) e, inesperadamente, as UCB mo-DCs não expressam qualquer glicoproteína com reatividade à E-selectina. Além disso, a exofucosilação das mo- DCs humanas utilizando uma α(1,3)-fucosiltransferase aumenta significativamente a expressão de HCELL e, portanto, estas células apresentam uma capacidade aumentada para se ligarem à E-selectina em condições de fluxo hemodinâmico. Estes resultados destacam o papel do HCELL no desencadeamento do TEM das CD14-S mo-DCs e sugerem que estratégias para potenciar a expressão de HCELL poderão impulsionar o recrutamento de mo-DCs para locais de inflamação. 3) Outro obstáculo para alcançar o sucesso promissor de vacinas baseadas em DCs é o estabelecimento de abordagens eficientes que poderão melhorar o estado de maturação e apresentação antigénica das DCs. Por conseguinte, foram investigadas abordagens alternativas que podem superar este obstáculo. Através da remoção de ácido siálico de superfície celular das DCs, conseguiu-se induzir a maturação de DC humanas e de ratinhos. Notavelmente, tanto as DCs humanas como as de ratinho, ao serem desialiladas mostraram uma capacidade aumentada para induzir a proliferação de células T, para secretar citocinas Th1 e para induzir a morte específica de células tumorais. Em adição, as DCs desialiladas apresentam uma maior capacidade de apresentação cruzada de antigénios tumorais às células T citotóxicas. Colectivamente, o presente estudo oferece uma visão chave para optimizar a capacidade das DCs em induzir respostas imunitárias anti-tumorais, e indica que o tratamento com sialidase é uma nova tecnologia para melhorar a eficácia e aplicabilidade das vacinas baseadas em DCs. Coletivamente, os nossos resultados demostram como a glicosilação e a sua manipulação podem modular a imunidade. Concretamente, através de uma reação de exofucosilação conseguimos aumentar fortemente a capacidade de os leucócitos extravasarem para os tecidos afectados, enquanto que a remoção dos níveis de ácido siálico da superfície celular das DCs, induz potentes respostas anti-tumorais mediadas por células T citotóxicas. ---------------------------- ABSTRACT: Glycosylation is the most widely form of protein post-translational modification and is involved in many physiological and pathological processes. Specifically, certain patterns of glycosylation are associated with determined stages of cell differentiation and can modulate processes like cell-signaling and migration and host-pathogen interactions. As such, glycosylation plays a crucial role in the modulation of several immune events. However, how glycans execute this immune-modulation and, therefore, influence immunity is still poorly unknown. Specifically, some terminal sialic acid-modified determinants are known to be involved in several physiological immune processes, including leukocyte trafficking into sites of inflammation and cell immune activation. Therefore, in this work, we sought to investigate more deeply how the expression of these glycosidic structures affects events form both innate and adaptive immune responses. To this end, we divided our work into three main parts: 1) Immunity critically depends on the ability of sentinel circulating cells to infiltrate injured sites, of which leukocyte binding to endothelial E-selectin is the critical first step. Thus, we first analyzed the structure and function of the E-selectin ligands expressed on native human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), providing novel insights into the molecular effectors governing adhesion of circulating monocytes, and of circulating CD4+T, CD8+T and B cells, to vascular endothelium under hemodynamic shear conditions. Strikingly, monocytes show a higher ability to tether and roll on endothelial cells than lymphocyte subsets. This is due to the fact that human circulating monocytes uniformly display a wide repertoire of E-selectin binding glycoproteins, namely the E-selectin-binding glycoforms of CD43 (CD43E) and CD44 (HCELL), in addition to the previously described E-selectin-binding glycoform of PSGL-1 (CLA). In addition, we also observed a differential ability of the different lymphocyte subsets to bind to Eselectin under hemodynamic shear stress conditions, and these differences were highly correlated with their individual expression of E-selectin binding glycoproteins. While CD4+T cells show a robust E-selectin binding ability, CD8+T and B cells show little to no E-selectin reactivity. CD4+T cell potent Eselectin rolling activity is conferred by HCELL expression, in addition to the previously reported E-selectin-binding glycoproteins CD43E and CLA. CD8+T cells display no HCELL and low amounts of CLA and CD43E, whereas B cells lack E-selectin ligand expression. Moreover, enforced exofucosylation of cell surface of these cells noticeably increases expression of functional E-selectin ligands among all leukocytes subsets, with cell type-dependent specificity in the protein scaffolds that are modified. Taken together, these findings redefine our understanding of the molecular mechanisms governing the trafficking patterns of PBMCs that are relevant in the context of acute or chronic inflammatory conditions. 2) The ability of circulating dendritic cells (DCs) to extravasate at inflammatory sites is critical to the success of DC-based therapies. Therefore, we assessed the structure and function of adhesion molecules mediating the transendothelial migration (TEM) of human monocyte derived-DCs (mo-DCs), obtained either by CD14 positive immune-magnetic selection (CD14-S) or by plastic adherence of blood monocytes (PA-S). We report for the first time that the E-selectin binding glycoforms of PSGL-1, CD43 and CD44 are all expressed on CD14-S mo-DCs, in contrast to PA-S mo-DCs that express only CLA. Importantly, CD44 engagement on CD14-S mo-DCs, but not on PA-S mo-DCs, triggers VLA-4-dependent adhesiveness and programs TEM in absence of chemokine gradient. We also analyzed the E-selectin ligands expressed on mo-DCs generated from umbilical cord blood (UCB) monocytes, and unexpectedly, UCB mo-DCs do not express any glycoprotein with E-selectin reactivity. Furthermore, exoglycosylation of human mo-DCs using an α(1,3)-fucosyltransferase significantly increases expression of HCELL, and therefore exofucosylated mo-DCs exhibit an augmented ability to bind to E-selectin under hemodynamic shear stress conditions. These findings highlight a role for HCELL engagement in priming TEM of CD14-S mo-DCs, and suggest that strategies to enforce HCELL expression could boost mo-DC recruitment to inflammatory sites.3) Another obstacle to achieve the promising success of DC-based vaccines is the establishment of efficient approaches that could successfully enhance maturation and cross-presentation ability of DCs. Therefore, we investigated an alternative approach that can overcome this problem. Through removal of sialic acid content from DC cell surface we are able to elicit maturation of both human and mouse DCs. Notably, desialylated human and murine DCs showed enhanced ability to induce autologous T cell to proliferate, to secrete Th1 cytokines and to kill tumor cells. Moreover, desialylated DCs display enhanced cross-presentation of tumor antigens to cytotoxic CD8+ T cells. Collectively, this study offers key insight to optimize the ability of DCs to boost anti-tumor immune responses, and indicates that the treatment with an exogenous sialidase is a powerful new technology to improve the efficacy and applicability of DC-based vaccines. Overall, our findings show how glycosylation and its manipulation can modulate immunity. Concretely, through an exofucosylation reaction we are able to greatly augment the ability of leukocytes to extravasate into injured tissues, while removal of sialic acid moieties from cell surface of DCs, significantly potentiate their ability to induce anti-tumor cytotoxic T cell-mediate responses.

