The role of arl13b in cilia length regulation and in zebrafish development

RESUMO: Arl13b é uma importante proteína ciliar, presente em cílios primários e cílios móveis. Ratinhos mutantes para Arl13b têm comprimento dos cílios reduzido e defeitos nos B-túbulos dos cílios. Como consequência destes fenótipos, deficiências na Arl13b originam, em modelos animais, várias doenças congénitas, incluindo problemas no estabelecimento do eixo esquerda-direita, malformações cerebrais e deformações corporais. Nos seres humanos, deficiências na Arl13b levam a uma doença crónica congénita chamada Síndrome de Joubert. Por outro lado, a sobreexpressão de Arl13b origina cílios mais longos, no entanto existe uma ausência da caracterização dos fenótipos celulares e durante o desenvolvimento embrionário. Neste trabalho, quisemos explorar o efeito da sobre-expressão de Arl13b em embriões de peixezebra. Descobrimos que, ao nível ciliar, a sobre-expressão de Arl13b nas células aumenta o comprimento ciliar em cílios primários e móveis, no entanto, a esses cílios falta adequada acetilação da alfa-tubulina no citoesqueleto feito por microtúbulos. Os nossos resultados mostraram que esse efeito é específico de Arl13b sobre-expressão e quando se manipularam as enzimas responsáveis pela acetilação (Mec17) e pela de-acetilação (HDAC6) encontrámos uma sinergia potencial com ambas. Testámos ainda, que o aumento no comprimento ciliar não estava causalmente relacionado com a falta de acetilação, ou seja, os cílios com menos acetilação não eram necessariamente os mais longos. Também mostrámos que a sobre-expressão de Arl13b é capaz de restaurar o comprimento dos cílios em mutantes com cílios curtos e como isso pode ser explorado para um futuro potencial papel terapêutico para Arl13b. Em seguida, foi avaliado o impacto do aumento da quantidade de Arl13b no desenvolvimento embrionário do peixe-zebra. Observou-se que a sobre-expressão de Arl13b apresentava fenótipos muito fracos, quando comparados com a perda de função dos mutantes de Arl13b. Focados no inesperado fenótipo leve no estabelecimento do eixo esquerda-direita abordámos a questão através do estabelecimento de uma colaboração com matemáticos, descobrimos que os cílios mais longos que potencialmente têm a capacidade de movimentar mais fluido são atenuados por amplitudes de batimento menores, e, como resultado, estes longos cílios não prejudicam o movimento do fluido e consequentemente não afetam o estabelecimento dos padrões de esquerda-direita. Sugerimos assim que a Arl13b é um regulador chave, do comprimento ciliar. Descobrimos uma nova interação com as enzimas de acetilação/de-acetilação e levantamos novas hipóteses quanto aos mecanismos moleculares da função da Arl13b. Propomos um novo modelo para o mecanismo molecular da Arl13b na regulação do comprimento dos cílios onde podemos integrar os nossos resultados com os relatados na literatura. Este trabalho adiciona mais conhecimento para o mecanismo de ação da Arl13b e, portanto, fornece uma importante contribuição para o campo da investigação em cílios.---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ABSTRACT: Arl13b is an important ciliary protein, present in primary and motile cilia. arl13b-/- mouse mutants have reduced cilia length and cilia B-tubule defects. As a consequence of these phenotypes, Arl13b loss of function animal models suffer from several congenital disorders including left-right problems, brain malformations and body deformations. In humans Arl13b depletion leads to a congenital chronic disease called Joubert Syndrome. On the other hand, overexpressing Arl13b leads to longer cilia but the characterization of the cellular and developmental phenotypes was missing. In this work we explore the effect of Arl13b overexpression in zebrafish embryos. We found that, at the ciliary level, Arl13b overexpression from 1 cell stage produces longer primary and motile cilia, but these cilia lack proper alpha tubulin acetylation of their microtubule cytoskeleton. Our results showed that this effect is specific from Arl13b overexpression and when we manipulated the enzymes responsible for acetylation, Mec17, and de-acetylation, HDAC6, we found a potential synergy of both mec17 knockdown and HDAC6 activity with Arl13b overexpression. We tested that the ciliary increase in length was not causally related to the lack of acetylation, meaning the more de-acetylated cilia were not necessarily the longer ones. We also showed that Arl13b overexpression is able to restore cilia length in short cilia mutants and how that may be explored to a potential future therapeutic role for Arl13b. Next, we evaluated the impact of increasing the amount of Arl13b in zebrafish embryonic development. We observed that Arl13b overexpression presented very mild phenotypes when compared to the loss of function mutants. We focused on the unexpected left-right mild phenotype and by establishing a mathematical modeling collaboration, we found out that the longer cilia generated force was attenuated by smaller beating amplitudes, and as a result, these long cilia were not impairing the cilia generated flow and the establishment of left-right patterning. We suggest that Arl13b is one key cilia length regulator. We disclosed a novel interaction with the acetylation / de-acetylation enzymes and raised new hypothesis as to the mechanisms of Arl13b function. We propose a new model for the Arl13b molecular mechanism of cilia length regulation where we integrate our findings with those reported in the literature. This work adds more knowledge to the Arl13b mechanism of action and therefore provides an important contribution to the cilia research field.

Evaluation of antihypertensive drugs in patients with obstructive sleep apnea and in rats submitted to chronic intermittent hypoxia

