Transcriptional regulation of the mannosyltransferase-encoding gene pigm in inherited glycosylphosphatidylinositol (GPI) deficiency

RESUMO:O glicosilfosfatidilinositol (GPI) é um complexo glicolipídico utlizado por dezenas de proteínas, o qual medeia a sua ancoragem à superfície da célula. Proteínas de superfície celular ancoradas a GPI apresentam várias funções essenciais para a manutenção celular. A deficiência na síntese de GPI é o que caracteriza principalmente a deficiência hereditária em GPI, um grupo de doenças autossómicas raras que resultam de mutações nos genes PIGA, PIGL, PIGM, PIGV, PIGN, PIGO e PIGT, os quais sao indispensáveis para a biossíntese do GPI. Uma mutação pontual no motivo rico em GC -270 no promotor de PIGM impede a ligação do factor de transcrição (FT) Sp1 à sua sequência de reconhecimento, impondo a compactação da cromatina, associada à hipoacetilação de histonas, e consequentemente, impedindo a transcrição de PIGM. Desta forma, a adição da primeira manose ao GPI é comprometida, a síntese de GPI diminui assim como as proteínas ligadas a GPI à superficie das células. Pacientes com Deficiência Hereditária em GPI-associada a PIGM apresentam trombose e epilesia, e ausência de hemólise intravascular e anemia, sendo que estas duas últimas características definem a Hemoglobinúria Paroxística Nocturna (HPN), uma doença rara causada por mutações no gene PIGA. Embora a mutação que causa IGD seja constitutiva e esteja presente em todos os tecidos, o grau de deficiência em GPI varia entre células do mesmo tecido e entre células de tecidos diferentes. Por exemplo nos granulócitos e linfócitos B a deficiência em GPI é muito acentuada mas nos linfócitos T, fibroblastos, plaquetas e eritrócitos é aproximadamente normal, daí a ausência de hemólise intravascular. Os eventos transcricionais que estão na base da expressão diferencial da âncora GPI nas células hematopoiéticas são desconhecidos e constituem o objectivo geral desta tese. Em primeiro lugar, os resultados demonstraram que os níveis de PIGM mRNA variam entre células primárias hematopoiéticas normais. Adicionalmente, a configuração dos nucleossomas no promotor de PIGM é mais compacta em células B do que em células eritróides e tal está correlacionado com os níveis de expressão de PIGM, isto é, inferior nas células B. A presença de vários motivos de ligação para o FT específico da linhagem megacariocítica-eritróide GATA-1 no promotor de PIGM sugeriu que GATA-1 desempenha um papel regulador na sua transcrição. Os resultados mostraram que muito possivelmente GATA-1 desempenha um papel repressor em vez de activador da expressão de PIGM. Resultados preliminares sugerem que KLF1, um factor de transcrição restritamente eritróide, regula a transcrição de PIGM independentemente do motivo -270GC. Em segundo lugar, a investigação do papel dos FTs Sp demonstrou que Sp1 medeia directamente a transcrição de PIGM em ambas as células B e eritróide. Curiosamente, ao contrário do que acontece nas células B, em que a transcrição de PIGM requer a ligação do FT geral Sp1 ao motivo -270GC, nas células eritróides Sp1 regula a transcrição de PIGM ao ligar-se a montante e não ao motivo -270GC. Para além disso, demonstrou-se que Sp2 não é um regulador directo da transcrição de PIGM quer nas células B quer nas células eritróides. Estes resultados explicam a ausência de hemólise intravascular nos doentes com IGD associada a PIGM, uma das principais características que define a HPN. Por último, resultados preliminares mostraram que a repressão da transcrição de PIGM devida à mutação patogénica -270C>G está associada com a diminuição da frequência de interacções genómicas em cis entre PIGM e os seus genes “vizinhos”, sugerindo adicionalmente que a regulação de PIGM e desses genes é partilhada. No seu conjunto, os resultados apresentados nesta tese contribuem para o conhecimento do controlo transcricional de um gene housekeeping, específico-detecido, por meio de FTs genéricos e específicos de linhagem.-------------ABSTRACTC: Glycosylphosphatidylinositol (GPI) is a complex glycolipid used by dozens of proteins for cell surface anchoring. GPI-anchored proteins have various functions that are essential for the cellular maintenance. Defective GPI biosynthesis is the hallmark of inherited GPI deficiency (IGD), a group of rare autosomal diseases caused by mutations in PIGA, PIGL, PIGM, PIGV, PIGN, PIGO and PIGT, all genes indispensable for GPI biosynthesis. A point mutation in the -270GC-rich box in the core promoter of PIGM disrupts binding of the transcription factor (TF) Sp1 to it, imposing nucleosome compaction associated with histone hypoacetylation, thus abrogating transcription of PIGM. As a consequence of PIGM transcriptional repression, addition of the first mannose residue onto the GPI core and thus GPI production are impaired; and expression of GPI-anchored proteins on the surface of cells is severely impaired. Patients with PIGM-associated IGD suffer from life-threatening thrombosis and epilepsy but not intravascular haemolysis and anaemia, two defining features of paroxysmal nocturnal haemoglobinuria (PNH), a rare disease caused by somatic mutations in PIGA. Although the disease-causing mutation in IGD is constitutional and present in all tissues, the degree of GPI deficiency is variable and differs between cells of the same and of different tissues. Accordingly, GPI deficiency is severe in granulocytes and B cells but mild in T cells, fibroblasts, platelets and erythrocytes, hence the lack of intravascular haemolysis.The transcriptional events underlying differential expression of GPI in the haematopoietic cells of PIG-M-associated IGD are not known and constitute the general aim of this thesis. Firstly, I found that PIGM mRNA levels are variable amongst normal primary haematopoietic cells. In addition, the nucleosome configuration in the promoter of PIGM is more compacted in B cells than in erythroid cells and this correlated with the levels of PIGM mRNA expression, i.e., lower in B cells. The presence of several binding sites for GATA-1, a mega-erythroid lineage-specific transcription factor (TF), at the PIGM promoter suggested that GATA-1 has a role on PIGM transcription. My results showed that GATA-1 in erythroid cells is most likely a repressor rather than an activator of PIGM expression. Preliminary data suggested that KLF1, an erythroid-specific TF, regulates PIGM transcription but independently of the -270GC motif. Secondly, investigation of the role of the Sp TFs showed that Sp1 directly mediates PIGM transcriptional regulation in both B and erythroid cells. However, unlike in B cells in which active PIGM transcription requires binding of the generic TF Sp1 to the -270GC-rich box, in erythroid cells, Sp1 regulates PIGM transcription by binding upstream of but not to the -270GC-rich motif. Additionally, I showed that Sp2 is not a direct regulator of PIGM transcription in B and erythroid cells. These findings explain lack of intravascular haemolysis in PIGM-associated IGD, a defining feature of PNH. Lastly, preliminary work shows that transcriptional repression of PIG-M by the pathogenic -270C>G mutation is associated with reduced frequency of in cis genomic interactions between PIGM and its neighbouring genes, suggesting a shared regulatory link between these genes and PIGM. Altogether, the results presented in this thesis provide novel insights into tissuespecific transcriptional control of a housekeeping gene by lineage-specific and generic TFs.