Nanomateriais manufaturados : avaliação de segurança através da caracterização dos seus efeitos genéticos

RESUMO - Os nanomateriais manufaturados (NMs), isto é, fabricados deliberadamente para fins específicos, apresentam propriedades físico-químicas únicas como a dimensão, área superficial ou funcionalização, que lhes conferem caraterísticas mecânicas, óticas, elétricas e magnéticas muito vantajosas para aplicações industriais e biomédicas. Efetivamente, a tecnologia baseada nos NMs, ou nanotecnologia, foi identificada como uma key enabling technology, impulsionadora do crescimento económico dos países industrializados, devido ao seu potencial para melhorar a qualidade e desempenho de muitos tipos de produtos e de processos. Contudo, a expansão da utilização de NMs contrasta com a insuficiente avaliação de risco para a saúde humana e para o ambiente, sendo considerados como um risco emergente para a saúde pública. As incertezas sobre a segurança dos NMs para a saúde pública advêm sobretudo de estudos epidemiológicos em humanos expostos a nanomateriais produzidos como consequência dos processos e atividades humanas e da poluição. Uma das principais preocupações relativamente aos efeitos adversos dos NMs na saúde humana é o seu potencial efeito carcinogénico, que é sugerido por alguns estudos experimentais, como no caso dos nanomateriais de dióxido de titânio ou dos nanotubos de carbono. Para avaliar em curto termo as propriedades carcinogénicas de um composto, utilizam-se frequentemente ensaios de genotoxicidade em linhas celulares de mamífero ou ensaios em modelos animais, em que se analisa uma variedade de lesões genéticas potencialmente relacionados com o processo de carcinogénese. No entanto, a investigação sobre as propriedades genotóxicas dos NMs não foi, até hoje, conclusiva. O presente estudo tem por objectivo principal caracterizar os efeitos genotóxicos associados à exposição a nanomateriais manufaturados, de forma a contribuir para a avaliação da sua segurança. Constituíram objectivos específicos deste estudo: i) avaliar a genotoxicidade dos NMs em três tipos de células humanas expostas in vitro: linfócitos humanos primários, linha celular de epitélio brônquico humano (BEAS-2B) e linha celular de adenocarcinoma epitelial de pulmão humano (A549); ii) avaliar a sua genotoxicidade num modelo de ratinho transgénico; iii) investigar alguns mecanismos de acção que poderão contribuir para a genotoxicidade dos nanomateriais, como a contribuição de lesões oxidativas para a genotoxicidade induzida pelos NMs in vitro, e a investigação da sua bioacumulação e localização celular in vivo. Foram analisados os efeitos genotóxicos associados à exposição a duas classes de NMs, dióxido de titânio e nanotubos de carbono de parede múltipla, bem como a um NM de óxido de zinco, candidato a ser utlilizado como controlo positivo de dimensão nanométrica. Os xx NMs utilizados foram previamente caracterizados com detalhe relativamente às suas características físico-químicas e também relativamente à sua dispersão em meio aquoso e no meio de cultura. A metodologia incluiu ensaios de citotoxicidade e de genotoxicidade in vitro, designadamente, ensaios de quebras no DNA (ensaio do cometa) e nos cromossomas (ensaio do micronúcleo) em células humanas expostas a várias concentrações de NMs, por comparação com células não expostas. Também foram realizados ensaios in vivo de quebras no DNA, quebras cromossómicas e ainda um ensaio de mutações em vários órgãos de grupos de ratinhos transgénicos LacZ, expostos por via intravenosa a duas doses de dióxido de titânio. Foi investigada a existência de uma relação dose-resposta após exposição das células humanas ou dos animais a NMs. A contribuição de lesões oxidativas para a genotoxicidade após exposição das células aos NMs in vitro foi explorada através do ensaio do cometa modificado com enzima. Realizaram-se estudos histológicos e citológicos para deteção e localização celular dos NMs nos órgãos-alvo dos ratinhos expostos in vivo. Os resultados demonstraram efeitos genotóxicos em alguns dos NMs analisados em células humanas. No entanto, os efeitos genotóxicos, quando positivos, foram em níveis reduzidos, ainda que superiores aos valores dos controlos, e a sua reprodutibilidade era dependente do sistema experimental utilizado. Para outros NMs, a evidência de genotoxicidade revelou-se equívoca, conduzindo à necessidade de esclarecimento através de ensaios in vivo. Para esse fim, recorreu-se a uma análise integrada de múltiplos parâmetros num modelo animal, o ratinho transgénico baseado em plasmídeo contendo o gene LacZ exposto a um NM de dióxido de titânio, NM-102. Embora tenha sido demonstrada a exposição e a acumulação do NM no fígado, não se observaram efeitos genotóxicos nem no fígado, nem no baço nem no sangue dos ratinhos expostos a esse NM. Neste estudo concluiu-se que algumas formas de dióxido de titânio e nanotubos de carbono de parede múltipla produzem efeitos genotóxicos em células humanas, contribuindo para o conjunto de evidências sobre o efeito genotóxico desses NMs. As diferenças observadas relativamente à genotoxicidade entre NMs do mesmo tipo, mas distintos em algumas das suas características físico-quimicas, aparentemente não são negligenciáveis, pelo que os resultados obtidos para um NM não devem ser generalizados ao grupo correspondente. Para além disso, a genotoxicidade equívoca verificada para o NM-102 em células humanas expostas in vitro, não foi confirmada no modelo in vivo, pelo que o valor preditivo da utilização dos ensaios in vitro para a identificação de NMs com efeitos genotóxicos (e portanto potencialmente carcinogénicos) ainda tem de ser esclarecido antes de ser possível extrapolar as conclusões para a saúde humana. Por sua vez, como a informação aqui produzida pelas metodologias in vitro e in vivo não reflete os efeitos de exposição continua ou prolongada, que poderá conduzir a efeitos genotóxicos distintos, esta xxi deverá ser complementada com outras linhas de evidência relativamente à segurança dos NMs. Perante a incerteza dos níveis de exposição real do organismo humano e do ambiente, a segurança da utilização dos NMs não pode ser garantida a longo prazo e, tendo em conta a elevada produção e utilização destes NMs, são prementes futuros estudos de monitorização ambiental e humana.

