Desenvolvimento de m��todos de espetroscopia NIR. Quantifica����o de grupos hidr��xilo em pol��meros

O objetivo deste estudo �� o desenvolvimento e valida����o de m��todos espectrosc��picos (espectroscopia NIR) que possam vir a substituir os m��todos qu��micos convencionais, para quantifica����o de grupos hidr��xilo em resinas alqu��dicas. As resinas alqu��dicas estudadas neste trabalho s��o normalmente utilizadas em sistemas de revestimento de dois componentes, em que os seus grupos hidr��xilo reagem com pr��-pol��meros de isocianato para formar revestimentos de alta dureza. Por este motivo e por quest��es processuais ligadas �� estequiometria da rea����o existente na aplica����o referida, �� extremamente importante a quantifica����o destes grupos. O m��todo mais comum de quantifica����o de grupos hidr��xilo �� conhecido como m��todo de titula����o. Este �� um m��todo demorado, pois cada medi����o implica um procedimento experimental de cerca de duas horas, para al��m de ser muito dispendioso, a n��vel econ��mico. Foram estudadas as influ��ncias da temperatura, heterogeneidade e n��vel de enchimento da célula na recolha do espectro. As conclus��es dos estudos mencionados levaram �� fixa����o de um tempo ideal de perman��ncia da célula dentro da c��mara do espectrofot��metro antes da medi����o do espectro. Para al��m disto, conclui-se que para lotes standard, a heterogeneidade n��o �� uma vari��vel significativa. O n��vel da célula deve ser mantido constante. Os m��todos desenvolvidos, baseados na norma de qualidade ISO 15063:2011, foram constru��dos a partir de algoritmos de Partial Least Squares Regression (PLS), utilizando um equipamento NIRVIS, B��chi��. Foram obtidos bons coeficientes de regress��o linear para a Resina A (R2>0,9). Quanto aos restantes resultados, estes indicam a possibilidade de aplica����o em resinas do mesmo tipo. Este m��todo proporciona resultados 8 vezes mais r��pidos e com custos em material que representam 1% do m��todo standard.

Desenvolvimento de m��todos de espetroscopia NIR. Quantifica����o de grupos hidr��xilo em pol��meros

O objetivo deste estudo �� o desenvolvimento e valida����o de m��todos espectrosc��picos (espectroscopia NIR) que possam vir a substituir os m��todos qu��micos convencionais, para quantifica����o de grupos hidr��xilo em resinas alqu��dicas. As resinas alqu��dicas estudadas neste trabalho s��o normalmente utilizadas em sistemas de revestimento de dois componentes, em que os seus grupos hidr��xilo reagem com pr��-pol��meros de isocianato para formar revestimentos de alta dureza. Por este motivo e por quest��es processuais ligadas �� estequiometria da rea����o existente na aplica����o referida, �� extremamente importante a quantifica����o destes grupos. O m��todo mais comum de quantifica����o de grupos hidr��xilo �� conhecido como m��todo de titula����o. Este �� um m��todo demorado, pois cada medi����o implica um procedimento experimental de cerca de duas horas, para al��m de ser muito dispendioso, a n��vel econ��mico. Foram estudadas as influ��ncias da temperatura, heterogeneidade e n��vel de enchimento da célula na recolha do espectro. As conclus��es dos estudos mencionados levaram �� fixa����o de um tempo ideal de perman��ncia da célula dentro da c��mara do espectrofot��metro antes da medi����o do espectro. Para al��m disto, conclui-se que para lotes standard, a heterogeneidade n��o �� uma vari��vel significativa. O n��vel da célula deve ser mantido constante. Os m��todos desenvolvidos, baseados na norma de qualidade ISO 15063:2011, foram constru��dos a partir de algoritmos de Partial Least Squares Regression (PLS), utilizando um equipamento NIRVIS, B��chi��. Foram obtidos bons coeficientes de regress��o linear para a Resina A (R2>0,9). Quanto aos restantes resultados, estes indicam a possibilidade de aplica����o em resinas do mesmo tipo. Este m��todo proporciona resultados 8 vezes mais r��pidos e com custos em material que representam 1% do m��todo standard.

Altera����o da metila����o do DNA ap��s exposi����o prolongada a fitoqu��micos

Parte do trabalho efetuado durante este projeto de disserta����o foi publicado na revista Chemico-Biological Interactions. E apresentado no ���50th Congress of the European Societies of Toxicology 7th - 10th September 2014 Edinburgh International Conference Centre, Edinburgh, Scotland��� em forma de poster.