Promoção e difusão da língua portuguesa na República da Guiné-Bissau: o PASEG e as OfLP

A conjuntura de fragilidade que caracteriza a República da Guiné-Bissau aliada à pobreza do povo deste pequeno território da África Ocidental tem tido consequências catastróficas tanto na educação como no desenvolvimento do país. Cientes de que a educação constitui uma das chaves para a superação do subdesenvolvimento, o Governo guineense e a comunidade internacional têm reunido esforços, procurando inverter o cenário registado. O Estado português, sensível à situação do sistema educativo guineense, tem concentrado cerca de 50% do orçamento da ajuda destinada ao país, no âmbito da cooperação bilateral, à educação. Com este trabalho pretende-se analisar e compreender o impacto do projeto da cooperação portuguesa Programa de Apoio ao Sistema Educativo da Guiné-Bissau (PASEG), particularmente das Oficinas em Língua Portuguesa (OfLP), na promoção e difusão do português no país. Procura-se não só compreender se estes contribuíram para o desenvolvimento do sistema educativo guineense e para o uso do português nas escolas, como para a formação contínua de professores, a dinamização e requalificação das escolas, a implementação de uma abordagem do português como língua segunda e para uma aproximação dos jovens à língua oficial. A persecução dos objetivos da investigação resultará da aplicação de questionários e da recolha de testemunhos.