Analysis of outcome and cancer stem cells status in patients with resectable pancreatic adenocarcinoma

RESUMO: Actualmente, a única possibilidade de cura para doentes com adenocarcinoma do pâncreas (PDAC) é a ressecção cirúrgica, no início deste estudo, perguntamo-nos se os predictores clínico-patológicos clássicos de prognostico poderiam ser validados em uma grande cohort de doentes com cancro do pâncreas ressecável e se outros predictores clínicos poderiam ter um papel na decisão de que doentes beneficiariam de ressecção cirúrgica. No capítulo 2, observamos que até 30% dos doentes morrem no primeiro ano após a ressecção cirúrgica, pelo que o nosso objectivo foi determinar factores pré-operatórios que se correlacionam com mortalidade precoce após ressecação cirúrgica com recurso a um instrumento estatisticamente validado, o Charlson-Age Comorbidity Index (CACI), determinamos que um CACI score superior a 4 foi preditivo de internamentos prolongados (p <0,001), complicações pós-operatórias (p = 0,042), e mortalidade em 1 ano pós- ressecção cirúrgica (p <0,001). Um CACI superior a 6 triplicou a mortalidade no primeiro ano pós-cirurgia e estes doentes têm menos de 50% de probabilidade de estarem vivos um ano após a cirurgia. No capítulo 3, o nosso objectivo foi identificar uma proteína de superfície que se correlacionasse estatisticamente com o prognostico de doentes com adenocarcinoma do pâncreas e permitisse a distinção de subgrupos de doentes de acordo com as suas diferenças moleculares, perguntamo-nos ainda se essa proteína poderia ser um marcador de células-estaminais. No nosso trabalho anterior observamos que as células tumorais na circulação sanguínea apresentavam genes com características bifenotípica epitelial e mesenquimal, enriquecimento para genes de células estaminais (ALDH1A1 / ALDH1A2 e KLF4), e uma super-expressão de genes da matriz extracelular (colagénios, SPARC, e DCN) normalmente identificados no estroma de PDAC. Após a avaliação dos tumores primários com RNA-ISH, muitos dos genes identificados, foram encontrados co-localizando em uma sub-população de células na região basal dos ductos pancreáticos malignos. Além disso, observamos que estas células expressam o marcador SV2A neuroendócrino, e o marcador de células estaminais ALDH1A1/2. Em comparação com tumores negativos para SV2, os doentes com tumores SV2 positivos apresentaram níveis mais baixos de CA 19-9 (69% vs. 52%, p = 0,012), tumores maiores (> 4 cm, 23% vs. 10%, p = 0,0430), menor invasão de gânglios linfáticos (69% vs. 86%, p = 0,005) e tumores mais diferenciados (69% vs. 57%, p = 0,047). A presença de SV2A foi associada com uma sobrevida livre de doença mais longa (HR: 0,49 p = 0,009) bem como melhor sobrevida global (HR: 0,54 p = 0,018). Em conjunto, esta informação aponta para dois subtipos diferentes de adenocarcinoma do pâncreas, e estes subtipos co-relacionam estatisticamente com o prognostico de doentes, sendo este subgrupo definido pela presença do clone celular SV2A / ALDH1A1/2 positivo com características neuroendócrinas. No Capítulo 4, a expressão de SV2A no cancro do pâncreas foi validado em linhas celulares primárias. Demonstramos a heterogeneidade do adenocarcinoma do pâncreas de acordo com características clonais neuroendócrinas. Ao comparar as linhas celulares expressando SV2 com linhas celulares negativas, verificamos que as linhas celulares SV2+ eram mais diferenciadas, diferindo de linhas celulares SV2 negativas no que respeita a mutação KRAS, proliferação e a resposta à quimioterapia. No capítulo 5, perguntamo-nos se o clone celular SV2 positivo poderia explicar a resistência a quimioterapia observada em doentes. Observamos um aumento absoluto de clones celulares expressando SV2A, em múltiplas linhas de evidência - doentes, linhas de células primárias e xenotransplantes. Embora, tenhamos sido capazes de demonstrar que o adenocarcinoma do pâncreas é uma doença heterogénea, consideramos que a caracterização genética destes clones celulares expressando SV2A é de elevada importância. Pretendemos colmatar esta limitação com as seguintes estratégias: Após o tratamento com quimioterapia neoadjuvante na nossa coorte, realizamos microdissecação a laser das amostras primarias em parafina, de forma a analisar mutações genéticas observadas no adenocarcinoma pancreático; em segundo lugar, pretendemos determinar consequências de knockdown da expressão de SV2A em nossas linhas celulares seguindo-se o tratamento com gemicitabina para determinação do papel funcional de SV2A; finalmente, uma vez que os nossos esforços anteriores com um promotor - repórter e SmartFlare ™ falharam, o próximo passo será realizar RNA-ISH PrimeFlow™ seguido de FACS e RNA-seq para caracterização deste clone celular. Em conjunto, conseguimos provar com várias linhas de evidência, que o adenocarcinoma pancreático é uma doença heterogénea, definido por um clone de células que expressam SV2A, com características neuroendócrinas. A presença deste clone no tecido de doentes correlaciona-se estatisticamente com o prognostico da doença, incluindo sobrevida livre de doença e sobrevida global. Juntamente com padrões de proliferação e co-expressão de ALDH1A1/2, este clone parece apresentar um comportamento de células estaminais e está associado a resistência a quimioterapia, uma vez que a sua expressão aumenta após agressão química, quer em doentes, quer em linhas de células primárias.----------------------------- ABSTRACT: Currently, the only chance of cure for patients with pancreatic adenocarcinoma is surgical resection, at the beginning of my thesis studies, we asked if the classical clinicopathologic predictors of outcome could be validated in a large cohort of patients with early stage pancreatic cancer and if other clinical predictors could have a role on deciding which patients would benefit from surgery. In chapter 2, we found that up to 30% of patients die within the first year after curative intent surgery for pancreatic adenocarcinoma. We aimed at determining pre-operative factors that would correlate with early mortality following resection for pancreatic cancer using a statistically validated tool, the Charlson-Age Comorbidity Index (CACI). We found that a CACI score greater than 4 was predictive of increased length of stay (p<0.001), post-operative complications (p=0.042), and mortality within 1-year of pancreatic resection (p<0.001). A CACI score of 6 or greater increased 3-fold the odds of death within the first year. Patients with a high CACI score have less than 50% likelihood of being alive 1 year after surgery. In chapter 3 we aimed at identifying a surface protein that correlates with patient’s outcome and distinguishes sub-groups of patients according to their molecular differences and if this protein could be a cancer stem cell marker. The most abundant class of circulating tumor cells identified in our previous work was found to have biphenotypic features of epithelial to mesenchymal transition, enrichment for stem-cell associated genes (ALDH1A1/ALDH1A2 and KLF4), and an overexpression of extracellular matrix genes (Collagens, SPARC, and DCN) normally found in the stromal microenvironment of PDAC primary tumors. Upon evaluation of matched primary tumors with RNA-ISH, many of the genes identified were found to co-localize in a sub-population of cells at the basal region of malignant pancreatic ducts. In addition, these cells expressed the neuroendocrine marker SV2A, and the stem cell marker ALDH1A1/2. Compared to SV2 negative tumors, patients with SV2 positive tumors were more likely to present with lower CA 19-9 (69% vs. 52%, p = 0.012), bigger tumors (size > 4 cm, 23% vs. 10%, p= 0.0430), less nodal involvement (69% vs. 86%, p = 0.005) and lower histologic grade (69% vs. 57%, p = 0.047). The presence of SV2A expressing cells was associated with an improved disease free survival (HR: 0.49 p=0.009) and overall survival (HR: 0.54 p=0.018) and correlated linearly with ALDH1A2. Together, this information points to two different sub-types of pancreatic adenocarcinoma, and these sub-types correlated with patients’ outcome and were defined by the presence of a SV2A/ ALDH1A1/2 expressing clone with neuroendocrine features. In Chapter 4, SV2A expression in cancer was validated in primary cell lines. We were able to demonstrate pancreatic adenocarcinoma heterogeneity according to neuroendocrine clonal features. When comparing SV2 expressing cell lines with SV2 negative cell lines, we found that SV2+ cell lines were more differentiated and differ from SV2 negative cell lines regarding KRAS mutation, proliferation and response to chemotherapy. In Chapter 5 we aimed at determining if this SV2 positive clone could explain chemoresistance observed in patients. We found an absolute increase in SV2A expressing cells, with multiple lines of evidence, in patients, primary cell lines and xenografts. Although, we have been able to show evidence that pancreatic adenocarcinoma is a heterogeneous disease, our findings warrant further investigation. To further characterize SV2A expressing clones after treatment with neoadjuvant chemotherapy in our cohort, we have performed laser capture microdissection of the paraffin embedded tissue in this study and will analyze the tissue for known genetic mutations in pancreatic adenocarcinoma; secondly, we want to know what will happen after knocking down SV2A expression in our cell lines followed by treatment with gemcitabine to determine if SV2A is functionally important; finally, since our previous efforts with a promoter – reporter and SmartFlare™ have failed, we will utilize a novel PrimeFlow™ RNA-ISH assay followed by FACS and RNA sequencing to further characterize this cellular clone. Overall our data proves, with multiple lines of evidence, that pancreatic adenocarcinoma is a heterogeneous disease, defined by a clone of SV2A expressing cells, with neuroendocrine features. The presence of this clone in patients’ tissue correlates with patient’s disease free survival and overall survival. Together with patterns of proliferation and ALDH1A1/2 co-expression, this clone seems to present a stem-cell-like behavior and is associated with chemoresistance, since it increases after chemotherapy, both in patients and primary cell lines.