RESUMO: A hipertensão arterial (HA) é uma patologia altamente prevalente, embora claramente subdiagnosticada, em doentes com síndrome de apneia obstrutiva do sono (SAOS). Estas duas patologias apresentam uma estreita relação e a monitorização ambulatória da pressão arterial (MAPA), por um período de 24 horas, parece ser o método mais preciso para o diagnóstico de hipertensão em doentes com SAOS. No entanto, esta ferramenta de diagnóstico para além de ser dispendiosa e envolver um número acrescido de meios técnicos e humanos, é mais morosa e, por conseguinte, não é utilizada por rotina no contexto do diagnóstico da SAOS. Por outro lado, apesar da aplicação de pressão positiva contínua nas vias aéreas (CPAP – Continous Positive Airway Pressure) ser considerada a terapêutica de eleição para os doentes com SAOS, o seu efeito no abaixamento da pressão arterial (PA) parece ser modesto, exigindo, por conseguinte, a implementação concomitante de terapêutica anti-hipertensora. Acontece que são escassos os dados relativos aos regimes de fármacos anti-hipertensores utilizados em doentes com SAOS e, acresce ainda que, as guidelines terapêuticas para o tratamento farmacológico da HA, neste grupo particular de doentes, permanecem, até ao momento, inexistentes. A utilização de modelos animais de hipóxia crónica intermitente (CIH), que mimetizam a HA observada em doentes com SAOS, revela-se extremamente importante, uma vez que se torna imperativo identificar fármacos que promovam um controle adequado da PA neste grupo de doentes. No entanto, estudos concebidos com o intuito de investigar o efeito anti-hipertensor dos fármacos neste modelo animal revelam-se insuficientes e, por outro lado, os escassos estudos que testaram fármacos anti-hipertensores neste modelo não foram desenhados para responder a questões de natureza farmacológica. Acresce ainda que se torna imprescindível garantir a escolha de um método para administração destes fármacos que seja não invasivo e que minimize o stress do animal. Embora a gavagem seja uma técnica indiscutivelmente eficaz e amplamente utilizada para a administração diária de fármacos a animais de laboratório, ela compreende uma sequência de procedimentos geradores de stress para os animais e, que podem por conseguinte, constituir um viés na interpretação dos resultados obtidos. O objectivo global da presente investigação translacional foi contribuir para a identificação de fármacos anti-hipertensores mais efectivos para o tratamento da HT nos indivíduos com SAOS e investigar mecanismos subjacentes aos efeitos sistémicos associadas à SAOS bem como a sua modulação por fármacos anti-hipertensores. Os objectivos específicos foram: em primeiro lugar,encontrar novos critérios, baseados nas medidas antropométricas, que permitam a identificação de doentes com suspeita de SAOS, que erroneamente se auto-classifiquem como nãohipertensos, e desta forma promover um uso mais criterioso do MAPA; em segundo lugar, investigar a existência de uma hipotética associação entre os esquemas de fármacos antihipertensores e o controle da PA (antes e após a adaptação de CPAP) em doentes com SAOS em terceiro lugar, avaliar a eficácia do carvedilol (CVD), um fármaco bloqueador β-adrenérgico não selectivo com actividade antagonista α1 intrínseca e propriedades anti-oxidantes num modelo animal de hipertensão induzida pela CIH; em quarto lugar, explorar os efeitos da CIH sobre o perfil farmacocinético do CVD; e, em quinto lugar, investigar um método alternativo à gavagem para a administração crónica de fármacos anti-hipertensores a animais de laboratório. Com este intuito, na primeira fase deste projecto, fizemos uso de uma amostra com um número apreciável de doentes com SAOS (n=369), que acorreram, pela primeira vez, à consulta de Patologia do Sono do CHLN e que foram submetidos a um estudo polissonográfico do sono, à MAPA e que preencheram um questionário que contemplava a obtenção de informação relativa ao perfil da medicação anti-hipertensora em curso. Numa segunda fase, utilizámos um modelo experimental de HT no rato induzida por um paradigma de CIH. Do nosso trabalho resultaram os seguintes resultados principais: em primeiro lugar, o índice de massa corporal (IMC) e o perímetro do pescoço (PP) foram identificados como preditores independentes de “auto-classificação errónea” da HA em doentes com suspeita de SAOS; em segundo lugar, não encontramos qualquer associação com significado estatístico entre os vários esquemas de fármacos anti-hipertensores bem como o número de fármacos incluídos nesse esquemas, e o controle da PA (antes e depois da adaptação do CPAP); em terceiro lugar, apesar das doses de 10, 30 e 50 mg/kg de carvedilol terem promovido uma redução significativa da frequência cardíaca, não foi observado qualquer decréscimo na PA no nosso modelo animal; em quarto lugar, as razões S/(R+S) dos enantiómeros do CVD nos animais expostos à CIH e a condições de normóxia revelaram-se diferentes; e, em quinto lugar, a administração oral voluntária mostrou ser um método eficaz para a administração diária controlada de fármacos anti-hipertensores e que é independente da manipulação e contenção do animal. Em conclusão, os resultados obtidos através do estudo clínico revelaram que o controle da PA, antes e após a adaptação do CPAP, em doentes com SAOS é independente, quer do esquema de fármacos anti-hipertensores, quer do número de fármacos incluídos num determinado esquema. Os nossos resultados salientam ainda a falta de validade da chamada self-reported hypertension e sugerem que em todos os doentes com suspeita de SAOS, com HA não diagnosticada e com um IMC e um PP acima de 27 kg/m2 e 39 cm, respectivamente, a confirmação do diagnóstico de HA deverá ser realizada através da MAPA, ao invés de outros métodos que com maior frequência são utilizados com este propósito. Os resultados obtidos no modelo animal de HA induzida pela CIH sugerem que o bloqueio do sistema nervoso simpático, juntamente com os supostos efeitos pleiotrópicos do CVD, não parece ser a estratégia mais adequada para reverter este tipo particular de hipertensão e indicam que as alterações farmacocinéticas induzidas pela CIH no ratio S/(R+S) não justificam a falta de eficácia anti-hipertensora do CVD observada neste modelo animal. Por último, os resultados do presente trabalho suportam ainda a viabilidade da utilização da administração oral voluntária, em alternativa à gavagem, para a administração crónica de uma dose fixa de fármacos anti-hipertensores.---------------------------- ABSTRACT: Hypertension (HT) is a highly prevalent condition, although under diagnosed, in patients with obstructive sleep apnea (OSA). These conditions are closely related and 24-hour ambulatory blood pressure monitoring (ABPM) seems to be the most accurate measurement for diagnosing hypertension in OSA. However, this diagnostic tool is expensive and time-consuming and, therefore, not routinely used. On the other hand, although continuous positive airway pressure (CPAP) is considered the gold standard treatment for symptomatic OSA, its lowering effect on blood pressure (BP) seems to be modest and, therefore, concomitant antihypertensive therapy is still required. Data on antihypertensive drug regimens in patients with OSA are scarce and specific therapeutic guidelines for the pharmacological treatment of hypertension in these patients remain absent. The use of animal models of CIH, which mimic the HT observed in patients with OSA, is extremely important since it is imperative to identify preferred compounds for an adequate BP control in this group of patients. However, studies aimed at investigating the antihypertensive effect of antihypertensive drugs in this animal model are insufficient, and most reports on CIH animal models in which drugs have been tested were not designed to respond to pharmacological issues. Moreover, when testing antihypertensive drugs (AHDs) it becomes crucial to ensure the selection of a non-invasive and stress-free method for drug delivery. Although gavage is effective and a widely performed technique for daily dosing in laboratory rodents, it comprises a sequence of potentially stressful procedures for laboratory animals that may constitute bias for the experimental results. The overall goal of the present translational research was to contribute to identify more effective AHDs for the treatment of hypertension in patients with OSA and investigate underlying mechanisms of systemic effects associated with OSA, as well as its modulation by AHDs. The specific aims were: first, to find new predictors based on anthropometric measures to identify patients that misclassify themselves as non-hypertensive, and thereby promote the selective use of ABPM; second, to investigate a hypothetical association between ongoing antihypertensive regimens and BP control rates in patients with OSA, before and after CPAP adaptation; third, to determine, in a rat model of CIH-induced hypertension, the efficacy of carvedilol (CVD), a nonselective beta-blocker with intrinsic anti-α1-adrenergic activity and antioxidant properties; fourth, to explore the effects of CIH on the pharmacokinetics profile of CVD and fifth, to investigate an alternative method to gavage, for chronic administration of AHDs to laboratory rats. For that, in the first phase of this project, we used a sizeable sample of patients with OSA (n=369), that attended a first visit at Centro Hospitalar Lisboa Norte, EPE Sleep Unit, and underwent overnight polysomnography, 24-h ABPM and filled a questionnaire that included ongoing antihypertensive medication profile registration. In the second phase, a rat experimental model of HT induced by a paradigm of CIH that simulates OSA was used. The main findings of this work were: first, body mass index (BMI) and neck circumference (NC) were identified as independent predictors of hypertension misclassification in patients suspected of OSA; second, in patients with OSA, BP control is independent of both the antihypertensive regimen and the number of antihypertensive drugs, either before or after CPAP adaptation; third, although the doses of 10, 30 and 50 mg/Kg of CVD promoted a significant reduction in heart rate, no decrease in mean arterial pressure was observed; fourth, the S/(R+S) ratios of CVD enantiomers, between rats exposed to CIH and normoxic conditions, were different and fifth, voluntary ingestion proved to be an effective method for a controlled daily dose administration, with a define timetable, that is independent of handling and restraint procedures. In conclusion, the clinical study showed that BP control in OSA patients is independent of both the antihypertensive regimen and the number of antihypertensive drugs. Additionally, our results highlight the lack of validity of self-reported hypertension and suggest that all patients suspected of OSA with undiagnosed hypertension and with a BMI and NC above 27 Kg/m2 and 39 cm should be screened for hypertension, through ABPM. The results attained in the rat model of HT related to CIH suggest that the blockade of the sympathetic nervous system together with the putative pleiotropic effects of carvedilol is not able to revert hypertension induced by CIH and point out that the pharmacokinetic changes induced by CIH on S/(R+S) ratio are not apparently responsible for the lack of efficacy of carvedilol in reversing this particular type of hypertension. Finally, the results here presented support the use of voluntary oral administration as a viable alternative to gavage for chronic administration of a fixed dose of AHDs.