Hospital-empresa : crónica de um nascimento retardado : Políticas de saúde : Em foco

RESUMO - A gestão empresarial dos hospitais é uma velha aspiração do sistema e dos profissionais da saúde em Portugal. Já o Estatuto Hospitalar de 1968 previa a organização e a gestão dos hospitais «em termos de gestão empresarial». A Lei de Bases da Saúde, de 1990, relembrava que a administração das unidades de saúde deveria obedecer a «regras de gestão empresarial». O Hospital Fernando da Fonseca, criado desde 1991, foi objecto de concessão de gestão por contrato, precedendo concurso público, a uma entidade privada, em 1995. Em 1997, o relatório do Grupo de Trabalho sobre o Estatuto Jurídico do Hospital recomendava a adopção da figura de instituto público com natureza empresarial, adequada autonomia de gestão e forte responsabilidade, podendo regular-se, em alguns domínios, por normas de direito privado. Em 1998 foi criado o Hospital de São Sebastião, em Santa Maria da Feira, com formas inovadoras de gestão, utilizando meios de gestão maleáveis. Em 1999 foi criada a Unidade Local de Saúde de Matosinhos, englobando não apenas o Hospital de Pedro Hispano, naquela cidade, mas também os quatro centros de saúde da sua área de atracção. Em 2001 foi criado o Hospital do Barlavento Algarvio, em moldes semelhantes aos do Hospital de São Sebastião. Os restantes hospitais públicos mantiveram a estrutura e regras de funcionamento convencionais. Observa-se que o modelo de gestão convencional do hospital público tem hoje consequências desfavoráveis para os cidadãos, para os profissionais que nele trabalham e também para o sistema de saúde no seu conjunto. Em 2002, uma nova lei alterou disposições da Lei de Bases da Saúde de 1990 e aprovou um novo regime jurídico de gestão hospitalar. De acordo com ele, a rede de prestação de cuidados de saúde passou a integrar vários modelos de hospitais: hospitais SPA, hospitais EPE, hospitais SA, clínicas privadas com ou sem nome de hospital, instituições e serviços geridos por entidades públicas ou privadas, mediante contrato de gestão e hospitais PPP. Analisam-se os ganhos introduzidos pelo modelo inovador de hospital SA, no que respeita ao estatuto, dotação de capital, poderes especiais, regras de controlo financeiro, regimes laborais, órgãos sociais, instrumentos de gestão e direcção técnica. Finalmente, antecipa-se um quadro analítico de oportunidades e riscos sobre este modelo. As críticas têm-se concentrado sobre a estratégia de mudança e sobre o mecanismo de escolha dos dirigentes e das respectivas chefias intermédias. Em relação à estratégia, conclui-se ser a questão mais empírica do que conceptual. Em relação à forma de identificação dos dirigentes, recomenda-se o acompanhamento crítico da experiência, salientando-se, a par do que ela pode trazer de positivo, os riscos de partidarização e instabilidade.

Protecção de crianças e jovens em Portugal

The causes of children rights and youth rights have been the focus of our attention. The ideals of freedom and justice accompany us in our daily lives and, as such, this thesis aims to study the questions of major importance in the field of children and youth protection in Portugal which deserve deep and serious reflection. We shall start with a brief theoretical framework of the evolution of the rights of children and youth in Portugal, defining some concepts. This will be followed by an analysis of all relevant Portuguese legislation, which will set out its fields of application, measures, objectives and underlying principles. There are multiple reasons to raise awareness to the importance of the topics that will be treated and to the necessity and urgency of thinking about an effective promotion and protection of children and youth in Portugal. Keywords: children,