Clinical decisions in breast cancer, a heterogenous disease

RESUMO: Introdução: Tratamento do carcinoma da mama Este trabalho inicia-se com a história do tratamento do carcinoma da mama, desde os primeiros documentos que descrevem doentes com carcinoma da mama até 1950. Desde 1950 até 2000 o diagnóstico, risco e as modalidades terapêuticas usadas no tratamento das doentes são mais detalhadas com ênfase nas terapêuticas locais, regionais e sistémicas. Parte 1:Quem tratar com terapêutica sistémica adjuvante Capítulo 1: A classificação TNM não está morta no carcinoma da mama Tem sido dito que a classificação TNM não é adequada para usar como ferramenta de prognóstico e decisão terapêutica no carcinoma da mama, especialmente em doentes com carcinoma detectado através de rastreio, que tem geralmente menores dimensões. A razão desta classificação não ser adequada prendese com o facto de não estarem incluidos parâmetros biológicos na classificação TNM atual. Pusemos a hipótese de que numa população com alta percentagem de carcinoma da mama não detectado em exames de rastreio, com uma mediana de idade baixa e com alta percentagem de estadios II e III, o estadiamento clássico, pela classificação TNM, é mais descriminatório que as características biológicas na determinação do prognóstico. Para isto analisámos uma população de doentes com carcinoma da mama tratados consecutivamente na mesma instituição, durante 10 anos. Caracterizámos os fatores de prognóstico do estadiamento clássico incluídos na classificação TNM e as variantes biológicas, presentemente não incluídas na classificação TNM. Quantificámos a capacidade de cada um dos factores de prognóstico para para prever a sobrevivência. A população é de 1699 doentes com carcinoma da mama que foram tratádos com terapêutica sistémica adjuvante. Individualmente, cada um dos fatores de prognostico, clássicos ou biológicos, diferem significativamente entre doentes que sobrevivem e que não sobrevivem. Explicitamente, como previsto, doentes com tumores maiores, envolvimento dos gânglios axilares, estadios TNM mais avançados, que não expressam recetor de esrogéneo, com amplificação do gene Her2, triplos negativos ou de menor diferenciação têm menor sobrevida. Na análise multivariada, só os fatores de prognostico da classificação TNM, o grau histológico e a amplificação do gene Her2, esta última com menos significância estatistica são preditores independentes de sobrevivência. Capítulo 2: Em busca de novos factores de prognostico: Poder preditivo e mecanismo das alterações de centrossomas em carcinoma da mama Compilámos inúmeros grupos de experiências de genómica feitas em tumores primários de doentes com carcinoma da mama para as quais existe informação prognóstica. Estas experiências são feitas com o objectivo de descobrir novos factores de prognóstico. Reanalisámos os dados, repetindo a mesma pergunta: Quais são os genes com expressão diferencial estatisticamente significativa entre doentes que recaíram e doentes que não recaíram. Identificámos 65 genes nestas condições e o MKI67, o gene que codifica a proteina Ki67, estava nesse grupo. Identificámos vários genes que se sabe estarem envolvidos no processo de agregação de centrossomas. O gene que considerámos mais promissor foi a kinesina KiFC1, que já tinha sido identificada como regulador da agregação de centrossomas. Anomalias cetrossomais numéricas e estruturais têm sido observadas em neoplasias. Há dados correlacionando anolmalias centrossomais estruturais e e numéricas com o grau de malignidade e os eventos precoces da carcinogénese. Mas estas anomalias centrossomais têm um peso para a célula que deve adapatar-se ou entrará em apoptose. Os nossos resultados sugerem que existe um mecanismo adaptativo, a agregação de centrossomas, com impacto prognóstico negativo. O nosso objetivo foi quantificar o valor prognóstico das anomalias centrossomais no carcinoma da mama. Para isto usámos material de doentes dos quais sabemos a história natural. Avaliámos os genes de agregação de centrossomas, KIFC1 e TACC3, nas amostras tumorais arquivadas em parafina: primeiro com PCR (polymerase chain reaction) quantitativa e depois com imunohistoquímica (IHQ). Apenas a proteína KIFC1 foi discriminatória em IHQ, não se tendo conseguido otimizar o anticorpo da TACC3. Os níveis proteicos de KIFC1 correlacionam-se com mau prognóstico. Nas doentes que recaíram observámos, no tumor primário, maior abundância desta proteína com localização nuclear. Em seguida, demonstrámos que a agregação de centrossomas é um fenómeno que ocorre in vivo. Identificámos centrossomas agregados em amostras de tumores primários de doentes que recaíram. Tecnicamente usámos microscopia de fluorescência e IHQ contra proteínas centrossomais que avaliámos nos tumores primários arquivados em blocos de parafina. Observámos agregação de centrossomas num pequeno número de doentes que recaíram, não validámos, ainda, este fenótipo celular em larga escala. Parte 2: Como tratar com terapêutica sistémica os vários subtipos de carcinoma da mama Capítulo 3: Quantas doenças estão englobadas na definição carcinoma da mama triplo negativo? (revisão) O carcinoma da mama triplo negativo é um tumor que não expressa três proteínas: recetor de estrogénio, recetor de progesterona e o recetor do fator de crescimento epidermico tipo 2 (Her2). As doentes com estes tumores não são ainda tratadas com terapêutica dirigida, possivelmente porque esta definição negativa não tem ajudado. Sabemos apenas as alterações genéticas que estes tumores não têm, não as que eles têm. Talvez por esta razão, estes tumores são o subtipo mais agressivo de carcinoma da mama. No entanto, na prática clínica observamos que estas doentes não têm sempre mau prognóstico, além de que dados de histopatologia e epidemiologia sugerem que esta definição negativa não está a capturar um único subtipo de carcinoma da mama, mas vários. Avaliámos criticamente esta evidência, clínica, histopatológica, epidemiológica e molecular. Há evidência de heterogeneidade, mas não é claro quantos subtipos estão englobados nesta definição de carcinoma da mama triplo negativo. A resposta a esta pergunta, e a identificação do fundamento molecular desta heterogeneidade vai ajudar a melhor definir o prognóstico e eventualmente a definir novos alvos terapêuticos nesta população difícil. Capítulo 4: Terapêuica sistémica em carcinoma da mama triplo negativo (revisão) A quimioterapia é a única terapêutica sistémica disponível para as doentes com carcinoma da mama triplo negativo, ao contrário dos outros dois subtipo de carcinoma da mama que têm com a terapêutica antiestrogénica e anti Her2, importantes benefícios. Apesar de terem surgido várias opções terapêuticas para estes doentes nennhuma terapêutica dirigida foi validada pelos ensaios clínicos conduzidos, possivelmente porque a biologia deste carcinoma ainda não foi elucidada. Muitos ensaios demonstram que os tumores triplos negativos beneficiam com quimioterapia e que as mais altas taxas de resposta patológica completa à terapêutica neoadjuvante são observadas precisamente nestes tumors. A resposta patológica completa correlaciona-se com a sobrevivência. Estamos a estudar regimes adjuvantes específicos para doentes com estes tumors, mas, neste momento, regimes de terceira geração com taxanos e antraciclinas são os mais promissores. O papel de subgrupos de fármacos