Melanosome transfer between melanocytes and keratinocytes

RESUMO: A pele �� o maior ��rg��o do corpo humano e a sua pigmenta����o �� essencial para a sua colora����o e prote����o contra os efeitos nocivos da radia����o ultravioleta (UV). A pigmenta����o da pele resulta essencialmente de tr��s processos: a s��ntese e o armazenamento de melanina pelos melan��citos, em organelos especializados denominados melanossomas; o transporte dos melanossomas dentro dos melan��citos; e finalmente, a transfer��ncia dos melanossomas para os queratin��citos adjacentes. Nos queratin��citos, a melanina migra para a regi��o perinuclear apical da célula para formar um escudo protetor,respons��vel pela prote����o do DNA dos danos causados pela radia����o UV. Os melan��citos est��o localizados na camada basal da epiderme e contactam com 30-40 queratin��citos. Em conjunto, estas células formam a ���unidade melano-epid��rmica���. Apesar dos processos de s��ntese e transporte de melanina nos melan��citos estarem bastante bem caracterizados, os mecanismos moleculares subjacentes �� transfer��ncia inter-celular de melanina s��o menos conhecidos e ainda controversos. Dados preliminares obtidos pelo nosso grupo, que se basearam na observa����o de amostras de pele humana por microscopia electr��nica, indicam que a forma predominante de transfer��ncia de melanina na epiderme consiste na exocitose dos melanossomas pelos melan��citos e subsequente endocitose da melanina por queratin��citos. Para al��m disso sabe-se que as prote��nas Rab, que controlam o tr��fego membranar, est��o envolvidas em v��rias etapas de pigmenta����o da pele, nomeadamente na biog��nese e no transporte de melanina. Assim, dado o seu papel fundamental nestes processos, question��mo-nos sobre o seu envolvimento na transfer��ncia de melanina. Com este trabalho, propomo-nos a expandir o conhecimento atual sobre a transfer��ncia de melanina na pele, atrav��s do estudo detalhado dos seus mecanismos moleculares, identificando as prote��nas Rab que regulam o processo. Pretendemos tamb��m confirmar o modelo de exo/endocitose como sendo o mecanismo principal de transfer��ncia de melanina. Primeiro, explor��mos a regula����o da secre����o de melanina pelos melan��citos e analis��mos o papel de prote��nas Rab neste processo. Os resultados foram obtidos recorrendo a um m��todo in vitro, desenvolvido previamente no laborat��rio, que avalia a quantidade de melanina segregada para o meio de cultura por espectrofotometria, e ainda por microscopia, contando o n��mero de melanossomas transferidos para os queratin��citos. Atrav��s de co-culturas de melan��citos e queratin��citos, verificou-se que os queratin��citos estimulam a liberta����o de melanina dos melan��citos para o meio extra-celular, bem como a sua transfer��ncia para os queratin��citos. Al��m disso, a prote��na Rab11b foi identificada como um regulador da exocitose de melanina e da sua transfer��ncia para os queratin��citos. De facto, a diminui����o da express��o de Rab11b em melan��citos provocou a redu����o da secre����o de melanina estimulada por queratin��citos, bem como da transfer��ncia desta. Em segundo lugar, para complementar o nosso estudo, centr��mos a nossa investiga����o na internaliza����o de melanina por queratin��citos. Especificamente, usando uma biblioteca de siRNA, explor��mos o envolvimento de prote��nas Rab na capta����o de melanina por queratin��citos. Como primeira abordagem, us��mos esferas fluorescentes como substituto de melanina, avaliando os resultados por citometria de fluxo. No entanto, este m��todo revelou-se ineficaz uma vez que a internaliza����o destas esferas �� independente do recetor PAR-2 (recetor 2 ativado por protease), que foi previamente descrito como essencial na capta����o de melanina por queratin��citos Posteriormente, foi desenvolvido um novo protocolo de endocitose baseado em microscopia, usando melanossomas sem a membrana envolvente (melanocores) purificados do meio de cultura de melan��citos, incluindo um programa inform��tico especialmente desenhado para realizar uma an��lise semi-automatizada. Ap��s internaliza����o, os melanocores acumulam-se na regi��o perinuclear dos queratin��citos, em estruturas que se assemelham ao escudo supranuclear observado na pele humana. Seguidamente, o envolvimento do recetor PAR-2 na capta����o de melanocores por queratin��citos foi confirmado, utilizando o novo protocolo de endocitose desenvolvido. Para al��m disso, a necessidade de quatro prote��nas Rab foi identificada na internaliza����o de melanocores por queratin��citos. A redu����o da express��o de Rab1a ou Rab5b em queratin��citos diminuiu significativamente o n��vel de internaliza����o de melanocores, enquanto o silenciamento da express��o de Rab2a ou Rab14 aumentou a quantidade de melanocores internalizados por estas células. Em conclus��o, os resultados apresentados corroboram as observa����es anteriores, obtidas em amostras de pele humana, e sugerem que o mecanismo de transfer��ncia predominante �� a exocitose de melanina pelos melan��citos, induzida por queratin��citos, seguida por endocitose pelos queratin��citos. A pigmenta����o da pele tem implica����es tanto ao n��vel da cosm��tica, como ao n��vel m��dico, relacionadas com foto-envelhecimento e com doen��as pigmentares. Assim sendo, ao esclarecer quais os mecanismos moleculares que regulam a transfer��ncia de melanina na pele, este trabalho pode conduzir ao desenvolvimento de novas estrat��gias para modular a pigmenta����o da pele.----------------ABSTRACT: Skin pigmentation is achieved through the highly regulated production of the pigment melanin in specialized organelles, termed melanosomes within melanocytes. These are transported from their site of synthesis to the melanocyte periphery before being transferred to keratinocytes where melanin forms a supra-nuclear cap to protect the DNA from UVinduced damage. Together, melanocytes and keratinocytes form a functional complex, termed ���epidermal-melanin unit���, that confers color and photoprotective properties to the skin. Skin pigmentation requires three processes: the biogenesis of melanin; its intracelular transport within the melanocyte to the cell periphery; and the melanin transfer to keratinocytes. The first two processes have been extensively characterized. However, despite significant advances that have been made over the past few years, the mechanisms underlying inter-cellular transfer of pigment from melanocytes to keratinocytes remain controversial.Preliminary studies from our group using electron microscopy and human skin samples found evidence for a mechanism of coupled exocytosis-endocytosis. Rab GTPases are master regulators of intracellular trafficking and have already been implicated in several steps of skin pigmentation. Thus, we proposed to explore and characterize the molecular mechanisms of melanin transfer and the role of Rab GTPases in this process. Moreover, we investigated whether the exo/endocytosis model is the main mechanism of melanin transfer. We first focused on melanin exocytosis by melanocytes. Then, we started to investigate the key regulatory Rab proteins involved in this step by establishing an in vitro tissue culture model of melanin secretion. Using co-cultures of melanocytes and keratinocytes, we found that keratinocytes stimulate melanin release and transfer. Moreover, depletion of Rab11b decreases keratinocyte-induced melanin exocytosis by melanocytes. In order to determine whether melanin exocytosis is a predominant mechanism of melanin transfer, the amount of melanin transferred to keratinocytes was then assayed in conditions where melanin exocytosis was inhibited. Indeed, Rab11b depletion resulted in a significant decrease in melanin uptake by keratinocytes. Taken together, these observations suggest that Rab11b mediates melanosome exocytosis from melanocytes and transfer to keratinocytes. To complement and extend our study, we of melanin by keratinocytes. Thus, we aimed to explore the effect of depleting Rab GTPases on melanin uptake and trafficking within keratinocytes. As a first approach, we used fluorescent microspheres as a melanin surrogate. However, the uptake of microspheres was observed to be independent of PAR-2, a receptor that is required for melanin uptakecentred our attention in the internalization of melanin by keratinocytes. Thus, we aimed to explore the effect of depleting Rab GTPases on melanin uptake and trafficking within keratinocytes. As a first approach, we used fluorescent microspheres as a melanin surrogate. However, the uptake of microspheres was observed to be independent of PAR-2, a receptor that is required for melanin uptake.Therefore, we concluded that microspheres were uptaken by keratinocytes through a different pathway than melanin. Subsequently, we developed a microscopy-based endocytosis assay using purified melanocores (melanosomes lacking the limiting membrane) from melanocytes, including a program to perform a semi-automated analysis. Melanocores are taken up by keratinocytes and accumulate in structures in the perinuclear area that resemble the physiological supranuclear cap observed in human skin. We then confirmed the involvement of PAR-2 receptor in the uptake of melanocores by keratinocytes, using the newly developed assay. Furthermore, we identified the role of four Rab GTPases on the uptake of melanocores by keratinocytes. Depletion of Rab1a and Rab5b from keratinocytes significantly reduced the uptake of melanocores, whereas Rab2a, and Rab14 silencing increased the amount the melanocores internalized by XB2 keratinocytes. In conclusion, we present evidence supporting keratinocyte-inducedmelanosome exocytosis from melanocytes, followed by endocytosis of the melanin core by keratinocytes as the predominant mechanism of melanin transfer in skin. Although advances have been made, there is a need for more effective and safer therapies directed at pigmentation disorders and also treatments for cosmetic applications. Hence, the understanding of the above mechanisms of skin pigmentation will lead to a greater appreciation of the molecular machinery underlying human skin pigmentation and could interest the pharmaceutical and cosmetic industries.

Transcriptional regulation of the mannosyltransferase-encoding gene pigm in inherited glycosylphosphatidylinositol (GPI) deficiency