Nanomateriais manufaturados : avaliação de segurança através da caracterização dos seus efeitos genéticos

RESUMO - Os nanomateriais manufaturados (NMs), isto é, fabricados deliberadamente para fins específicos, apresentam propriedades físico-químicas únicas como a dimensão, área superficial ou funcionalização, que lhes conferem caraterísticas mecânicas, óticas, elétricas e magnéticas muito vantajosas para aplicações industriais e biomédicas. Efetivamente, a tecnologia baseada nos NMs, ou nanotecnologia, foi identificada como uma key enabling technology, impulsionadora do crescimento económico dos países industrializados, devido ao seu potencial para melhorar a qualidade e desempenho de muitos tipos de produtos e de processos. Contudo, a expansão da utilização de NMs contrasta com a insuficiente avaliação de risco para a saúde humana e para o ambiente, sendo considerados como um risco emergente para a saúde pública. As incertezas sobre a segurança dos NMs para a saúde pública advêm sobretudo de estudos epidemiológicos em humanos expostos a nanomateriais produzidos como consequência dos processos e atividades humanas e da poluição. Uma das principais preocupações relativamente aos efeitos adversos dos NMs na saúde humana é o seu potencial efeito carcinogénico, que é sugerido por alguns estudos experimentais, como no caso dos nanomateriais de dióxido de titânio ou dos nanotubos de carbono. Para avaliar em curto termo as propriedades carcinogénicas de um composto, utilizam-se frequentemente ensaios de genotoxicidade em linhas celulares de mamífero ou ensaios em modelos animais, em que se analisa uma variedade de lesões genéticas potencialmente relacionados com o processo de carcinogénese. No entanto, a investigação sobre as propriedades genotóxicas dos NMs não foi, até hoje, conclusiva. O presente estudo tem por objectivo principal caracterizar os efeitos genotóxicos associados à exposição a nanomateriais manufaturados, de forma a contribuir para a avaliação da sua segurança. Constituíram objectivos específicos deste estudo: i) avaliar a genotoxicidade dos NMs em três tipos de células humanas expostas in vitro: linfócitos humanos primários, linha celular de epitélio brônquico humano (BEAS-2B) e linha celular de adenocarcinoma epitelial de pulmão humano (A549); ii) avaliar a sua genotoxicidade num modelo de ratinho transgénico; iii) investigar alguns mecanismos de acção que poderão contribuir para a genotoxicidade dos nanomateriais, como a contribuição de lesões oxidativas para a genotoxicidade induzida pelos NMs in vitro, e a investigação da sua bioacumulação e localização celular in vivo. Foram analisados os efeitos genotóxicos associados à exposição a duas classes de NMs, dióxido de titânio e nanotubos de carbono de parede múltipla, bem como a um NM de óxido de zinco, candidato a ser utlilizado como controlo positivo de dimensão nanométrica. Os xx NMs utilizados foram previamente caracterizados com detalhe relativamente às suas características físico-químicas e também relativamente à sua dispersão em meio aquoso e no meio de cultura. A metodologia incluiu ensaios de citotoxicidade e de genotoxicidade in vitro, designadamente, ensaios de quebras no DNA (ensaio do cometa) e nos cromossomas (ensaio do micronúcleo) em células humanas expostas a várias concentrações de NMs, por comparação com células não expostas. Também foram realizados ensaios in vivo de quebras no DNA, quebras cromossómicas e ainda um ensaio de mutações em vários órgãos de grupos de ratinhos transgénicos LacZ, expostos por via intravenosa a duas doses de dióxido de titânio. Foi investigada a existência de uma relação dose-resposta após exposição das células humanas ou dos animais a NMs. A contribuição de lesões oxidativas para a genotoxicidade após exposição das células aos NMs in vitro foi explorada através do ensaio do cometa modificado com enzima. Realizaram-se estudos histológicos e citológicos para deteção e localização celular dos NMs nos órgãos-alvo dos ratinhos expostos in vivo. Os resultados demonstraram efeitos genotóxicos em alguns dos NMs analisados em células humanas. No entanto, os efeitos genotóxicos, quando positivos, foram em níveis reduzidos, ainda que superiores aos valores dos controlos, e a sua reprodutibilidade era dependente do sistema experimental utilizado. Para outros NMs, a evidência de genotoxicidade revelou-se equívoca, conduzindo à necessidade de esclarecimento através de ensaios in vivo. Para esse fim, recorreu-se a uma análise integrada de múltiplos parâmetros num modelo animal, o ratinho transgénico baseado em plasmídeo contendo o gene LacZ exposto a um NM de dióxido de titânio, NM-102. Embora tenha sido demonstrada a exposição e a acumulação do NM no fígado, não se observaram efeitos genotóxicos nem no fígado, nem no baço nem no sangue dos ratinhos expostos a esse NM. Neste estudo concluiu-se que algumas formas de dióxido de titânio e nanotubos de carbono de parede múltipla produzem efeitos genotóxicos em células humanas, contribuindo para o conjunto de evidências sobre o efeito genotóxico desses NMs. As diferenças observadas relativamente à genotoxicidade entre NMs do mesmo tipo, mas distintos em algumas das suas características físico-quimicas, aparentemente não são negligenciáveis, pelo que os resultados obtidos para um NM não devem ser generalizados ao grupo correspondente. Para além disso, a genotoxicidade equívoca verificada para o NM-102 em células humanas expostas in vitro, não foi confirmada no modelo in vivo, pelo que o valor preditivo da utilização dos ensaios in vitro para a identificação de NMs com efeitos genotóxicos (e portanto potencialmente carcinogénicos) ainda tem de ser esclarecido antes de ser possível extrapolar as conclusões para a saúde humana. Por sua vez, como a informação aqui produzida pelas metodologias in vitro e in vivo não reflete os efeitos de exposição continua ou prolongada, que poderá conduzir a efeitos genotóxicos distintos, esta xxi deverá ser complementada com outras linhas de evidência relativamente à segurança dos NMs. Perante a incerteza dos níveis de exposição real do organismo humano e do ambiente, a segurança da utilização dos NMs não pode ser garantida a longo prazo e, tendo em conta a elevada produção e utilização destes NMs, são prementes futuros estudos de monitorização ambiental e humana.

Interacção Parasita-Hospedeiro e susceptibilidade de Leishmania infantum a fármacos

RESUMO As leishmanioses são doenças causadas por um protozoário intracelular pertencente à ordem Kinetoplastida, da família Trypanosomatidae, do género Leishmania. Os parasitas são transmitidos aos hospedeiros vertebrados por dípteros pertencentes à sub-família Phlebotominae. Devido à inexistência de vacinas a quimioterapêutica continua a representar o único mecanismo de prevenção e controlo. Os fármacos de primeira linha para o tratamento da leishmaniose visceral continuam a ser os antimoniais pentavalentes e a anfotericina B (AMB). A AMB lipossómica está a ser cada vez mais utilizada como 1ª linha. O conhecimento do(s) mecanismo(s) utilizados pelos parasitas, responsáveis pela resistência, é fundamental de modo a permitir o desenvolvimento de novos fármacos anti-Leishmania que possam substituir e/ou complementar os fármacos existentes, de uma forma eficaz assim como contribuir para o desenvolvimento de metodologias para avaliar e monitorizar a resistência. Espera-se do modelo animal a reprodução da infecção na Natureza. Os modelos canino e murino têm ajudado na compreensão dos mecanismos responsáveis pela patogénese e pela resposta imunitária à infecção por Leishmania. Sendo o cão o principal hospedeiro da infecção por L. infantum e o principal reservatório doméstico da leishmaniose visceral humana, procedeu-se à caracterização da evolução da infecção experimental em canídeos de raça Beagle através da análise clínica, hematológica, histopatológica, parasitária, assim com através da resposta imunitária desenvolvida. As alterações hematológicas observadas foram as associadas à leishmaniose visceral: anemia, leucopenia, trombocitopenia com aumento das proteínas totais e da fracção gama-globulina, e diminuição da albumina. Histologicamente observou-se nos órgãos viscerais uma reacção inflamatória crónica, acompanhada por vezes da formação de granulomas ricos em macrófagos. Apesar de todos os animais terem ficado infectados (confirmado pela presença do parasita nos vários tecidos e órgãos recolhidos na necrópsia), os únicos sinais clínicos observados transitoriamente foram adenopatia e alopécia. As técnicas moleculares foram significativamente mais eficazes na detecção do parasita do que os métodos parasitológicos convencionais. As amostras não invasivas (sangue periférico e conjuntiva) mostraram ser significativamente menos eficazes na detecção de leishmanias. No nosso modelo experimental não se observou a supressão da resposta celular ao antigénio parasitário e confirmou-se que, apesar de não protectora, a resposta humoral específica é pronunciada e precoce. A bipolarização da resposta imunitária Th1 ou Th2, amplamente descrita nas infecções experimentais por L. major no modelo murino, não foram observadas neste estudo. O facto dos animais não evidenciarem doença apesar do elevado parasitismo nos órgãos viscerais poderá estar relacionado com a expressão simultânea de citocinas de ambos os tipos Th1 e Treg, no baço, fígado, gânglio, medula óssea e sangue periférico. Neste estudo também se caracterizou o efeito da saliva do vector Phlebotomus perniciosus na infecção experimental de murganhos BALB/c com estirpes de L. infantum selvagem e tratada com AMB, inoculadas por via intradérmica. A visceralização da infecção ocorreu após a utilização da via de administração do inóculo que mais se assemelha ao que ocorre na Natureza. Apesar da disseminação dos parasitas nos animais co-inoculados com extracto de uma glândula salivar ter sido anterior à do grupo inoculado apenas com parasitas, não se detectaram diferenças significativas na carga parasitária, entre os três grupos, ao longo do período de observação pelo que, embora a saliva do vector esteja descrita como responsável pela exacerbação da infecção, tal não foi observado no nosso estudo. O aumento de expressão de citocinas esteve relacionado com o aumento do parasitismo mas, tal como no modelo canino, não se observou bipolarização da resposta imunitária. Os animais dos três grupos infectados parecem ter desenvolvido nos diferentes órgãos uma resposta mista dos tipos Th1 e Th2/Treg. Contudo, verificou-se a predominância da expressão Th1 (TNF-α), no fim do período de observação, o que pode estar relacionado com a resolução da infecção. Por outro lado, a presença de parasitas na pele dos animais inoculados com a estirpe L. infantum tratada com AMB permite colocar a hipótese da existência de parasitas resistentes na Natureza e destes poderem ser transmitidos. Após se ter verificado que a estirpe de L. infantum tratada com AMB tinha a capacidade de infectar e visceralizar no modelo murino, analisou-se o seu comportamento em dois dos principais vectores de L. infantum, Lutzomyia longipalpis e P. perniciosus. Os parasitas tratados com AMB apresentaram uma menor capacidade de permanecerem no interior do vector assim como um desenvolvimento mais lento apontando para uma menor capacidade de transmissão das estirpes resistentes a este fármaco, pelo que o tratamento com AMB poderá ser favorável à prevenção e controlo através da interrupção do ciclo de vida do parasita. De modo a determinar in vitro a susceptibilidade de Leishmania aos diferentes fármacos utilizados na terapêutica da leishmaniose humana e canina (Glucantime®, Fungizone®, miltefosine e alopurinol) comparou-se o sistema de promastigotas axénicos com o sistema amatigota-macrófago. Verificou-se que, para as estirpes estudadas, os resultados de ambos os sistemas não apresentavam diferenças significativas sendo a utilização do primeiro mais vantajosa ao ser menos moroso e de mais fácil execução. Seleccionaram-se estirpes quimio-resistentes in vitro, por exposição prolongada a doses crescentes de AMB, tendo-se verificado que os parasitas tratados, apresentaram uma menor susceptibilidade do que os não tratados à acção dos fármacos estudados, com excepção do alopurinol. A diminuição da susceptibilidade das estirpes aos fármacos utilizados poderá facilitar a dispersão de parasitas multiresistentes. Sendo a apoptose um dos mecanismos utilizados pelos parasitas para evitar a indução de uma resposta imune por acção de compostos anti- Leishmania, determinou-se o número de amastigotas apoptóticos assim como a produção de TNF-α e IL-10 pelos macrófagos tratados. Concluiu-se que os compostos conseguiram suprimir a produção de IL-10, inibidora da activação dos macrófagos, contudo nem a produção da citocina pro-inflamatória TNF- α nem a apoptose pareceram ser os principais mecanismos responsáveis à sobrevivência dos parasitas ao contacto com os fármacos.