específicos, como os sais de platina, mantémse mal definido. Quanto às antraciclinas e taxanos, estes grupos não mostraram beneficio específico em carcinoma da mama triplo negativo quando comparado com os outros subtipos. Os próprios carcinomas da mama triplos negativos são heterogéneos e carcinomas da mama basais triplos negativos com elevada taxa de proliferação e carcinomas da mama triplos negativos surgidos em doentes com mutação germinal BRCA1 poderão ser mais sensíveis a sais de platino e menos sensíveis a taxanos. Como a definição molecular ainda não foi explicada a busca de terapêutica dirigida vai continuar. Capítulo 5: Ensaio randomizado de fase II do anticorpo monoclonal contra o recetor do fator de crescimento epidérmico tipo 1 combinado com cisplatino versus cisplatino em monoterapia em doentes com carcinoma da mama triplo negativo metastizado O recetor do fator de crescimento epidérmico tipo 1 está sobre expresso nos tumores das doentes com carcinoma da mama triplo negativo metastizado, um subtipo agressivo de carcinoma da mama. Este ensaio investigou a combinação de cetuximab e cisplatino versus cisplatino isolado em doentes deste tipo. Doentes em primeira ou segunda linha de terapêutica para doença metastizada foram randomizadas, num sistema de 2 para 1, para receber até 6 ciclos da combinação de cisplatino e cetuximab ou cisplatino isolado. Às doentes randomizadas para o braço de monoterapia podiamos, após progressão, acrescentar cetuximab ou tratá-las com cetuximab isolado. O objetivo primário foi a taxa de resposta global. Os objetivos secundários foram a sobrevivência livre de doença, a sobrevivência global e o perfil de segurança dos fármacos. A população em análise foram 115 doentes tratadas com a combinação e 58 doentes tratadas com cisplatino em monoterapia, 31 destas em quem se documentou progressão passaram a ser tratadas com um regime que incluía cetuximab, isolado ou em combinação. A taxa de resposta global foi de 20% no braço da combinaçao e de 10% no braço da monoterapia (odds ratio, 2.13). A sobrevivência livre de doença foi de 3.7 meses no braço da combinação e de 1.5 meses no braço em monoterapia (hazard ratio, 0.67). A sobrevivência global foi de 12.9 meses no braço da combinação versus 9.4 meses no braço de cisplatino. Conclui-se que, apesar de não ter sido alcançado o objectivo primário, acrescentar cetuximab, duplica a resposta e prolonga tanto a sobrevivência livre de doença como a sobrevivência global. Capítulo 6: Bloquear a angiogénese para tratar o carcinoma da mama (revisão) A angiogénese é uma característica que define a neoplasia, porque tumores com mais de 1mm precisam de formar novos vasos para poderem crescer. Desde que se descobriram as moléculas que orquestram esta transformação, que se têm procurado desenvolver e testar fármacos que interfiram com este processo. No carcinoma da mama o bevacizumab foi o primeiro fármaco aprovado pela FDA em primeira linha para tratar doença metastática. Depois foram estudados um grupo de inibidores de tirosina cinase associados aos recetores transmembranares envolvidos na angiogénese como o VEGFR, PDGFR, KIT, RET, BRAF e Flt3: sunitinib, sorafenib, pazopanib e axitinib Neste capítulo, analisaram-se e resumiram-se os dados dos ensaios clínicos das drogas anti-angiogénicas no tratamaneto do carcinoma da mama. Os ensaios de fase III do bevacizumab em carcinoma da mama mostraram uma redução na progressão de doença de 22 a 52% e aumento da sobrevivência livre de doença de 1.2 a 5.5 meses mas nunca foi demonstrado prolongamento de sobrevivência. Os ensaios de fase III em carcinoma da mama adjuvante com bevacizumab são dois e foram ambos negativos. O ensaio de fase III com o inibidor da tirosina cinase, sunitinib foi negativo, enquanto que os ensaios de fase II com os inibidores da tirosina cinase sorafenib e pazopanib melhoraram alguns indicadores de resposta e sobrevivência. A endostatina foi testada no contexto neoadjuvante com antraciclinas e melhorou a taxa de resposta, mas, mais ensaios são necessários para estabelecer este fármaco. A maioria dos ensaios clínicos dos agentes antiangiogénicos em carcinoma da mama reportaram aumento da taxa de resposta e de sobrevivência livre de doença mas nunca aumento da sobrevivência global quando comparado com quimioterapia isolada o que levou ao cepticismo a que assistimos atualmente em relação ao bloqueio da angiogénese. Ensaios clínicos selecionados em doentes específicas com objetivos translacionais relacionados com material biológico colhido, preferefencialmente em diferentes intervalos da terapêutica, serão cruciais para o bloqueio da angiogénese sobreviver como estratégia terapêutica em carcinoma da mama. Capítulo 7: A resposta à hipoxia medeia a resistência primária ao sunitinib em carcinoma da mama localmente avançado O sunitinib é um fármaco antiangiogénico que nunca foi avaliado isolado em doentes com carcinoma da mama não tratadas. O nosso objetivo foi caracaterizar a atividade do sunitinib isolado e em combinação com o docetaxel em carcinoma da mama não tratado, localmente avançado ou operável, mas de dimensão superior a 2 cm, para compreender os mecanismos de resposta. Doze doentes foram tratadas com duas semanas iniciais de sunitinib seguido de quatro ciclos de combinação de sunitinib e docetaxel. A resposta, a reistência e a toxicidade foram avaliadas de acordo com parametros clínicos, ressonância magnética nuclear, tomografia de emissão de positrões, histopatologia e perfis de expressão genómica. Detetámos resistência primária ao sunitinib na janela inicial de duas semanas, evidenciada em quatro doentes que não responderam. À data da cirurgia, cinco doentes tinham tumor viável na mama e axila, quatro tinahm tumor viável na mama e três foram retiradas do ensaio. Não houve respostas patológicas completas. A comparação dos perfis de expressão genómica entre os respondedores e os não respondedores, aos quinze dias iniciais, permitiu-nos identificar sobre expressão de VEGF e outras vias angiogénicas nos não respondedores. Especificamente, em tumores resistentes ao sunitinib isolado detectámos uma resposta transcricional à hipoxia caracterizada por sobre expressão de vários dos genes alvo do HIF1α. Neste ensaio de sunitinib isolado em doentes não tratadas com carcinoma da mama localmente avançado, encontrámos evidência molecular de resistência primária ao sunitinib possivelmente mediada por sobre expressão de genes que respondem à hipoxia. Parte 3: Quando parar a terapêutica sistémica às doentes com carcinoma da mama Capítulo 8: Agressividade terapêutica ns últimos três meses de vida num estudo retrospetivo dum centro único Incluímos todos os adultos que morreram com tumores sólidos na instituição em 2003 e foram tratados com quimioterapia para tratar neoplaias metastizadas. Colhemos dados detalhados relacionados com quimioterapia e toxicidade nos últimos três meses de vida a partir do processo clínico. Trezentas e dezanove doentes foram incluídos, a mediana de idade foi 61 anos. A mediana de sobrevivência de doença metastática foi de 11 meses. 