RESUMO:O glicosilfosfatidilinositol (GPI) �� um complexo glicolip��dico utlizado por dezenas de prote��nas, o qual medeia a sua ancoragem �� superf��cie da célula. Prote��nas de superf��cie celular ancoradas a GPI apresentam v��rias fun����es essenciais para a manuten����o celular. A defici��ncia na s��ntese de GPI �� o que caracteriza principalmente a defici��ncia heredit��ria em GPI, um grupo de doen��as autoss��micas raras que resultam de muta����es nos genes PIGA, PIGL, PIGM, PIGV, PIGN, PIGO e PIGT, os quais sao indispens��veis para a bioss��ntese do GPI. Uma muta����o pontual no motivo rico em GC -270 no promotor de PIGM impede a liga����o do factor de transcri����o (FT) Sp1 �� sua sequ��ncia de reconhecimento, impondo a compacta����o da cromatina, associada �� hipoacetila����o de histonas, e consequentemente, impedindo a transcri����o de PIGM. Desta forma, a adi����o da primeira manose ao GPI �� comprometida, a s��ntese de GPI diminui assim como as prote��nas ligadas a GPI �� superficie das células. Pacientes com Defici��ncia Heredit��ria em GPI-associada a PIGM apresentam trombose e epilesia, e aus��ncia de hem��lise intravascular e anemia, sendo que estas duas ��ltimas caracter��sticas definem a Hemoglobin��ria Parox��stica Nocturna (HPN), uma doen��a rara causada por muta����es no gene PIGA. Embora a muta����o que causa IGD seja constitutiva e esteja presente em todos os tecidos, o grau de defici��ncia em GPI varia entre células do mesmo tecido e entre células de tecidos diferentes. Por exemplo nos granul��citos e linf��citos B a defici��ncia em GPI �� muito acentuada mas nos linf��citos T, fibroblastos, plaquetas e eritr��citos �� aproximadamente normal, da�� a aus��ncia de hem��lise intravascular. Os eventos transcricionais que est��o na base da express��o diferencial da ��ncora GPI nas células hematopoi��ticas s��o desconhecidos e constituem o objectivo geral desta tese. Em primeiro lugar, os resultados demonstraram que os n��veis de PIGM mRNA variam entre células prim��rias hematopoi��ticas normais. Adicionalmente, a configura����o dos nucleossomas no promotor de PIGM �� mais compacta em células B do que em células eritr��ides e tal est�� correlacionado com os n��veis de express��o de PIGM, isto ��, inferior nas células B. A presen��a de v��rios motivos de liga����o para o FT espec��fico da linhagem megacarioc��tica-eritr��ide GATA-1 no promotor de PIGM sugeriu que GATA-1 desempenha um papel regulador na sua transcri����o. Os resultados mostraram que muito possivelmente GATA-1 desempenha um papel repressor em vez de activador da express��o de PIGM. Resultados preliminares sugerem que KLF1, um factor de transcri����o restritamente eritr��ide, regula a transcri����o de PIGM independentemente do motivo -270GC. Em segundo lugar, a investiga����o do papel dos FTs Sp demonstrou que Sp1 medeia directamente a transcri����o de PIGM em ambas as células B e eritr��ide. Curiosamente, ao contr��rio do que acontece nas células B, em que a transcri����o de PIGM requer a liga����o do FT geral Sp1 ao motivo -270GC, nas células eritr��ides Sp1 regula a transcri����o de PIGM ao ligar-se a montante e n��o ao motivo -270GC. Para al��m disso, demonstrou-se que Sp2 n��o �� um regulador directo da transcri����o de PIGM quer nas células B quer nas células eritr��ides. Estes resultados explicam a aus��ncia de hem��lise intravascular nos doentes com IGD associada a PIGM, uma das principais caracter��sticas que define a HPN. Por ��ltimo, resultados preliminares mostraram que a repress��o da transcri����o de PIGM devida �� muta����o patog��nica -270C>G est�� associada com a diminui����o da frequ��ncia de interac����es gen��micas em cis entre PIGM e os seus genes ���vizinhos���, sugerindo adicionalmente que a regula����o de PIGM e desses genes �� partilhada. No seu conjunto, os resultados apresentados nesta tese contribuem para o conhecimento do controlo transcricional de um gene housekeeping, espec��fico-detecido, por meio de FTs gen��ricos e espec��ficos de linhagem.-------------ABSTRACTC: Glycosylphosphatidylinositol (GPI) is a complex glycolipid used by dozens of proteins for cell surface anchoring. GPI-anchored proteins have various functions that are essential for the cellular maintenance. Defective GPI biosynthesis is the hallmark of inherited GPI deficiency (IGD), a group of rare autosomal diseases caused by mutations in PIGA, PIGL, PIGM, PIGV, PIGN, PIGO and PIGT, all genes indispensable for GPI biosynthesis. A point mutation in the -270GC-rich box in the core promoter of PIGM disrupts binding of the transcription factor (TF) Sp1 to it, imposing nucleosome compaction associated with histone hypoacetylation, thus abrogating transcription of PIGM. As a consequence of PIGM transcriptional repression, addition of the first mannose residue onto the GPI core and thus GPI production are impaired; and expression of GPI-anchored proteins on the surface of cells is severely impaired. Patients with PIGM-associated IGD suffer from life-threatening thrombosis and epilepsy but not intravascular haemolysis and anaemia, two defining features of paroxysmal nocturnal haemoglobinuria (PNH), a rare disease caused by somatic mutations in PIGA. Although the disease-causing mutation in IGD is constitutional and present in all tissues, the degree of GPI deficiency is variable and differs between cells of the same and of different tissues. Accordingly, GPI deficiency is severe in granulocytes and B cells but mild in T cells, fibroblasts, platelets and erythrocytes, hence the lack of intravascular haemolysis.The transcriptional events underlying differential expression of GPI in the haematopoietic cells of PIG-M-associated IGD are not known and constitute the general aim of this thesis. Firstly, I found that PIGM mRNA levels are variable amongst normal primary haematopoietic cells. In addition, the nucleosome configuration in the promoter of PIGM is more compacted in B cells than in erythroid cells and this correlated with the levels of PIGM mRNA expression, i.e., lower in B cells. The presence of several binding sites for GATA-1, a mega-erythroid lineage-specific transcription factor (TF), at the PIGM promoter suggested that GATA-1 has a role on PIGM transcription. My results showed that GATA-1 in erythroid cells is most likely a repressor rather than an activator of PIGM expression. Preliminary data suggested that KLF1, an erythroid-specific TF, regulates PIGM transcription but independently of the -270GC motif. Secondly, investigation of the role of the Sp TFs showed that Sp1 directly mediates PIGM transcriptional regulation in both B and erythroid cells. However, unlike in B cells in which active PIGM transcription requires binding of the generic TF Sp1 to the -270GC-rich box, in erythroid cells, Sp1 regulates PIGM transcription by binding upstream of but not to the -270GC-rich motif. Additionally, I showed that Sp2 is not a direct regulator of PIGM transcription in B and erythroid cells. These findings explain lack of intravascular haemolysis in PIGM-associated IGD, a defining feature of PNH. Lastly, preliminary work shows that transcriptional repression of PIG-M by the pathogenic -270C>G mutation is associated with reduced frequency of in cis genomic interactions between PIGM and its neighbouring genes, suggesting a shared regulatory link between these genes and PIGM. Altogether, the results presented in this thesis provide novel insights into tissuespecific transcriptional control of a housekeeping gene by lineage-specific and generic TFs.

Specific features of endothelial cells in primary tumors

RESUMO: As células endoteliais definem e delineiam todo o sistema vascular...Nesta tese procur��mos explorar o papel que o ambiente tumoral exerce sobre as células endoteliais. ... Avaliamos tamb��m a capacidade anti-angiog��nica de alguns derivados do estrog��nio... Em suma os nossos resultados mostram a import��ncia de um controlo rigoroso da regula����o transcricional...

Cellular reprogramming strategies for degenerative disorders involving the retinal pigment epithelium