Determinação da prevalência de fibrilhação auricular na população portuguesa ao nível da NUTS III usando modelos hierárquicos bayesianos

A Fibrilhação Auricular é uma alteração do ritmo cardíaco designada por arritmia. Esta patologia é considerada a forma de arritmia mais frequentemente observada na prática clínica e que constitui uma importante causa de morbilidade pelo risco inerente de desenvolvimento de AVC. Em 2010 foi realizado um estudo epidemiológico na população Portuguesa com o objectivo determinar a prevalência de Fibrilhação Auricular na população portuguesa com idade igual ou superior a 40 anos, sob o acrónimo de FAMA. Os dados publicados indicaram uma estimativa de prevalência de 2,5%, com um aumento da prevalência em função da classe etária. A nível regional não foram observadas diferenças na taxa de prevalência. Estudos de mapeamento de doenças mostraram que a determinação de taxas de prevalência por região, quando o número de casos observados é relativamente baixo, apresentam sobredispersão e, consequentemente, uma falta de precisão nas estimativas obtidas através um método frequencista clássico. A utilização de modelos Bayesianos hierárquicos no mapeamento de doenças tem apresentado vantagem na estimação de valores de risco da doença comparativamente à abordagem clássica. Assim, é objectivo deste trabalho determinar a prevalência de Fibrilhação Auricular na população Portuguesa por região, ao nível da NUTS III, usando modelos hierárquicos Bayesianos. Os dados utilizados neste estudo são os dados referentes ao estudo FAMA, pós-estratificados para correcção dos ponderadores. O modelo Bayesiano proposto por Besag, York e Mollié (1991) foi usado para modelar os dados, covariando para a idade e índice de massa corporal. A revisão do desenho do estudo e o recálculo dos ponderadores foi realizado com recurso ao software R, survey, e a análise Bayesiana efectuada através do WinBugs. iii Os resultados deste estudo demonstram que o uso de modelos Bayesianos são uma melhor opção para a estimação de valores risco relativo e prevalência da doença. Contudo, a utilização de covariáveis não resultou numa melhoria considerável ao contrário do que seria esperado. Conclui-se que a Fibrilhação Auricular apresenta variações regionais significativas, a nível de NUTS III, que não devem ser desvalorizadas na determinação de políticas de saúde pública para controle da doença.

Percepção do estado de saúde de doentes com anticoagulação oral

RESUMO - O aumento da incidência das doenças crónicas representa um desafio enorme para todos os Sistemas de Saúde, pelo que a assistência de Saúde a doentes crónicos se tornou num problema das sociedades ocidentais. Os países mais pobres são os que mais sofrem, embora nos países desenvolvidos também se verifique um aumento notável das doenças crónicas. Estima-se que estas representem mais de 60% do total das doenças mundiais no ano 2020 (WHO, 2001). A adaptação dos actuais modelos de saúde aos doentes crónicos não atingiu os objectivos, o que conduziu a que, de há alguns anos a esta parte, se procure alternativas mais eficazes e eficientes. Uma das pressões do mercado que se fazem sentir será caracterizada por uma maior aposta na Promoção da Saúde e Prevenção da doença. O conceito de “Saúde” migrou de “não existência de doença” para “Bem-estar Físico e Psicológico”. Desta forma, o foco dos cuidados de saúde teve que ser adaptado, o que conduziu a uma situação em que o âmbito da prestação de cuidados de saúde é um contínuo de serviços que vai desde a promoção da saúde, medicina preventiva e medicina curativa aos cuidados continuados e cuidados paliativos. As tecnologias de informação e comunicação desempenharão um importante papel nesta tendência, permitindo estabelecer ligações contínuas entre os consumidores e prestadores de cuidados de saúde. Por outro lado, as potencialidades da Internet, das comunicações móveis, dispositivos portáteis e do instrumental electrónico, tornam-se evidentes no desenvolvimento de serviços de e-Saúde: para monitorização, seguimento e controlo dos doentes extra hospitalar - serviços estes centrados no doente. O objectivo geral do presente estudo consiste no desenho de um projecto de investigação para posterior avaliação da percepção do estado de saúde dos doentes seguidos na consulta de hipocoagulação do Hospital de Santa Marta. Devido à escassez de investigação na temática deste trabalho em Portugal, procedeu-se a um trabalho exploratório, descritivo, de carácter comparativo e enquadrado na abordagem quantitativa. O campo de análise consiste em comparar doentes que fazem anticoagulação oral, seguidos na consulta de cardiologia (consulta convencional), com os doentes seguidos no programa Airmed (através das comunicações móveis). 4 Para avaliação da percepção do estado de saúde foi utilizado o questionário SF-36.----ABSTRACT - The increasing incidence of chronic diseases represents an enormous challenge to the Health Systems and on cause of that, the Health Assistance to chronic patients became a concern of the Occidental society. The Countries with lower economical resources are the ones that suffers the most, but also the Developed countries have a noticeable increase of chronic diseases. It is estimated these will represent over 60% of total diseases world wide in 2020 (WHO,2001). The adaptation of the actual Health Models to chronic patients did not achieved it’s goals, what leaded to look for more effective and efficient alternatives. One of the more sensitive market pressure factor is to look for a better Health Promotion and Disease Prevention. The concept of “Health” merged from “Disease absence” to “Physic and Psychic Wellness”. In this way the Health Care focus had to be adapted, what drove to a status where the scope of the Health care is a continuum of services that goes from the Health Promotion, Preventive and Curative to Continued and Palliative Medical Care. The Information and Communication Technologies will play a crucial role in this trend, allowing to establish continued connections between patients and Health Care providers. In parallel the potential of the Internet, mobile communications, portable devices and electronic instruments became evident to deploy e-Health services: to monitor, follow-up and control of patients outside the Hospital. The overall objective of the present study is an Investigation Project Design to further evaluate the health status perception of the patients followed in the consultation for Hypocoagulation in the “Hospital de Santa Marta”. Due to lack of investigation in this thematic, in Portugal, this study is developed in an exploratory way, descriptive, comparative, within a scope of a quantified approach. The analysis field consists on comparing patients prescribed with oral anticoagulants and followed-up at the