66% (211) dos doentes foram tratados com QT nos últimos 3 meses de vida, 37% foram tratados com QT no úlimo mês de vida e 21% nas últimas duas semanas. Nos doentes que foram tratados com QT nos últimos três meses de vida, 50% começaram um novo regime terapêutico neste período e 14% começaram um novo regime no último mês. Identificámos como determinantes de tratamento com QT no fim de vida a idade jovem, o carcinoma da mama, do ovário e do pâncreas. Concluímos que administrámos QT no fim de vida frequentemente e iniciámos novos regimes terapêuticos no último mês de vida em 14% dos casos. Precisamos de aprofundar este trabalho para compreender se esta atitude agressiva resulta em melhor paliação de sintomas e qualidade de vida no fim de vida dos doentes com neoplasias disseminadas. Capítulo 9: O tratamento do carcinoma da mama no fim de vida está a mudar? Quisémos caracterizar a modificação da tendência no uso de QT e de estratégias paliativas no fim de vida das doentes com carcinoma da mama em diferentes instituições e em intervalos de tempo diferentes. Para isto selecionámos doentes que morreram de carcinoma da mama durante 6 anos, entre 2007 e 2012, num hospital geral e comparámos com as doentes que morreram de carcinoma da mama em 2003 num centro oncológico. Avaliámos um total de 232 doentes. O grupo mais recente tem 114 doentes e o grupo anterior tem 118 doentes. Usámos estatística descritiva para caracterizar QT no fim de vida e o uso de estratégias paliativas. Ambas as coortes são comparáveis em termos das características do carcinoma da mama. Observámos aumento do uso de estatégias paliativas: consulta da dor, consulta de cuidados paliativos e radioterapia paliativa no cuidado das doentes com carcinoma da mama metastizado. Evidenciámos aumento do número de mortes em serviços de cuidados paliativos. No entanto, a QT paliativa continua a ser prolongada até aos últimos meses de vida, embora tenhamos mostrado uma diminuição desta prática. Outros indicadores de agressividade como a admissão hospitalar também mostraram diminuição. Confirmámos a nossa hipótese de que há maior integração da medicina paliativa multidisciplinar e menos agressividade na terapêutica sistémica das doentes com carcinoma da mama nos últimos meses de vida. Chapter 10: Porque é que os nossos doentes são tratados com quimioterapia até ao fim da vida? (editorial) Este capítulo começa por dar o exmeplo duma jovem de 22 anos que viveu três meses após começar QT paliatva. Este caso epitomiza a futilidade terapêutica e é usado como ponto de partida para explorar as razões pelas quais administramos QT no fim de vida aos doentes quando é inútil, tóxica, logisticamente complexa e cara. Será que estamos a prescrever QT até tarde demais? Os oncologistas fazem previsões excessivamente otimistas e têm uma atitude pró terapêutica excessiva e são criticados por outros intervenientes nas instituições de saúde por isto. Crescentemente doentes, familiares, associações de doentes, definidores de políticas de saúde, jornalistas e a sociedade em geral afloram este tema mas tornam-se inconsistentes quando se trata dum doente próximo em que se modifica o discurso para que se façam terapêuticas sitémicas agressivas. Há uma crescente cultura de preservação da qualidade de vida, paliação, abordagem sintomática, referenciação a unidades de cuidados paliativos e outros temas do fim de vida dos doentes oncológicos terminais. Infelizmente, este tema tem ganhado momentum não porque os oncologistas estejam a refletir criticamente sobre a sua prática, mas porque os custos dos cuidados de saúde são crescentes e incomportáveis. Seja qual fôr o motivo, as razões que levam os oncologistas a administrar QT no fim de vida devem ser criticamente elucidadas. Mas há poucos dados para nos guiar nesta fase delicada da vida dos doentes e os que existem são por vezes irreconciliáveis, é uma revisão destes dados que foi feita neste capítulo. Conclusão: A abordagem do carcinoma da mama no futuro? Na conclusão, tenta-se olhar para o futuro e prever como será a tomada a cargo dum doente com carcioma da mama amanhã. Faz-se uma avaliação das várias àreas desde prevenção, rastreio, suscetibilidade genética e comportamental e terapêutica. Na terapêutica separa-se a terapêutica locoregional, sistémica adjuvante e da doença metastizada. Nos três últimos parágrafos a história duma mulher com um carcinoma localmente avançado que sobre expressa o recetor Her2, serve como ilustração de como devemos estar preparados para incorporar evolução, heterogeneidade e dinamismo no cuidado de doentes com carcinoma da mama. -------------------------------------------------------------------------------------------------- ABSTRACT: Introduction: Breast cancer care in the past This work starts with an overview of the treatment of breast cancer (BC). From the first reports of patients ill with BC until 1950. From 1950 until 2000, there is a more detailed account on how BC patients were treated with emphasis on the different modalities, local, regional and systemic treatments and their evolution. Part 1: Who to treat with adjuvant systemic therapy? Chapter 1: TNM is not dead in breast cancer It has been said that the current TNM staging system might not be suitable for predicting breast cancer (BC) outcomes and for making therapeutic decisions, especially for patients with screen detected BC which is smaller. The reason for this is also due to the non inclusion of tumor biology parameters in the current TNM system. We hypothesize that in a population where there is still a large abundance of non screen detected BC, with a low median age of incidence and abundance of high TNM staged lesions, biology is still second to classical staging in predicting prognosis. We analyzed a population of consecutive BC patients from a single institution during ten years. We characterized current established prognostic factors, classical staging variables included in the current TNM staging system and biological variables, currently not included in the TNM system. We quantified the capacity of individual prognostic factors to predict survival. We analyzed a population of 1699 consecutive BC patients. We found that individually both the TNM system prognostic factors and the biological prognostic factors are differing among BC survivors and dead patients in a statistically significant distribution. Explicitly, patients with larger tumors, positive nodes, higher stage lesions, ER negative, HER2 positive, TN or lower differentiation tumors show decreased survival. In the multivariate analysis we can conclude that in a population such as ours classical TNM staging variables, irrespective of tumor biological features, are still the most powerful outcome predictors. Chapter 2: Defining breast cancer prognosis: The predictive power and mechanism of centrosome alterations in breast cancer We performed a systematic analysis of the literature and compiled an extensive data set of gene expression data originated in primary tumours of BC patients with prognostic information. We analysed this data seeking for genes consistently up or down regulated in poor prognosis BC, i.e. that relapsed after initial treatment. In the course this bioinformatics analysis our lab identified 65 genes statistically significant across multiple datasets that can discriminate between relapsed and non-relapsed BC patients. Among the identified genes, we have detected genes such as MKI67, a marker of mitotic activity which is routinely used in the clinic. Unexpectedly, we also discovered several genes found to be involved in centrosome clustering, The most prominent of these is the kinesin KIFC1, also called HSET, and previously