RESUMO: A reprograma����o celular permite que uma célula som��tica seja reprogramada para outra célula diferente atrav��s da express��o for��ada de factores de transcri����o (FTs) espec��ficos de determinada linhagem celular, e constitui uma ��rea de investiga����o emergente nos ��ltimos anos. As células som��ticas podem ser experimentalmente manipuladas de modo a obter células estaminais pluripotentes induzidas (CEPi), ou convertidas directamente noutro tipo de célula som��tica. Estas descobertas inovadoras oferecem oportunidades promissoras para o desenvolvimento de novas terapias de substitui����o celular e modelos de doen��a, funcionando tamb��m como ferramentas valiosas para o estudo dos mecanismos moleculares que estabelecem a identidade celular e regulam os processos de desenvolvimento. Existem v��rias doen��as degenerativas heredit��rias e adquiridas da retina que causam defici��ncia visual devido a uma disfun����o no tecido de suporte da retina, o epit��lio pigmentar da retina (EPR). Uma destas doen��as �� a Coroideremia (CHM), uma doen��a heredit��ria monog��nica ligada ao cromossoma X causada por muta����es que implicam a perda de fun����o duma prote��na com fun����es importantes na regula����o do tr��fico intracelular. A CHM �� caracterizada pela degeneresc��ncia progressiva do EPR, assim como dos foto-receptores e da cor��ide. Resultados experimentais sugerem que o EPR desempenha um papel importante na patog��nese da CHM, o que parece indicar uma poss��vel vantagem terap��utica na substitui����o do EPR nos doentes com CHM. Por outro lado, existe uma lacuna em termos de modelos in vitro de EPR para estudar a CHM, o que pode explicar o ainda desconhecimento dos mecanismos moleculares que explicam a patog��nese desta doen��a. Assim, este trabalho focou-se principalmente na explora����o das potencialidades das t��cnicas de reprograma����o celular no contexto das doen��as de degeneresc��ncia da retina, em particular no caso da CHM. Células de murganho de estirpe selvagem, bem como células derivadas de um ratinho modelo de knockout condicional de Chm, foram convertidos com sucesso em CEPi recorrendo a um sistema lentiviral induzido que permite a express��o for��ada dos 4 factores cl��ssicos de reprograma����o, a saber Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc. Estas células mostraram ter equival��ncia morfol��gica, molecular e funcional a células estaminais embrion��rias (CES). As CEPi obtidas foram seguidamente submetidas a protocolos de diferencia����o com o objectivo final de obter células do EPR. Os resultados promissores obtidos revelam a possibilidade de gerar um valioso modelo de EPR-CHM para estudos in vitro. Em alternativa, a convers��o directa de linhagens partindo de fibroblastos para obter células do EPR foi tamb��m abordada. Uma vasta gama de ferramentas moleculares foi gerada de modo a implementar uma estrat��gia mediada por FTs-chave, seleccionados devido ao seu papel fundamental no desenvolvimento embrion��rio e especifica����o do EPR. Conjuntos de 10 ou menos FTs foram usados para transduzir fibroblastos, que adquiriram morfologia pigmentada e express��o de alguns marcadores espec��ficos do EPR. Adicionalmente, observou-se a activa����o de regi��es promotoras de genes espec��ficos de EPR, indicando que a identidade transcricional das células foi alterada no sentido pretendido. Em conclus��o, avan��os significativos foram atingidos no sentido da implementa����o de tecnologias de reprograma����o celular j�� estabelecidas, bem como na concep����o de novas estrat��gias inovadoras. Metodologias de reprograma����o, quer para pluripot��ncia, quer via convers��o directa, foram aplicadas com o objectivo final de gerar células do EPR. O trabalho aqui descrito abre novos caminhos para o estabelecimento de terapias de substitui����o celular e, de uma maneira mais directa, levanta a possibilidade de modelar doen��as degenerativas da retina com disfun����o do EPR numa placa de petri, em particular no caso da CHM.---------------ABSTRACT: Cellular reprogramming is an emerging research field in which a somatic cell is reprogrammed into a different cell type by forcing the expression of lineage-specific transcription factors (TFs). Cellular identities can be manipulated using experimental techniques with the attainment of pluripotency properties and the generation of induced Pluripotent Stem (iPS) cells, or the direct conversion of one somatic cell into another somatic cell type. These pioneering discoveries offer new unprecedented opportunities for the establishment of novel cell-based therapies and disease models, as well as serving as valuable tools for the study of molecular mechanisms governing cell fate establishment and developmental processes. Several retinal degenerative disorders, inherited and acquired, lead to visual impairment due to an underlying dysfunction of the support cells of the retina, the retinal pigment epithelium (RPE). Choroideremia (CHM), an X-linked monogenic disease caused by a loss of function mutation in a key regulator of intracellular trafficking, is characterized by a progressive degeneration of the RPE and other components of the retina, such as the photoreceptors and the choroid. Evidence suggest that RPE plays an important role in CHM pathogenesis, thus implying that regenerative approaches aiming at rescuing RPE function may be of great benefit for CHM patients. Additionally, lack of appropriate in vitro models has contributed to the still poorly-characterized molecular events in the base of CHM degenerative process. Therefore, the main focus of this work was to explore the potential applications of cellular reprogramming technology in the context of RPE-related retinal degenerations. The generation of mouse iPS cells was established and optimized using an inducible lentiviral system to force the expression of the classic set of TFs, namely Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc. Wild-type cells, as well as cells derived from a conditional knockout (KO) mouse model of Chm, were successfully converted into a pluripotent state, that displayed morphology, molecular and functional equivalence to Embryonic Stem (ES) cells. Generated iPS cells were then subjected to differentiation protocols towards the attainment of a RPE cell fate, with promising results highlighting the possibility of generating a valuable Chm-RPE in vitro model. In alternative, direct lineage conversion of fibroblasts into RPE-like cells was also tackled. A TF-mediated approach was implemented after the generation of a panoply of molecular tools needed for such studies. After transduction with pools of 10 or less TFs, selected for their key role on RPE developmental process and specification, fibroblasts acquired a pigmented morphology and expression of some RPE-specific markers. Additionally, promoter regions of RPE-specific genes were activated indicating that the transcriptional identity of the cells was being altered into the pursued cell fate. In conclusion, highly significant progress was made towards the implementation of already established cellular reprogramming technologies, as well as the designing of new innovative ones. Reprogramming into pluripotency and lineage conversion methodologies were applied to ultimately generate RPE cells. These studies open new avenues for the establishment of cell replacement therapies and, more straightforwardly,raise the possibility of modelling retinal degenerations with underlying RPE defects in apetri dish, particularly CHM.

Caracteriza����o do papel dos genes TYMS e MTR no desenvolvimento de Cancro Colo-Rectal