O contributo da iconografia musical na pintura quinhentista portuguesa, luso-flamenga e flamenga em Portugal, para o reconhecimento das práticas musicais da época: fontes e modelos utilizados nas oficinas de pintura

Dissertação apresentada para cumprimentos dos requisitos necessários à obtenção do grau de mestre em Ciências Musiciais - Musicologia Histórica

Modelos paramétricos para o planeamento de cidade sustentáveis – o caso das cidades africanas

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Civil

Integração de modelos BIM com redes de sensores num edifício

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Eletrotécnica e Computadores

Surto de listeria monocytogenes na Região de Lisboa e Vale do Tejo : 2009-2011

RESUMO - O género Listeria contém oito espécies (L. monocytogenes, L. ivanovii, L. innocua, L. seeligeri, L. welshimeri, L. grayi, L. marthii, e a L. rocoutiae), das quais duas são patogénicas. L. monocytogenes é patogénica para humanos e animais; L. ivanovii primeiramente infecta animais e raramente causa doenças em humanos. A Listeria monocytogenes é uma bactéria patogénica Gram-positiva facultativa intracelular, ubíqua na natureza. Nos últimos anos o número de casos de listeriose tem vindo a aumentar. Pode causar uma doença rara e grave chamada listeriose, especialmente nas mulheres grávidas, nos idosos ou em indivíduos com o sistema imunitário debilitado, de maneira esporádica ou em forma surtos. Realizou-se um estudo observacional, descritivo com o objectivo de se fazer a descrição e a caracterização do surto de listeriose ocorrido na região de Lisboa e Vale do Tejo entre 2009-2011. O período de maior número de casos diagnosticados de listeriose ocorreu entre o mês de Abril e Agosto de 2010. Mas a janela temporal em que ocorreu o surto estendeu-se de Março de 2009 a Janeiro de 2012. Ocorreram 51 casos de internamento com diagnóstico de listeriose, dos quais 25 casos foram confirmados, pela técnica de PFGE, pertencer à mesma estirpe I, sorotipo 4b e pulsotipo 070 e 0101. Na maioria dos casos eram do sexo feminino, com uma média de 57,14 anos de idade e com residência na região de Lisboa e Vale do Tejo. Em 96,08% dos doentes internados com listeriose apresentavam factores de predisposição, comorbilidade e /ou imunossupressão. A bacteriemia foi a manifestação clínica mais frequente, seguida da meningite. A letalidade da listeriose foi de 15,69%.

Modelos de previsão de preços de commodities

O principal objectivo deste trabalho assenta em desenvolver modelos de previsão de preços de commodities para assim comparar a capacidade preditiva da simulação de Monte Carlo com a das redes neuronais. A simulação de Monte Carlo é principalmente utilizada para avaliar as opções, já as redes neuronais são utilizadas para fazer previsões, classificações, clustering ou aproximação de funções. Os diversos modelos desenvolvidos foram aplicados na previsão do preço futuro do milho, petróleo, ouro e cobre. Sendo que os horizontes temporais testados neste trabalho foram 1 dia, 5 dias, 20 dias e 60 dias. Através da análise do erro absoluto médio percentual (MAPE) concluiu-se que no geral o modelo individual que apresentou um melhor desempenho preditivo foram as redes neuronais. Contudo, nas previsões a 1 e a 5 dias os resultados obtidos foram semelhantes para ambos os modelos. Para se tentar melhorar os resultados obtidos pelos modelos individuais foram aplicadas algumas técnicas de combinação de modelos. A combinação de modelos demonstrou no geral capacidade para melhorar os resultados dos modelos individuais, porém apenas para o horizonte a 60 dias é que os resultados melhoraram significativamente.

eHealth e a adoção da inovação em assisted living technologies : o caso das demências

RESUMO - Assistimos hoje a um contexto marcado (i) pelo progressivo envelhecimento das sociedades ocidentais, (ii) pelo aumento da prevalência das doenças crónicas, de que as demências são um exemplo, (iii) pelo significativo aumento dos custos associados a estas patologias, (iv) por orçamentos públicos fortemente pressionadas pelo controlo da despesa, (v) por uma vida moderna que dificulta o apoio intergeracional, tornando o suporte proporcionado pelos filhos particularmente difícil, (vi) por fortes expectativas relativamente à prestação de cuidados de saúde com qualidade. Teremos assim de ser capazes de conseguir melhorar os serviços de saúde, ao mesmo tempo que recorremos a menos recursos financeiros e humanos, pelo que a inovação parece ser crítica para a sustentabilidade do sistema. Contudo a difusão das Assistive Living Technologies, apesar do seu potencial, tem sido bastante baixa, nomeadamente em Portugal. Porquê? Hamer, Plochg e Moreira (2012), no editorial do International Journal of Healthcare Management, enquadram a Inovação como “podendo ser imprevisível e mesmo dolorosa, pelo que talvez possamos não ficar surpreendidos se surgirem resistências e que, inovações bastante necessárias, capazes de melhorar os indicadores de saúde, tenham sido de adoção lenta ou que tenham mesmo sido insustentáveis”. Em Portugal não há bibliografia que procure caracterizar o modelo de difusão da inovação em eHealth ou das tecnologias de vivência assistida. A bibliografia internacional é igualmente escassa. O presente projeto de investigação, de natureza exploratória, tem como objetivo principal, identificar barreiras e oportunidades para a implementação de tecnologias eHealth, aplicadas ao campo das demências. Como objetivos secundários pretendemse identificar as oportunidades e limitações em Portugal: mapa de competências nacionais, e propor medidas que possa acelerar a inovação em ALT, no contexto nacional. O projeto seguirá o modelo de um estudo qualitativo. Para o efeito foram conduzidas entrevistas em profundidade junto de experts em ALT, procurando obter a visão daqueles que participam do lado da Oferta- a Indústria; do lado da Procura- doentes, cuidadores e profissionais de saúde; bem como dos Reguladores. O instrumento utilizado para a recolha da informação pretendida foi o questionário não estruturado. A análise e interpretação da informação recolhida foram feitas através da técnica de Análise de Conteúdo. Os resultados da Análise de Conteúdo efetuada permitiram expressar a dicotomia barreira/oportunidade, nas seguintes categorias aqui descritas como contextos (i) Contexto Tecnológico, nas subcategorias de Acesso às Infraestruturas; Custo da Tecnologia; Interoperabilidade, (ii) Contexto do Valor Percecionado, nas subcategorias de Utilidade; Eficiência; Divulgação, (iii) Contexto Político, compreendendo a Liderança; Organização; Regulação; Recursos, (iv) Contexto Sociocultural, incluindo nomeadamente Idade; Literacia; Capacidade Económica, (v) Contexto Individual, incluindo como subcategorias, Capacidade de Adaptação a Novas tecnologias; Motivação; Acesso a equipamentos (vi) Contexto Específico da Doença, nomeadamente o Impacto Cognitivo; Tipologia Heterogénea e a Importância do Cuidador. Foi proposto um modelo exploratório, designado de Modelo de Contextos e Forças, que estudos subsequentes poderão validar. Neste modelo o Contexto Tecnológico é um Força Básica ou Fundamental; o Contexto do Valor Percecionado, constitui-se numa Força Crítica para a adoção de inovação, que assenta na sua capacidade para oferecer valor aos diversos stakeholders da cadeia de cuidados. Temos também o Contexto Político, com capacidade de modelar a adoção da inovação e nomeadamente com capacidade para o acelerar, se dele emitir um sinal de urgência para a mudança. O Contexto Sociocultural e Individual expressam uma Força Intrínseca, dado que elas são características internas, próprias e imutáveis no curto-prazo, das sociedade e das pessoas. Por fim há que considerar o Contexto Específico da Doença, nesta caso o das demências. Das conclusões do estudo parece evidente que as condições tecnológicas estão medianamente satisfeitas em Portugal, com evidentes progressos nos últimos anos (exceção para a interoperabilidade aonde há necessidade de maiores progressos), não constituindo portanto barreira à introdução de ALT. Aonde há necessidade de investir é nas áreas do valor percebido. Da análise feita, esta é uma área que constitui uma barreira à introdução e adoção das ALT em Portugal. A falta de perceção do valor que estas tecnologias trazem, por parte dos profissionais de saúde, doentes, cuidadores e decisores políticos, parece ser o principal entrave à sua adoção. São recomendadas estratégias de modelos colaborativos de Investigação e Desenvolvimento e de abordagens de cocriação com a contribuição de todos os intervenientes na cadeia de cuidados. Há também um papel que cabe ao estado no âmbito das prioridades e da mobilização de recursos, sendo-lhe requerida a expressão do sentido de urgência para que esta mudança aconteça. Foram também identificadas oportunidades em diversas áreas, como na prevenção, no diagnóstico, na compliance medicamentosa, na terapêutica, na monitorização, no apoio à vida diária e na integração social. O que é necessário é que as soluções encontradas constituam respostas àquilo que são as verdadeiras necessidades dos intervenientes e não uma imposição tecnológica que só por si nada resolve. Do estudo resultou também a perceção de que há que (i) continuar a trabalhar no sentido de aproximar a comunidade científica, da clínica e do doente, (ii) fomentar a colaboração entre centros, com vista à criação de escala a nível global. Essa colaboração já parece acontecer a nível empresarial, tendo sido identificadas empresas Portuguesas com vocação global. A qualidade individual das instituições de ensino, dos centros de investigação, das empresas, permite criar as condições para que Portugal possa ser país um piloto e um case-study internacional em ALT, desde que para tal pudéssemos contar com um trabalho colaborativo entre instituições e com decisões políticas arrojadas.