identified as regulator of centrosome clustering. Centrosome abnormalities (numerical, structural) have been observed in cancer. Indeed, compelling data has shown that cells from many cancers have multiple and abnormal centrosomes, that are either correlated with tumour malignancy or considered an early tumorigenesis event. However, extra centrosomes come at a cost and cells must be able to handle such abnormalities or otherwise die. Thus our results suggested a new mechanism of breast cancer progression with negative prognostic value. We aimed at quantifying the predictive power of centrosome clustering in BC clinical setting and at detecting this process in BC patient material. We validated the centrosome clustering genes KIFC1 and TACC3 in formalin fixed paraffin embedded (FFPE) BC patient material, using quantitative real-time PCR (RT-qPCR) technology. Our results indicate that the tested KIFC1 has a clear IHC signal (1) and that the protein expression patterns and levels correlate with prognosis, with relapsing patients having increased expression and nuclear localisation of this kinesin (2). Next we were able to show that centrosome clustering does occur in vivo. We identified centrosome amplification and clustering in breast cancer samples, and we established a fluorescence microscopy-based IHC approach by staining FFPE samples with centrosomal markers. Using this approach we have observed centrosome amplification and clustering in a small set of poor prognosis samples. By expanding the number of samples in which we have characterised the number of centrosomes, we were able to confirm our preliminary observation that centrosomes are clustered in relapsed BC. Part 2: How to treat breast cancer subtypes? Chapter 3: How many diseases is triple negative breast cancer? (review) Triple negative breast cancer is a subtype of breast cancer that does not express the estrogen receptor, the progesterone receptor and the epidermal growth factor receptor type 2 (Her2). These tumors are not yet treated with targeted therapies probably because no positive markers have been described to reliably classify them - they are described for what they are not. Perhaps for this reason, they are among the most aggressive of breast carcinomas, albeit with very heterogenous clinical behavior. The clinical observation that these patients do not carry a uniformly dismal prognosis, coupled with data coming from pathology and epidemiology, suggests that this negative definition is not capturing a single clinical entity, but several. We critically evaluate this evidence in this paper, reviewing clinical and epidemiological data, as well as molecular data. There is evidence for heterogeneity, but it is not clear how many diseases are grouped into triple negative breast cancer. Answering this question, and identifying the molecular basis of heterogeneity will help define prognosis and, eventually, the identification of new targeted therapies. Chapter 4: Systemic treatment for triple negative breast cancer (review) Chemotherapy remains the backbone of treatment for triple negative breast cancer (TNBC). Despite the appearance of new targeted and biologic agents there has been no targeted therapy validated for TNBC, possibly because the biology of TNBC has not been conclusively elucidated. Many studies have shown that TNBC derive significant benefit of chemotherapy in the neoadjuvant, adjuvant and metastatic treatment, possibly more benefit than other BC subtypes. Neoadjuvant chemotherapy studies have repeatedly shown higher response rates in TNBC than non-TNBC. Pathologic complete response has been shown to predict improved long term outcomes in BC. Although specific adjuvant regimens for TNBC are under study, third generation chemotherapy regimens utilizing dose dense or metronomic polychemotherapy are among the most effective tools presently available. The role of specific chemotherapy agents, namely platinum salts, in the treatment of TNBC remains undefined. Taxanes and anthracyclines are active in TNBC and remain important agents, but have not shown specific benefit over non-TNBC. TNBC is itself a heterogeneous group in which subgroups like basal like BC defined by higher proliferation and including those TNBC arising in BRCA1 mutation carriers may be more sensitive to platinum agents and relatively less sensitive to taxanes. The molecular characterization of TNBC is lacking and therefore the search for targeted therapy is still ongoing. Chapter 5: Randomized phase II study of the anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody cetuximab with cisplatin versus cisplatin alone in patients with metastatic triple-negative breast cancer Epidermal growth factor receptor is overexpressed in metastatic triple-negative breast cancers, an aggressive subtype of breast cancer. Our randomized phase II study investigated cisplatin with or without cetuximab in this setting. Patients who had received no more than one previous chemotherapy regimen were randomly assigned on a 2:1 schedule to receive no more than six cycles of cisplatin plus cetuximab or cisplatin alone. Patients receiving cisplatin alone could switch to cisplatin plus cetuximab or cetuximab alone on disease progression. The primary end point was overall response rate (ORR). Secondary end points studied included progressionfree survival (PFS), overall survival (OS), and safety profiles. The full analysis set comprised 115 patients receiving cisplatin plus cetuximab and 58 receiving cisplatin alone; 31 patients whose disease progressed on cisplatin alone switched to cetuximab-containing therapy. The ORR was 20% with cisplatin plus cetuximab and 10% with cisplatin alone (odds ratio, 2.13). Cisplatin plus cetuximab resulted in longer PFS compared with cisplatin alone (median, 3.7 v 1.5 months; hazard ratio, 0.67. Corresponding median OS was 12.9 versus 9.4 months. While the primary study end point was not met, adding cetuximab to cisplatin doubled the ORR and appeared to prolong PFS and OS, warranting further investigation in mTNBC. Chapter 6: Blocking angiogenesis to treat breast cancer (review) Angiogenesis is a hallmark of cancer because tumors larger than 1mm need new vessels to sustain their growth. Since the discovery of the molecular players of this process and some inhibitors, that angiogenesis became a promising therapeutic target. Bevacizumab was the first molecular-targeted antiangiogenic therapy approved by the FDA and is used as first-line therapy in metastatic breast cancer. A second class of approved inhibitors (sunitinib, sorafenib, pazopanib and axitinib) include oral small-molecule tyrosine kinase inhibitors that target vascular endothelial growth factor receptors, platelet-derived growth factor receptors, and other kinases including KIT, Ret, BRAF and Flt-3, but none of these have gained approval to treat breast cancer. This review analyzes and summarizes data from clinical trials of anti-angiogenic agents in the treatment of BC. Phase III trials of bevacizumab in advanced BC have demonstrated a reduction in disease progression (22–52%), increased response rates and improvements in progression-free survival of 1.2 to 5.5 months, but no improvements in OS. Bevacizumab phase III trials in early BC have both been negative. Bevacizumab combined with chemotherapy is associated with more adverse events. Phase III trials of the