RESUMO: O cancro colo-rectal (CCR) �� um dos cancros que possui maior taxa de mortalidade a n��vel mundial. Em Portugal esta patologia �� respons��vel pela morte de cerca de 3700 pessoas por ano, sendo que estes n��meros aumentam de ano para ano. Ao longo das ��ltimas d��cadas o papel das altera����es gen��ticas na etiologia das patologias oncol��gicas tem vindo a ter cada vez mais um maior destaque. O n��mero de estudos que avaliam a import��ncia de polimorfismos, muta����es, altera����es na regula����o g��nica e interac����es entre genes no desenvolvimento destas patologias tem aumentado exponencialmente. Com o aumento do conhecimento da forma como estas altera����es influenciam o desenvolvimento do cancro surgiram os primeiros meios de diagn��stico gen��tico, levando assim a uma altera����o da forma como s��o encarados o diagn��stico e a preven����o destas doen��as. No CCR as formas heredit��rias com altera����es gen��ticas inequivocamente identificadas representam apenas 5% dos casos. Existem cerca de 25% que representam formas heredit��rias para as quais ainda n��o foram estabelecidos os padr��es de altera����es gen��ticas subjacentes. Desta forma, estudos que venham contribuir para um maior conhecimento dos mecanismos moleculares respons��veis pelo aumento da susceptibilidade dos indiv��duos para o desenvolvimento de CCR s��o extremamente importantes. O CCR �� uma patologia multifactorial, onde factores gen��ticos interagem com factores ambientais no surgimento e desenvolvimento da doen��a. Assim, torna-se essencial integrar o estudo das altera����es gen��ticas no contexto ambiental onde os indiv��duos em estudo se encontram. No caso desta patologia um dos principais factores ambientais estudado �� a nutri����o. V��rios estudos t��m sido realizados ao longo dos ��ltimos anos de forma a compreender como pode a ingest��o dos nutrientes influenciar o desenvolvimento de CCR e de que forma interage com as altera����es gen��ticas individuais. O ciclo do folato �� um dos processos metab��licos onde o papel da nutri����o em interac����o com altera����es gen��ticas mais tem sido estudado nos ��ltimos anos. Deste cruzamento entre o estudo das altera����es gen��ticas e ambientais surge a Nutrigen��tica. O conjunto de estudos da presente tese tem como objectivo aumentar o conhecimento do papel das altera����es em genes do ciclo do folato, em interac����o com factores nutricionais e de estilo de vida, n��o s�� no desenvolvimento de CCR, mas tamb��m de outra patologia do tracto gastrointestinal, a Doen��a de Crohn (DC), uma doen��a inflamat��ria muitas vezes associada como factor de risco para o desenvolvimento de CCR. Este estudo debru��ou-se essencialmente no estudo dos genes timidilato sintetase (TYMS) e metionina sintetase (MTR) em popula����es com CCR e DC, bem como no padr��o nutricional destas popula����es com particular incid��ncia nos nutrientes envolvidos no ciclo do folato (folato, metionina, vitamina B6, vitamina B12). Analisando o conjunto de resultados obtidos para os estudos do CCR podemos concluir que quer a TYMS quer a MTR possuem um papel relevante na susceptibilidade para desenvolver esta patologia, assim como t��m destaque no funcionamento do ciclo celular durante o processo oncog��nico. Os resultados demonstram que os factores que levam a uma menor disponibilidade de grupos metil no ciclo de folato (baixos n��veis de folato, altera����o da actividade de MTR, elevada express��o de TYMS) constituem factores de risco, muito provavelmente por contribu��rem para uma desregula����o dos n��veis de metionina dispon��vel para a metila����o do DNA da célula. Demonstram ainda que em células tumorais ocorrem altera����es na regula����o do ciclo do folato de forma a favorecer a s��ntese de DNA em detrimento da metila����o do mesmo, alterando para isso a express��o dos genes de forma a que o fluxo de grupos metil provenientes do folato sejam encaminhados para a enzima TYMS. O polimorfismo de dele����o 6pb da TYMS surge como um factor de diagn��stico e de progn��stico de CCR para a popula����o portuguesa. Dos factores nutricionais analisados apenas o folato aparenta ter um papel relevante na modela����o do risco de desenvolver CCR. Na doen��a de Crohn (DC) podemos verificar que a homociste��na e o seu metabolismo poder��o contribuir para o aparecimento e desenvolvimento da patologia. O aumento da homociste��na poder�� ser o respons��vel por um aumento da resposta auto-imune do organismo, promovendo o aparecimento da DC. O polimorfismo A2756G MTR desempenha um papel preponderante como factor de diagn��stico da DC, tendo sido associado pela primeira vez a esta patologia. Tem tamb��m um papel importante no desenvolvimento da doen��a, uma vez que est�� associado a uma idade de diagn��stico mais baixa, sugerindo assim que o desenvolvimento da doen��a ocorre de forma mais precoce. Concluindo, com este estudo pensamos ter contribu��do para um melhor entendimento do papel do ciclo do folato no desenvolvimento de CCR e DC, sendo um ponto de partida para futuras investiga����es que possam revelar cada vez melhor as complexas interac����es metab��licas desta via e a sua influ��ncia nas patologias estudadas. Do nosso estudo destacamos a import��ncia de uma an��lise global das v��rias etapas do ciclo do folato para que se possa compreender a din��mica que se estabelece no desenvolvimento destas patologias, podendo diversas altera����es, quer a n��vel gen��tico quer a n��vel nutricional, exercerem efeitos diferentes consoante o estado dos restantes intervenientes do ciclo do folato. Acreditamos que no futuro este estudo permitir�� que o conhecimento do ciclo do folato tenha cada vez mais uma relev��ncia fundamental a n��vel de diagn��stico e terap��utica destas patologias.------------ ABSTRACT: Colorectal Cancer (CRC) is one of the cancers that have a higher rate of mortality worldwide. In Portugal this pathology is responsible for the deaths of about 3700 people per year, and these numbers increase each year. Over the past few decades the role of genetic changes in the etiology of oncological pathologies has had an increasingly greater emphasis. The number of studies that evaluate the importance of polymorphisms, mutations, changes in gene regulation and gene interactions in the development of these diseases has increased exponentially. With the increased knowledge of how these changes influence the development of cancer, appeared the first means for genetic diagnostic, leading to a change in the way diagnosis is seen and in the prevention of these diseases. In CRC the hereditary forms with clearly identified genetic changes represent only 5% of cases. There are about 25% representing hereditary forms for which the patterns of genetic changes haven���t been established. In this way, studies that will contribute to a greater understanding of the molecular mechanisms responsible for increased susceptibility of individuals to the CRC development are extremely important. CRC is a multifactorial pathology, where genetic factors interact with environmental factors in the emergence and development of the disease.Thus, it is essential to integrate the study of genetic changes in the environmental context of the individuals under study. In the case of this pathology one of the main environmental factors studied is nutrition. Several studies have been conducted over the past few years in order to understand how the intake of nutrients can influence the development of CRC and how nutrients interact with the individual genetic changes. The folate cycle is one of the metabolic processes where the role of nutrition in interaction with genetic alterations has been studied in recent years. This cross between the study of genetic and environmental changes developed Nutrigenetics. The set of studies of this thesis aims to increase awareness of the role of changes in genes of the folate cycle, in interaction with nutritional factors and lifestyle, not only in the development of CRC, but also of another pathology of the gastrointestinal tract, Crohn's disease (CD), an inflammatory disease often associated as a risk factor for the development of CRC. This study dealt mainly in the study of genes thymidylate synthase (TYMS) and methionine synthase (MTR) in populations with CRC and CD, as well as in the nutritional pattern of these populations with particular focus on nutrients involved in the folate cycle (folate, methionine, vitamin B6, vitamin B12). Analyzing the results obtained for the CRC studies we conclude that either the MTR TYMS have a relevant role in susceptibility to develop this pathology, and have an important role in the functioning of the cell cycle during oncogenesis. The results show that the factors that lead to a lower availability of methyl groups in folate cycle (low levels of folate, change the activity of MTR, high expression of TYMS) constitute risk factors, most likely by contribute to a dysregulation of methionine levels available for DNA methylation of the cell. Our results also demonstrate that in tumor cells occur changes in the regulation of the folate cycle in order to promote the synthesis of DNA, to the detriment of methylation of the same by changing the expression of genes so that the methyl groups from folate are forwarded to the TYMS enzyme reaction. The deletion polymorphism 6bp of TYMS emerges as a diagnostic and prognostic factor of CCR for the Portuguese population. Nutritional factors analyzed only folate appears to have a major role in modulating the risk of developing CCR.In Crohn���s disease (CD) we can check that homocysteine and its metabolism may contribute to the emergence and development of this pathology. Increased homocysteine may be responsible for an increase in the body's autoimmune response, promoting the emergence of CD. The polymorphism A2756G MTR plays a leading role as a factor of diagnosis of DC, having been associated with this pathology for the first time. It also has an important role in the development of the disease, since it is associated with a lower diagnostic age, suggesting that the development of the disease occurs earlier. In conclusion, our study has contributed to a better understanding of the role of folate cycle in the development of CRC and CD, being a starting point for future research that may prove increasingly complex metabolic interactions in this via and its influence on the pathologies studied. In our study we highlight the importance of a comprehensive analysis of the various steps of the folate cycle in order to understand the dynamics that settles in the development of these pathologies, and a number of amendments, whether at the genetic level or at the nutritional level, exercise different effects depending on the stage of the remaining participants in the folate cycle. We believe that in the future this study will allow the knowledge of folate cycle to have increasingly a fundamental relevance at the level of diagnosis and treatment of these diseases.