O impacto da Rede Nacional de Cuidados Continuados Integrados (RNCCI) na demora média hospitalar

RESUMO - Enquadramento: O envelhecimento dos indivíduos nos países mais desenvolvidos e o aumento da incidência de doenças crónicas associadas a estados de dependência e incapacidade têm contribuído para o desenho e implementação de novas políticas de saúde e sociais. Assiste-se, por isso, atualmente, a uma mudança no paradigma da procura de cuidados de saúde, sendo crescente a procura de cuidados de longa duração ou cuidados continuados. O desenvolvimento e implementação de novos modelos de prestação de cuidados de saúde pretendem dar resposta à crescente procura de cuidados continuados, bem como promover a eficiência dos serviços e a disponibilização de camas nos hospitais, retirando dos serviços de agudos as pessoas que não necessitam de cuidados hospitalares, mas sim de cuidados continuados. Neste contexto foi criada em Portugal a Rede Nacional de Cuidados Continuados Integrados (RNCCI), como resposta ao aumento do número de pessoas em situação de dependência, e que necessitam tanto de cuidados de saúde como sociais, e à necessidade de reorganizar e promover a eficiência dos serviços de internamento hospitalar. Objetivo: Determinar o impacto da RNCCI na demora média hospitalar, no período de tempo compreendido entre 1 de Janeiro de 2009 e 31 de Junho de 2011. Métodos: O estudo realizado, com base na revisão da literatura, descreve os principais aspectos referentes ao envelhecimento dos indivíduos e aos cuidados continuados. Foram descritos diferentes modelos e programas organizacionais de prestação de cuidados continuados e o seu impacto na demora média hospitalar. Foi determinada a população em estudo no período de tempo compreendido entre 1 de Janeiro de 2009 e 31 de Junho de 2011. A população foi caraterizada de acordo com o ano e distribuída por dez trimestres para melhor tratamento estatístico e leitura dos dados. Foi considerado o sexo e a faixa etária dos indivíduos sinalizados, de acordo com o GDH de internamento hospitalar e respetiva sub-região de saúde. Foi comparada por trimestre a demora média dos internamentos hospitalares e a demora média hospitalar dos episódios referenciados a nível nacional e ao nível das sub-regiões de saúde. Foram caraterizados os GDH que representam 50% das sinalizações. Foram analisados, por semestre, os três GDH com maior número de referenciações para a RNCCI de acordo com as diferentes regiões de saúde, comparando as respetivas demoras médias nacionais e regionais. Resultados: No periodo de tempo em análise foi verificado que a população com maior utilização dos serviços da RNCCI encontra-se na faixa etária entre 65 ou mais anos, com 79,4% do total de sinalizações efetuadas. Tendo 50% das sinalizações sido referentes aos GDH 14, GDH 211, GDH 533, GDH 818, GDH 810 e GDH 209. Foi apurada uma demora média nacional compreendida entre os 7,3 dias e os 7,7 dias, comparativamente a uma demora média dos episódios referenciados para a RNCCI compreendida entre os 21,9 dias e os 33 dias, para o mesmo período de tempo. Em termos regionais a região de LVT apresenta os valores de demora média mais elevados, com um intervalo entre os 28,8 dias e os 50,3 dias de demora média. Para o GDH 14 foi observada uma demora média dos episódios referenciados compreendida entre os 14,4 dias e os 26,7 dias. No mesmo período de tempo o a demora média nacional para o mesmo GDH situava-se entre os 9,8 dias e os 10,2 dias. Para o GDH 211 foi observada uma demora média dos episódios referenciados compreendida entre os 17,2 dias e os 28,9 dias. Comparativamente a demora média nacional para o mesmo GDH situava-se entre os 12,5 dias e os 13,5 dias. Para o GDH 533 foi observada uma demora média dos episódios referenciados compreendida entre os 23,3 dias e os 52,7 dias. Comparativamente, no mesmo período de tempo, a demora média nacional para o mesmo GDH situava-se entre os 18,7 dias e os 19,7 dias. Conclusões: Foi possível concluir, quanto ao impacto da RNCCI na demora média hospitalar, que a demora média dos episódios referenciados para a Rede é superior à demora média nacional em todo o período de tempo em análise. Relativamente à demora média dos GDH com maior número de referenciações, os GDH 14, 211 e 533, verifica-se que todos eles apresentam uma demora média de referenciação superior à demora média nacional, e demora média regional para o mesmo GDH, em todo o período de tempo do estudo. Ou seja, foi possível verificar que a demora média para indivíduos com o mesmo GDH é superior nos que são referenciados para a RNCCI.

Cellular reprogramming strategies for degenerative disorders involving the retinal pigment epithelium