tyrosine kinase inhibitor sunitinib were negative, while randomized phase II trials of sorafenib and pazopanib have improved some outcomes. Endostatin has been tested in neoadjuvant clinical trials in combination with anthracyclinebased chemotherapy in treatment-naive patients and has increased the clinical response rate, but more trials are needed to establish this drug. Most trials of anti-angiogenic agents in BC have reported improved RR and PFS but no increase in OS compared to chemotherapy alone, leading to skepticism towards blocking angiogenesis. Selected trials in selected BC populations with translational endpoints related to harvested tumor tissue and other biological material samples, preferentially at several timepoints, will be crucial if antiangiogenesis is to survive as a strategy to treat BC. Chapter 7: Does hypoxic response mediate primary resistance to sunitinib in untreated locally advanced breast cancer? The antiangiogenic drug sunitinib has never been evaluated as single agent in untreated BC patients. We aimed to characterize the activity of sunitinib, alone and with docetaxel, in untreated locally advanced or operable BC, and, to uncover the mechanisms of response. Twelve patients were treated with an upfront window of sunitinib followed by four cycles of sunitinib plus docetaxel. Response, resistance and toxicity were evaluated according to standard clinical parameters, magnetic resonance imaging, positron emission tomography, pathology characterization and gene expression profiling. We detected primary resistance to sunitinib upfront window in untreated BC, as evidenced by four non-responding patients. At surgery, five patients had viable disease in the breast and axilla, four had viable tumor cells in the breast alone and three were taken off study due to unacceptable toxicity and thus not evaluated. Early functional imaging was useful in predicting response. There were no pathologic complete responses (pCR). Comparison of gene expression profiling tumor data between early responders and non-responders allowed us to identify upregulation of VEGF and angiogenic pathways in non responders. Specifically, in tumors resistant to the single-agent sunitinib we detected a transcriptional response to hypoxia characterized by over-expression of several HIF1α target genes. In this report of single-agent sunitinib treatment of untreated localized BC patients, we found molecular evidence of primary resistance to sunitinib likely mediated by up-regulation of hypoxia responsive genes. Part 3: When to stop systemic treatment of breast cancer patients? Chapter 8: The aggressiveness of cancer care in the last three months of life: a retrospective single centre analysis. All adult patients with solid tumors who died in our hospital in 2003 and received chemotherapy for advanced cancer, were included. Detailed data concerning chemotherapy and toxicity, in the last three months of life, were collected from patientsʼ clinical charts. A total of 319 patients were included. Median age was 61 years. Median time from diagnosis of metastatic disease to death was 11 months. The proportion of patients who received chemotherapy in the last three months of life was 66% (n=211), in the last month 37% and in the last two weeks 21%. Among patients who received chemotherapy in the last three months of life, 50% started a new chemotherapy regimen in this period and 14% in the last month. There was an increased probability of receiving chemotherapy in the last three months of life in younger patients and in patients with breast, ovarian and pancreatic carcinomas. There was a large proportion of patients who received chemotherapy in the last three months of life, including initiation of a new regimen within the last 30 days. Thus, further study is needed to evaluate if such aggressive attitude results in better palliation of symptoms at the end of life. Chapter 9: Is breast cancer treatment in the end of life changing? We aimed to characterize the shifting trends in use of anti-cancer chemotherapy and palliative care approaches in the end of life of BC patients in different institutions and times. For this, we selected women that died of BC during six years, from 2007 to 2012, and were treated in a central acute care general hospital and compared it with the BC patients that died in 2003 and were treated in a large cancer center. We analyzed a total of 232 patients: the more recent group has 114 women and the older cohort has 118. We used descriptive statistics to characterize CT in the EoL and use of palliative care resources. Both populations were similar in terms of BC characteristics. We observed more palliative care resources, pain clinic, palliative care teams and palliative radiotherapy, involved in the care of MBC patients and a shift towards more deaths at hospices. Systemic anti cancer treatments continue to be prolonged until very late in patients’ lives, notwithstanding, we could show a decrease in the use of such treatments. Other indicators of aggressiveness, namely hospital admissions, also show a decrease. We confirmed our hypothesis that there is more integration of multidisciplinary palliative care and less aggressiveness in the treatment of metastatic cancer patients, specifically, use of palliative anti-cancer treatment and hospital admissions. Nonetheless, we use systemic therapy until too late with underutilization of palliative medicine. Chapter 10: Why do our patients get chemotherapy until the end of life? (editorial) The editorial starts with a clinical case of a 21 year old patient that lives three months after starting palliative chemotherapy for the first time, a case that illustrates therapeutic futility at the end of life. Why are we not ceasing chemotherapy when it is useless, toxic, logistically complex and expensive? Are we prescribing chemotherapy until too late in solid tumor patientsʼ lives? Medical oncologists have overly optimistic predictions and, excessive, treatment-prone attitude and they are criticized by other health care providers for this. Increasingly, patients, their families, advocacy groups, policy makers, journalists and society at large dwell on this topic, which is a perplexing conundrum, because sometimes they are the ones demanding not to stop aggressive systemic anticancer treatments, when it comes to their loved ones. There is a growing culture of awareness toward preserving quality of life, palliative care, symptom-directed care, hospice referral and end of life issues regarding terminal cancer patients. Sadly, this issue is gaining momentum, not because oncologists are questioning their practice but because health care costs are soaring. Whatever the motive, the reasons for administering chemotherapy at the end of life should be known. There are few and conflicting scientific data to guide treatments in this delicate setting and we review this evidence in this paper. Conclusion: What is the future of breast cancer care? This work ends with a view into the future of BC care. Looking into the different areas from prevention, screening, hereditary BC, local, regional and systemic treatments of adjuvant and metastatic patients. The last three paragraphs are a final comment where the story of a patient with Her2 positive locally advanced breast cancer is used as paradigm of evolution, heterogeneity and dynamism in the management of BC.