Desenvolvimento de novas ferramentas anal��ticas para a monitoriza����o da actividade da Paraoxonase 1 em amostras de plasma humano

Segundo a Organiza����o Mundial da Sa��de (OMS), as doen��as cardiovasculares (DCV) s��o a principal causa de morte nos pa��ses desenvolvidos. H�� uma necessidade urgente de m��todos eficazes para a detec����o precoce de doen��as cardiovasculares, devido �� falta de factores de risco convencionais. Os n��veis elevados de homociste��na (Hcy) no sangue, homocisteinemia, s��o um factor de risco independente bem estabelecido para DCV. De acordo com alguns autores, a convers��o metab��lica de Hcy no metabolito t��xico Hcy-Tl e subsequente N-homocisteinila����o de prote��nas induz a agrega����o e a forma����o de amiloide, contribuindo assim para a altera����es pr��aterog��nicas no sistema cardiovascular. A enzima associada �� lipoprote��na de alta densidade (HDL), paraoxonase 1 (PON1), �� capaz de hidrolisar o metabolito t��xico Hcy-Tl de volta a Hcy no soro humano, como observado em estudos recentes que indicam o papel de patog��nese em DCV da hPON1. As paraoxonases de soro (PON1, PON2 e PON3) s��o hidrolases dependentes de c��lcio, que pertencem a uma fam��lia de enzimas que exibem propriedades antioxidantes e anti-inflamat��rias. Foram identificadas tr��s actividades catal��ticas principais para PON1: (i) actividade paraoxonase, que corresponde �� convers��o hidrol��tica de paraoxon em p-nitrofenol e a dietil fosfato, (ii) a actividade arilesterase que promove a hidr��lise de ��steres arom��ticos, e a (iii) actividade de lactonase, que catalisa a hidr��lise de Hcy a Hcy-Tl, sendo considerada a actividade principal da PON1. V��rios estudos t��m relacionado estas actividades enzim��ticas a diversas patologias, o que sugere a sua potencial utilidade no diagn��stico cl��nico. Neste trabalho pretende-se desenvolver um novo m��todo electroqu��mico para a detec����o f��cil do substrato e produto resultantes da hidr��lise enzim��tica de paraoxon pela hPON1. Utilizando uma célula electroqu��mica constitu��da por um el��ctrodo de refer��ncia Ag /AgCl., um contra-el��ctrodo de Pt e um electrodo de trabalho de carbono v��treo, o paraoxon e p-nitrofenol foram detectados simultaneamente por voltametria de onda quadrada, numa janela de potencial de [-0,3;-1,2] V. Os resultados dos ensaios com a enzima testada a pH 7,6 e 37��C, na presen��a de paraoxon e utilizando plasma humano como uma fonte de PON1 ser��o discutidos. Usando a mesma composi����o de célula electroqu��mica, Hcy e Hcy-Tl foram estudados utilizando diferentes interfaces e tipos de tratamento para testar a melhor maneira poss��vel de detec����o das duas esp��cies na mesma experi��ncia electroqu��mica.

An��lise e otimiza����o de materiais comp��sitos de microestrutura peri��dica

A presente disserta����o tem como principais objetivos a otimiza����o topol��gica de materiais comp��sitos de microestrutura peri��dica e a an��lise de efeitos de escala na caracteriza����o das propriedades el��sticas dos mesmos. No desenvolvimento deste trabalho, �� abordada a teoria da homogeneiza����o que �� usualmente utilizada para estimar as propriedades el��sticas de materiais comp��sitos peri��dicos de modo a tratar um meio heterog��neo como um meio homog��neo com propriedades mec��nicas equivalentes. �� realizada uma verifica����o e valida����o das hip��teses utilizadas por esta teoria, com o fim de determinar em que condi����es os resultados homogeneizados s��o cred��veis e qual a margem de erro associada a esses mesmos resultados. O modelo de material aqui utilizado �� obtido pela repeti����o de uma célula de base unit��ria (microestrutura representativa) em todas as dire����es espaciais. Trata-se de um modelo de material tridimensional de duas fases, s��lido e vazio (material poroso). S��o estudadas diferentes topologias de microestruturas, obtidas atrav��s de um algoritmo de otimiza����o topol��gica utilizando o m��todo da homogeneiza����o inversa. Para que fosse utilizada uma amostra suficientemente representativa de diferentes casos de anisotropia de material, foi utilizado um gerador de n��meros aleat��rios para reproduzir os estados de tens��o ou deforma����o a serem utilizados no processo de otimiza����o das microestruturas. Desta forma, �� realizado um estudo quanto �� anisotropia de material e a sua influ��ncia nas propriedades el��sticas do material. O estudo de efeitos de escala toma uma grande import��ncia neste trabalho, sendo estimados numericamente os tensores el��sticos que caracterizam o material e estudada a sua converg��ncia em rela����o aos tensores obtidos pelo m��todo da homogeneiza����o. Da mesma forma, �� realizado um estudo num��rico de converg��ncia da densidade de energia de deforma����o e de tens��o para diferentes condi����es de ensaios mec��nicos. Os resultados indicam que um baixo fator de escala �� suficiente para substituir um comp��sito heterog��neo por um material homog��neo com propriedades el��sticas calculadas pela teoria da homogeneiza����o.

Non-cell autonomous neuroprotective effect of carbon monoxide : microglia-to-neuron communication

RESUMO: A isqu��mia cerebral �� uma das doen��as mais predominantes a nivel mundial, sendo uma das principais causas de mortalidade e invalidez. Parte da propaga����o de dano no c��rebro �� causado por inflama����o descontrolada, causada principalmente por disfun����o da microglia. Desta forma, existe a necessidade de tentar desenvolver estrat��gias para melhor compreender e modular as ac����es destas células. O mon��xido de carbono (CO), �� uma mol��cula end��gena com provas dadas como anti-neuroinflamat��rio em v��rios modelos. Assim, o principal objectivo do trabalho foi o estudo do CO como um modulador da ac����o da microglia, com principal foco dado �� comunica����o entre estas células e neur��nios, tentando entender se existe um efeito neuroprotector por inibi����o da inflama����o. Um protocolo de meio condicionado foi estabelecido usando as linhas celulares BV2 e SH-SY5Y, de microglia e neur��nio. A mol��cula CORM-A1, que liberta expontaniamente CO, foi usada como m��todo de entrega da mol��cula ��s celulas. Demonstr��mos que o pre-tratamento de células BV2 com CORM-A1 gera neuroprotec����o j�� que reduz a morte celular de neur��nios SH-SY5Y quando s��o incubados com meio condicionado de microglia activada em conjunto com o pr��-oxidante t-BHP (tert-butil hidroper��xido). Assim, consider��mos que o CO promove neuroprotec����o ao inibir as ac����es inflamat��rias da microglia. O papel anti-inflamat��rio da mol��cula CORM-A1 foi confirmado quando se verificou que pr��-tratamento desta mol��cula em microglia BV2 limita a secre����o de TNF-�� mas estimula a secre����o de IL-10. Por ��ltimo, a CORM-A1 induziu a express��o do receptor da microglia CD200R1, mol��cula que participa na comunica����o neur��nio-microglia e fundamental para a modula����o das ac����es inflamat��rias destas ��ltimas. Em suma, o nosso trabalho refor��ou as propriedades anti-neuroinflamat��rias do CO e uma capacidade de modular viabilidade neuronal atrav��s do seu efeito a n��vel de comunica����o célula-célula. ---------------------------- ABSTRACT: Brain ischemia is a widespread disease worldwide, being one of the main causes of mortality and permanent disability. A portion of the damage that ensues following the ischemic event is caused by unrestrained inflammation, which is mainly orchestrated by exacerbated microglial activity. Hence, developing strategies for modulating microglial inflammation is a major concern nowadays. The endogenous molecule carbon monoxide (CO) has been shown to possess anti-neuroinflammatory properties using in vitro and in vivo approaches. Thus, our objective was to study CO as modulator of microglial activity, in particular in what concerns their communication with neurons, by promoting neuronal viability and limiting inflammatory output of activated microglia. A conditioned media strategy was established with BV2 microglia and SH-SY5Y neurons as cell models. CO-releasing molecule A1 (CORM-A1), a compound that releases CO spontaneously, was used as method of CO delivery to cells. We found that CORM-A1 pre-treatment in BV2 cells yields neuroprotective results, as it limits cell death when SH-SY5Y neurons are challenged with conditioned media from LPS-activated microglia and the pro-oxidant t-BHP (tert-butyl-hydroperoxide). Thus, we assumed carbon monoxide promotes neuroprotection via inhibition of microglial inflammation, displaying a non-cell autonomous role. CORM-A1 pre-treatment limited inflammation by inhibiting BV2 secretion of TNF-�� and stimulating IL-10 production. These results reinforce that CO���s anti-inflammatory role confers neuroprotection, as the alterations in these cytokines occur concurrently with the increase in SH-SY5Y viability. Finally, we showed for the first time that carbon monoxide promotes the expression of CD200R1, a microglial receptor involved in neuron-glia communication and modulation of microglia inflammation. Further studies are necessary to clarify this role. Altogether, other than just highlighting CO as an anti-inflammatory and neuroprotective molecule, this work set the foundation for disclosing its involvement in cell-to-cell communication.