RESUMO: A reprogramação celular permite que uma célula somática seja reprogramada para outra célula diferente através da expressão forçada de factores de transcrição (FTs) específicos de determinada linhagem celular, e constitui uma área de investigação emergente nos últimos anos. As células somáticas podem ser experimentalmente manipuladas de modo a obter células estaminais pluripotentes induzidas (CEPi), ou convertidas directamente noutro tipo de célula somática. Estas descobertas inovadoras oferecem oportunidades promissoras para o desenvolvimento de novas terapias de substituição celular e modelos de doença, funcionando também como ferramentas valiosas para o estudo dos mecanismos moleculares que estabelecem a identidade celular e regulam os processos de desenvolvimento. Existem várias doenças degenerativas hereditárias e adquiridas da retina que causam deficiência visual devido a uma disfunção no tecido de suporte da retina, o epitélio pigmentar da retina (EPR). Uma destas doenças é a Coroideremia (CHM), uma doença hereditária monogénica ligada ao cromossoma X causada por mutações que implicam a perda de função duma proteína com funções importantes na regulação do tráfico intracelular. A CHM é caracterizada pela degenerescência progressiva do EPR, assim como dos foto-receptores e da coróide. Resultados experimentais sugerem que o EPR desempenha um papel importante na patogénese da CHM, o que parece indicar uma possível vantagem terapêutica na substituição do EPR nos doentes com CHM. Por outro lado, existe uma lacuna em termos de modelos in vitro de EPR para estudar a CHM, o que pode explicar o ainda desconhecimento dos mecanismos moleculares que explicam a patogénese desta doença. Assim, este trabalho focou-se principalmente na exploração das potencialidades das técnicas de reprogramação celular no contexto das doenças de degenerescência da retina, em particular no caso da CHM. Células de murganho de estirpe selvagem, bem como células derivadas de um ratinho modelo de knockout condicional de Chm, foram convertidos com sucesso em CEPi recorrendo a um sistema lentiviral induzido que permite a expressão forçada dos 4 factores clássicos de reprogramação, a saber Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc. Estas células mostraram ter equivalência morfológica, molecular e funcional a células estaminais embrionárias (CES). As CEPi obtidas foram seguidamente submetidas a protocolos de diferenciação com o objectivo final de obter células do EPR. Os resultados promissores obtidos revelam a possibilidade de gerar um valioso modelo de EPR-CHM para estudos in vitro. Em alternativa, a conversão directa de linhagens partindo de fibroblastos para obter células do EPR foi também abordada. Uma vasta gama de ferramentas moleculares foi gerada de modo a implementar uma estratégia mediada por FTs-chave, seleccionados devido ao seu papel fundamental no desenvolvimento embrionário e especificação do EPR. Conjuntos de 10 ou menos FTs foram usados para transduzir fibroblastos, que adquiriram morfologia pigmentada e expressão de alguns marcadores específicos do EPR. Adicionalmente, observou-se a activação de regiões promotoras de genes específicos de EPR, indicando que a identidade transcricional das células foi alterada no sentido pretendido. Em conclusão, avanços significativos foram atingidos no sentido da implementação de tecnologias de reprogramação celular já estabelecidas, bem como na concepção de novas estratégias inovadoras. Metodologias de reprogramação, quer para pluripotência, quer via conversão directa, foram aplicadas com o objectivo final de gerar células do EPR. O trabalho aqui descrito abre novos caminhos para o estabelecimento de terapias de substituição celular e, de uma maneira mais directa, levanta a possibilidade de modelar doenças degenerativas da retina com disfunção do EPR numa placa de petri, em particular no caso da CHM.---------------ABSTRACT: Cellular reprogramming is an emerging research field in which a somatic cell is reprogrammed into a different cell type by forcing the expression of lineage-specific transcription factors (TFs). Cellular identities can be manipulated using experimental techniques with the attainment of pluripotency properties and the generation of induced Pluripotent Stem (iPS) cells, or the direct conversion of one somatic cell into another somatic cell type. These pioneering discoveries offer new unprecedented opportunities for the establishment of novel cell-based therapies and disease models, as well as serving as valuable tools for the study of molecular mechanisms governing cell fate establishment and developmental processes. Several retinal degenerative disorders, inherited and acquired, lead to visual impairment due to an underlying dysfunction of the support cells of the retina, the retinal pigment epithelium (RPE). Choroideremia (CHM), an X-linked monogenic disease caused by a loss of function mutation in a key regulator of intracellular trafficking, is characterized by a progressive degeneration of the RPE and other components of the retina, such as the photoreceptors and the choroid. Evidence suggest that RPE plays an important role in CHM pathogenesis, thus implying that regenerative approaches aiming at rescuing RPE function may be of great benefit for CHM patients. Additionally, lack of appropriate in vitro models has contributed to the still poorly-characterized molecular events in the base of CHM degenerative process. Therefore, the main focus of this work was to explore the potential applications of cellular reprogramming technology in the context of RPE-related retinal degenerations. The generation of mouse iPS cells was established and optimized using an inducible lentiviral system to force the expression of the classic set of TFs, namely Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc. Wild-type cells, as well as cells derived from a conditional knockout (KO) mouse model of Chm, were successfully converted into a pluripotent state, that displayed morphology, molecular and functional equivalence to Embryonic Stem (ES) cells. Generated iPS cells were then subjected to differentiation protocols towards the attainment of a RPE cell fate, with promising results highlighting the possibility of generating a valuable Chm-RPE in vitro model. In alternative, direct lineage conversion of fibroblasts into RPE-like cells was also tackled. A TF-mediated approach was implemented after the generation of a panoply of molecular tools needed for such studies. After transduction with pools of 10 or less TFs, selected for their key role on RPE developmental process and specification, fibroblasts acquired a pigmented morphology and expression of some RPE-specific markers. Additionally, promoter regions of RPE-specific genes were activated indicating that the transcriptional identity of the cells was being altered into the pursued cell fate. In conclusion, highly significant progress was made towards the implementation of already established cellular reprogramming technologies, as well as the designing of new innovative ones. Reprogramming into pluripotency and lineage conversion methodologies were applied to ultimately generate RPE cells. These studies open new avenues for the establishment of cell replacement therapies and, more straightforwardly,raise the possibility of modelling retinal degenerations with underlying RPE defects in apetri dish, particularly CHM.

Métodos estatísticos aplicados à modelação de dados oncológicos

RESUMO: A estrutura demográfica portuguesa é marcada por baixas taxas de natalidade e mortalidade, onde a população idosa representa uma fatia cada vez mais representativa, fruto de uma maior longevidade. A incidência do cancro, na sua generalidade, é maior precisamente nessa classe etária. A par de outras doenças igualmente lesivas (e.g. cardiovasculares, degenerativas) cuja incidência aumenta com a idade, o cancro merece relevo. Estudos epidemiológicos apresentam o cancro como líder mundial na mortalidade. Em países desenvolvidos, o seu peso representa 25% do número total de óbitos, percentagem essa que mais que duplica noutros países. A obesidade, a baixa ingestão de frutas e vegetais, o sedentarismo, o consumo de tabaco e a ingestão de álcool, configuram-se como cinco dos fatores de risco presentes em 30% das mortes diagnosticadas por cancro. A nível mundial e, em particular no Sul de Portugal, os cancros do estômago, recto e cólon apresentam elevadas taxas de incidência e de mortalidade. Do ponto de vista estritamente económico, o cancro é a doença que mais recursos consome enquanto que do ponto de vista físico e psicológico é uma doença que não limita o seu raio de ação ao doente. O cancro é, portanto, uma doença sempre atual e cada vez mais presente, pois reflete os hábitos e o ambiente de uma sociedade, não obstante as características intrínsecas a cada indivíduo. A adoção de metodologia estatística aplicada à modelação de dados oncológicos é, sobretudo, valiosa e pertinente quando a informação é oriunda de Registos de Cancro de Base Populacional (RCBP). A pertinência é justificada pelo fato destes registos permitirem aferir numa população específica, o risco desta sofrer e/ou vir a sofrer de uma dada neoplasia. O peso que as neoplasias do estômago, cólon e recto assumem foi um dos elementos que motivou o presente estudo que tem por objetivo analisar tendências, projeções, sobrevivências relativas e a distribuição espacial destas neoplasias. Foram considerados neste estudo todos os casos diagnosticados no período 1998-2006, pelo RCBP da região sul de Portugal (ROR-Sul). O estudo descritivo inicial das taxas de incidência e da tendência em cada uma das referidas neoplasias teve como base uma única variável temporal - o ano de diagnóstico - também designada por período. Todavia, uma metodologia que contemple apenas uma única variável temporal é limitativa. No cancro, para além do período, a idade à data do diagnóstico e a coorte de nascimento, são variáveis temporais que poderão prestar um contributo adicional na caracterização das taxas de incidência. A relevância assumida por estas variáveis temporais justificou a sua inclusão numaclasse de modelos designada por modelos Idade-Período-Coorte (Age-Period-Cohort models - APC), utilizada na modelação das taxas de incidência para as neoplasias em estudo. Os referidos modelos permitem ultrapassar o problema de relações não lineares e/ou de mudanças súbitas na tendência linear das taxas. Nos modelos APC foram consideradas a abordagem clássica e a abordagem com recurso a funções suavizadoras. A modelação das taxas foi estratificada por sexo. Foram ainda estudados os respectivos submodelos (apenas com uma ou duas variáveis temporais). Conhecido o comportamento das taxas de incidência, uma questão subsequente prende-se com a sua projeção em períodos futuros. Porém, o efeito de mudanças estruturais na população, ao qual Portugal não é alheio, altera substancialmente o número esperado de casos futuros com cancro. Estimativas da incidência de cancro a nível mundial obtidas a partir de projeções demográficas apontam para um aumento de 25% dos casos de cancro nas próximas duas décadas. Embora a projeção da incidência esteja associada a alguma incerteza, as projeções auxiliam no planeamento de políticas de saúde para a afetação de recursos e permitem a avaliação de cenários e de intervenções que tenham como objetivo a redução do impacto do cancro. O desconhecimento de projeções da taxa de incidência destas neoplasias na área abrangida pelo ROR-Sul, levou à utilização de modelos de projeção que diferem entre si quanto à sua estrutura, linearidade (ou não) dos seus coeficientes e comportamento das taxas na série histórica de dados (e.g. crescente, decrescente ou estável). Os referidos modelos pautaram-se por duas abordagens: (i)modelos lineares no que concerne ao tempo e (ii) extrapolação de efeitos temporais identificados pelos modelos APC para períodos futuros. Foi feita a projeção das taxas de incidência para os anos de 2007 a 2010 tendo em conta o género, idade e neoplasia. É ainda apresentada uma estimativa do impacto económico destas neoplasias no período de projeção. Uma questão pertinente e habitual no contexto clínico e a que o presente estudo pretende dar resposta, reside em saber qual a contribuição da neoplasia em si para a sobrevivência do doente. Nesse sentido, a mortalidade por causa específica é habitualmente utilizada para estimar a mortalidade atribuível apenas ao cancro em estudo. Porém, existem muitas situações em que a causa de morte é desconhecida e, mesmo que esta informação esteja disponível através dos certificados de óbito, não é fácil distinguir os casos em que a principal causa de morte é devida ao cancro. A sobrevivência relativa surge como uma medida objetiva que não necessita do conhecimento da causa específica da morte para o seu cálculo e dar-nos-á uma estimativa da probabilidade de sobrevivência caso o cancro em análise, num cenário hipotético, seja a única causa de morte. Desconhecida a principal causa de morte nos casos diagnosticados com cancro no registo ROR-Sul, foi determinada a sobrevivência relativa para cada uma das neoplasias em estudo, para um período de follow-up de 5 anos, tendo em conta o sexo, a idade e cada uma das regiões que constituem o registo. Foi adotada uma análise por período e as abordagens convencional e por modelos. No epílogo deste estudo, é analisada a influência da variabilidade espaço-temporal nas taxas de incidência. O longo período de latência das doenças oncológicas, a dificuldade em identificar mudanças súbitas no comportamento das taxas, populações com dimensão e riscos reduzidos, são alguns dos elementos que dificultam a análise da variação temporal das taxas. Nalguns casos, estas variações podem ser reflexo de flutuações aleatórias. O efeito da componente temporal aferida pelos modelos APC dá-nos um retrato incompleto da incidência do cancro. A etiologia desta doença, quando conhecida, está associada com alguma frequência a fatores de risco tais como condições socioeconómicas, hábitos alimentares e estilo de vida, atividade profissional, localização geográfica e componente genética. O “contributo”, dos fatores de risco é, por vezes, determinante e não deve ser ignorado. Surge, assim, a necessidade em complementar o estudo temporal das taxas com uma abordagem de cariz espacial. Assim, procurar-se-á aferir se as variações nas taxas de incidência observadas entre os concelhos inseridos na área do registo ROR-Sul poderiam ser explicadas quer pela variabilidade temporal e geográfica quer por fatores socioeconómicos ou, ainda, pelos desiguais estilos de vida. Foram utilizados os Modelos Bayesianos Hierárquicos Espaço-Temporais com o objetivo de identificar tendências espaço-temporais nas taxas de incidência bem como quantificar alguns fatores de risco ajustados à influência simultânea da região e do tempo. Os resultados obtidos pela implementação de todas estas metodologias considera-se ser uma mais valia para o conhecimento destas neoplasias em Portugal.------------ABSTRACT: mortality rates, with the elderly being an increasingly representative sector of the population, mainly due to greater longevity. The incidence of cancer, in general, is greater precisely in that age group. Alongside with other equally damaging diseases (e.g. cardiovascular,degenerative), whose incidence rates increases with age, cancer is of special note. In epidemiological studies, cancer is the global leader in mortality. In developed countries its weight represents 25% of the total number of deaths, with this percentage being doubled in other countries. Obesity, a reduce consumption of fruit and vegetables, physical inactivity, smoking and alcohol consumption, are the five risk factors present in 30% of deaths due to cancer. Globally, and in particular in the South of Portugal, the stomach, rectum and colon cancer have high incidence and mortality rates. From a strictly economic perspective, cancer is the disease that consumes more resources, while from a physical and psychological point of view, it is a disease that is not limited to the patient. Cancer is therefore na up to date disease and one of increased importance, since it reflects the habits and the environment of a society, regardless the intrinsic characteristics of each individual. The adoption of statistical methodology applied to cancer data modelling is especially valuable and relevant when the information comes from population-based cancer registries (PBCR). In such cases, these registries allow for the assessment of the risk and the suffering associated to a given neoplasm in a specific population. The weight that stomach, colon and rectum cancers assume in Portugal was one of the motivations of the present study, that focus on analyzing trends, projections, relative survival and spatial distribution of these neoplasms. The data considered in this study, are all cases diagnosed between 1998 and 2006, by the PBCR of Portugal, ROR-Sul.Only year of diagnosis, also called period, was the only time variable considered in the initial descriptive analysis of the incidence rates and trends for each of the three neoplasms considered. However, a methodology that only considers one single time variable will probably fall short on the conclusions that could be drawn from the data under study. In cancer, apart from the variable period, the age at diagnosis and the birth cohort are also temporal variables and may provide an additional contribution to the characterization of the incidence. The relevance assumed by these temporal variables justified its inclusion in a class of models called Age-Period-Cohort models (APC). This class of models was used for the analysis of the incidence rates of the three cancers under study. APC models allow to model nonlinearity and/or sudden changes in linear relationships of rate trends. Two approaches of APC models were considered: the classical and the one using smoothing functions. The models were stratified by gender and, when justified, further studies explored other sub-models where only one or two temporal variables were considered. After the analysis of the incidence rates, a subsequent goal is related to their projections in future periods. Although the effect of structural changes in the population, of which Portugal is not oblivious, may substantially change the expected number of future cancer cases, the results of these projections could help planning health policies with the proper allocation of resources, allowing for the evaluation of scenarios and interventions that aim to reduce the impact of cancer in a population. Worth noting that cancer incidence worldwide obtained from demographic projections point out to an increase of 25% of cancer cases in the next two decades. The lack of projections of incidence rates of the three cancers under study in the area covered by ROR-Sul, led us to use a variety of forecasting models that differ in the nature and structure. For example, linearity or nonlinearity in their coefficients and the trend of the incidence rates in historical data series (e.g. increasing, decreasing or stable).The models followed two approaches: (i) linear models regarding time and (ii) extrapolation of temporal effects identified by the APC models for future periods. The study provide incidence rates projections and the numbers of newly diagnosed cases for the year, 2007 to 2010, taking into account gender, age and the type of cancer. In addition, an estimate of the economic impact of these neoplasms is presented for the projection period considered. This research also try to address a relevant and common clinical question in these type of studies, regarding the contribution of the type of cancer to the patient survival. In such studies, the primary cause of death is commonly used to estimate the mortality specifically due to the cancer. However, there are many situations in which the cause of death is unknown, or, even if this information is available through the death certificates, it is not easy to distinguish the cases where the primary cause of death is the cancer. With this in mind, the relative survival is an alternative measure that does not need the knowledge of the specific cause of death to be calculated. This estimate will represent the survival probability in the hypothetical scenario of a certain cancer be the only cause of death. For the patients with unknown cause of death that were diagnosed with cancer in the ROR-Sul, the relative survival was calculated for each of the cancers under study, for a follow-up period of 5 years, considering gender, age and each one of the regions that are part the registry. A period analysis was undertaken, considering both the conventional and the model approaches. In final part of this study, we analyzed the influence of space-time variability in the incidence rates. The long latency period of oncologic diseases, the difficulty in identifying subtle changes in the rates behavior, populations of reduced size and low risk are some of the elements that can be a challenge in the analysis of temporal variations in rates, that, in some cases, can reflect simple random fluctuations. The effect of the temporal component measured by the APC models gives an incomplete picture of the cancer incidence. The etiology of this disease, when known, is frequently associated to risk factors such as socioeconomic conditions, eating habits and lifestyle, occupation, geographic location and genetic component. The "contribution"of such risk factors is sometimes decisive in the evolution of the disease and should not be ignored. Therefore, there was the need to consider an additional approach in this study, one of spatial nature, addressing the fact that changes in incidence rates observed in the ROR-Sul area, could be explained either by temporal and geographical variability or by unequal socio-economic or lifestyle factors. Thus, Bayesian hierarchical space-time models were used with the purpose of identifying space-time trends in incidence rates together with the the analysis of the effect of the risk factors considered in the study. The results obtained and the implementation of all these methodologies are considered to be an added value to the knowledge of these neoplasms in Portugal.