Primary cilia and the regulation of hedgehog signaling: link to cardiac development

RESUMO: As células eucari��ticas evolu��ram um sistema de sinaliza����o complexo que lhes permite responder aos sinais extracelulares e intracelulares. Desta forma, as vias de sinaliza����o s��o essenciais para a sobreviv��ncia da célula e do organismo, uma vez que regulam processos fundamentais, tais como o desenvolvimento, o crescimento, a imunidade, e a homeostase dos tecidos. A via de transdu����o de sinal Hedgehog (Hh) envolve o receptor Patched1 (Ptch1), que tem um efeito inibidor sobre a prote��na Smoothened (Smo) na aus��ncia dos seus ligandos, as prote��nas Sonic hedgehog (Shh). Estas prote��nas s��o reguladores fundamentais do desenvolvimento embrion��rio, como ilustrado pelas malforma����es dr��sticas observadas em embri��es humanos e de murganho com perturba����es da transdu����o de sinal da via Hh e que incluem polidactilia, defeitos craniofaciais e malforma����es ��sseas. Igualmente importantes s��o as consequ��ncias da ativa����o inapropriada da via de sinaliza����o Hh na forma����o de tumores. Curiosamente, os componentes desta via localizam-se nos c��lios prim��rios. Al��m disso, demonstrou-se que esta localiza����o �� crucial para a sinaliza����o atrav��s da via Hh. Na presen��a dos ligandos, Ptch1 �� internalizado e destinado a degrada����o ou sequestrado num compartimento da célula de onde n��o pode desempenhar o seu papel inibit��rio. A prote��na Arl13b �� uma pequena GTPase pertencente �� fam��lia Arf/Arl da superfam��lia Ras de pequenas GTPases e foi implicada no s��ndrome de Joubert, uma ciliopatia caracterizada por ataxia cong��nita cerebelar, hipotonia, atrso mental e cardiopatia cong��nita. Murganhos deficientes para Arl13b, chamado hennin (hnn) morrem morrem prematuramente ao dia 13,5 de gesta����o (E13,5) e exibem anomalias morfol��gicas nos c��lios que levam �� interrup����o da sinaliza����o Hh. Al��m disso, a Arl13b est�� diretamente envolvida na regula����o da via Hh, controlando a localiza����o de v��rios componentes desta via nos c��lios prim��rios. Neste trabalho, mostramos que a Arl13b se localiza em circular dorsal ruffles (CDRs), que s��o estruturas de actina envolvidas em macropinocitose e internaliza����o de recetores, e que regula a sua forma����o. Al��m disso, aprofund��mos o conhecimento do processo de ativa����o da via de sinaliza����o Hh, mostrando que as CDRs sequestram seletivamente e internalizam o recetor Ptch1. As CDRs formam-se minutos ap��s ativa����o da via por ligandos Shh ou pelo agonista de Smo SAG e continuam a ser formadas a partir da��, sugerindo uma indu����o cont��nua da reorganiza����o do citoesqueleto de actina quando a via est�� ativada. Observ��mos ainda que a inibi����o da forma����o de CDRs atrav��s do silenciamento de WAVE1, uma prote��na necess��ria para a forma����o destas estruturas, resulta na diminui����o da ativa����o da via de sinaliza����o Hh. Al��m disso, o bloqueio da macropinocitose, que se segue ao fecho das CDRs, atrav��s do silenciamento de uma prote��na necess��ria para a cis��o de macropinossomas, nomeadamente a prote��na BARS, tem um efeito semelhante. Estes resultados sugerem que as CDRs e a macropinocitose s��o necess��rias para a ativa����o da via de sinaliza����o Hh e indicam que esta via de internaliza����o controla os n��veis de sinal Hh. Durante o desenvolvimento, as células proliferativas dependem do c��lio prim��rio para a transdu����o de v��rias vias de sinaliza����o. A via Hh induz a diferencia����o do m��sculo card��aco. Por conseguinte, os murganhos deficientes na via de sinaliza����o Hh exibem uma variedade de defeitos de lateralidade, incluindo altera����o do looping do cora����o, como pode ser visto em murganhos deficientes para Arl13b. Por conseguinte, investig��mos o papel da Arl13b no desenvolvimento do cora����o. Mostramos que a Arl13b �� altamente expressa no cora����o de embri��es de murganho e de murganhos adultos ao n��vel do mRNA e da prote��na. Al��m disso, o perfil de distribui����o da Arl13b no cora����o segue o dos c��lios prim��rios, que s��o essenciais para o desenvolvimento card��aco. Cora����es de murganhos hnn no estadio E12,5 mostram um canal ��trio-ventricular aberto, espessamento da camada compacta ventricular e aumento do ��ndice mit��tico no ventr��culo esquerdo. Al��m disso, um atraso de 1 a 2 dias no desenvolvimento �� observado em cora����es de murganhos hnn, quando comparados com controlos selvagens no estadio E13,5. Assim, estes resultados sugerem que a Arl13b �� necess��ria para o desenvolvimento embrion��rio do cora����o e que defeitos card��acos podem contribuir para a letalidade embrion��ria de murganhos hnn. Em suma, foi estabelecido um novo mecanismo para a regula����o dos n��veis de superf��cie do recetor Ptch1, que envolve a remodela����o do citoesqueleto de actina e a forma����o de CDRs ap��s a ativa����o da via de sinaliza����o Hh. Este mecanismo permite um feedback negativo que evita a repress��o excessiva da via atrav��s da remo����o de Ptch1 da superf��cie da célula. Al��m disso, determinou-se que uma muta����o de perda de fun����o na Arl13b causa defeitos card��acos durante o desenvolvimento, possivelmente relacionados com a associa����o dos defeitos em c��lios prim��rios e na sinaliza����o Hh, existentes em murganhos deficientes para Arl13b. A via de sinaliza����o Hh tem tido um papel central entre as vias de sinaliza����o, uma vez que a sua regula����o �� crucial para o funcionamento apropriada da célula. Assim, a descoberta de um novo mecanismo de tr��fego atrav��s de macropinocitose e CDRs que controla a ativa����o e repress��o da via de sinaliza����o Hh traz novas perspetivas de como esta via pode ser regulada e pode ainda conduzir �� identifica����o de novos alvos e estrat��gias terap��uticas. --------------------ABSTRACT: Eukaryotic cells have evolved a complex signaling system that allows them to respond to extracellular and intracellular cues. Signaling pathways are essential for cell and organism survival, since they regulate fundamental processes such as development, growth, immunity, and tissue homeostasis. The Hedgehog (Hh) pathway of signal transduction involves the receptor Patched1 (Ptch1), which has an inhibitory effect on Smoothened (Smo) in the absence of its ligands, the Sonic hedgehog (Shh) proteins. These proteins are fundamental regulators of embryonic development, as illustrated by the dramatic malformations seen in human and mouse embryos with perturbed Hh signal transduction that include polydactyly, craniofacial defects and skeletal malformations. Equally important are the consequences of inappropriate activation of the Hh signaling response in tumor formation. Interestingly, the components of this pathway localize to primary cilia. Moreover, it has been shown that this localization is crucial for Hh signaling. However, in the presence of the ligands, Ptch1 is internalized and destined for degradation or sequestered in a cell compartment where it no longer can play its inhibitory role. ADP-ribosylation factor-like (Arl) 13b, a small GTPase belonging to Arf/Arl family of the Ras superfamily of small GTPases has been implicated in Joubert syndrome, a ciliopathy characterized by congenital cerebellar ataxia, hypotonia, intellectual disability and congenital heart disease. Arl13b-deficient mice, called hennin (hnn) die at embryonic day 13.5 (E13.5) and display morphological abnormalities in primary cilia that lead to the disruption of Hh signaling. Furthermore, Arl13b is directly involved in the regulation of Hh signaling by controlling the localization of several components of this pathway to primary cilia. Here, we show that Arl13b localizes to and regulates the formation of circular dorsal rufles (CDRs), which are actin-basedstructures known to be involved in macropinocytosis and receptor internalization. Additionally, we extended the knowledge of the Hh signaling activation process by showing that CDRs selectively sequester and internalize Ptch1 receptors. CDRs are formed minutes after Hh activation by Shh ligands or the Smo agonist SAG and keep being formed thereafter, suggesting a continuous induction of actin reorganization when the pathway is switched on. Importantly, we observed that disruption of CDRs by silencing WAVE1, a protein required for CDR formation, results in down-regulation of Hh signaling activation. Moreover, the blockade of macropinocytosis, which follows CDR closure, through silencing of a protein necessary for the fission of macropinosomes, namely BARS has a similar effect. These results suggest that CDRs and macropinocytosis are necessary for activation of Hh signaling and indicate that this pathway of internalization controls Hh signal levels. During development, proliferating cells rely on the primary cilium for the transduction of several signaling pathways. Hh induces the differentiation of cardiac muscle. Accordingly, Hh-deficient mice display a variety of laterality defects, including alteration of heart looping, as seen in Arl13b-deficient mice. Therefore, we investigated the role of Arl13b in heart development. We show that Arl13b is highly expressed in the heart of both embryonic and adult mice at mRNA and protein levels. Also, Arl13b localization profile mimics that of primary cilia, which have been shown to be essential to early heart development. E12.5 hnn hearts show an open atrioventricular channel, increased thickening of the ventricular compact layer and increased mitotic index in the left ventricle. Moreover, a delay of 1 to 2 days in development is observed in hnn hearts, when compared to wild-type controls at E13.5. Hence, these results suggest that Arl13b is necessary for embryonic heart development and that cardiac defects might contribute to the embryonic lethality of hnn mice. Altogether, we established a novel mechanism for the regulation of Ptch1 surface levels, involving cytoskeleton remodeling and CDR formation upon Hh signaling activation. This mechanism allows a negative feedback loop that prevents excessive repression of the pathway by removing Ptch1 from the cell surface. Additionally, we determined that the Arl13b loss-offunction mutation causes cardiac defects during development, possibly related to the associated ciliary and Hh signaling defects found in Arl13b-deficient mice. Hh signaling has taken a center stage among the signaling pathways since its regulation is crucial for the appropriate output and function of the cell. Hence, the finding of a novel trafficking mechanism through CDRs and macropinocytosis that controls Hh signaling activation and repression brings new insights to how this pathway can be regulated and can lead to the discovery of novel therapeutic targets and strategies.

Elucidating the role of glycans in leucocyte function

RESUMO: O processo de glicosila����o �� a modifica����o p��s-traducional de prote��nas mais comum e est�� envolvido em v��rios processos fisiol��gicos e patol��gicos. Especificamente, certos perfis glicos��deos est��o correlacionados a estados espec��ficos de diferencia����o celular, e podem modular v��rios eventos celulares, como sinaliza����o celular, migra����o celular e intera����es hospedeiro-patog��nio. Assim sendo, a glicosila����o desempenha um papel crucial na modula����o de v��rios processos imunol��gicos. No entanto, permanece por esclarecer como as estruturas glicos��dicas influenciam a imunidade. Especificamente, algumas estruturas glicos��dicas terminais que est��o modificadas pela liga����o de ��cido si��lico desempenham um papel importante em v��rias fun����es do sistema imune, nomeadamente migra����o leucocit��ria em contexto de inflama����o e ativa����o de células imunes. Como tal, este trabalho teve como objectivo investigar como a express��o de certos glicanos influencia componentes importantes da resposta imune inata e adaptativa. Este trabalho est�� dividido em tr��s componentes principais: 1) A imunidade est�� amplamente dependente da habilidade das células circulantes migrarem para os tecidos inflamados, sendo que a liga����o de leuc��citos �� Eselectina endotelial �� o primeiro passo. Assim, n��s analis��mos a estrutura e fun����o dos ligandos de E-selectina que s��o expressos pelas células humanas mononucleares de sangue perif��rico (PBMCs), fornecendo novos conhecimentos para a compreens��o dos intervenientes moleculares que mediam a liga����o dos mon��citos, células CD4+ e CD8+T e células B ao endot��lio vascular. Surpreendentemente, os mon��citos apresentaram maior capacidade de liga����o �� E-selectina comparativamente aos linf��citos. Esta observa����o pode ser explicada pelo facto de os mon��citos humanos expressarem, uniformemente, um vasto report��rio de glicoprote��nas que exibem afinidade de liga����o �� E-selectina, nomeadamente: as glicoformas do CD43 (CD43E) e do CD44 (HCELL), em adi����o �� j�� previamente reportada glicoforma da PSGL-1 (CLA). Consistentemente, a diferente capacidade que as diversas popula����es linfocit��rias apresentam de se ligar �� E-selectina, est�� integralmente relacionada com a sua express��o de glicoprote��nas com afinidade de liga����o �� E-selectina. Enquanto que as células CD4+T apresentam uma elevada reatividade �� E-selectina, as células CD8+T e B demonstram pouca ou nenhuma capacidade de liga����o �� E-selectina. Esta atividade de liga����o �� E-selectina das células CD4+T �� conferida pela express��o de HCELL, em adi����o ��s j�� previamente reportadas CLA e CD43E. As células CD8+ T n��o expressam HCELL e apenas expressam pequenas quantidades de CLA e CD43E, enquanto que as células B n��o expressam ligandos de Eselectina. Mais, a exofucosila����o da superf��cie destas células, levou ao dram��tico aumento da express��o dos ligandos de E-selectina em todos as popula����es leucocit��rias, verificando-se que a cria����o de certos ligandos de E-selectina est�� dependente do tipo de célula, ap��s fucosila����o. Colectivamente, estes resultados redefinem o nosso conhecimento acerca dos mecanismos moleculares que governam o tr��fico das células mononucleares de sangue perif��rico em contexto de inflama����o. 2) A habilidade das células dendr��ticas (DCs) para extravasarem em locais de inflama����o �� crucial para o sucesso da terapia com DCs. Assim, analis��mos a estrutura e fun����o das mol��culas de ades��o que mediam a migra����o transendotelial (TEM) das DCs. Para isso, foram usadas DCs geradas a partir da diferencia����o de mon��citos (mo-DCS), obtidos quer pelo m��todos de separa����o imuno-magn��tica de células CD14+ (CD14-S) ou por isolamento por ader��ncia ao pl��stico (PA-S). Os resultados obtidos indicam que as glicoformas de liga����o �� Eselectina de PSGL-1, CD43 e CD44 s��o expressas pelas CD14-S mo-DCs, enquanto que as PA-S mo-DCs expressam apenas CLA. �� importante notar que a liga����o do CD44 nas mo-DCs, mas n��o nas PA-S mo-DCs, desencadeia a ativa����o e consequente ades��o da VLA-4 ao endot��lio na aus��ncia de um gradiente de quimiocinas. Procedeu-se tamb��m �� an��lise dos ligandos E-selectina expressos em mo-DCs geradas a partir de mon��citos do sangue do cord��o umbilical (UCB) e, inesperadamente, as UCB mo-DCs n��o expressam qualquer glicoprote��na com reatividade �� E-selectina. Al��m disso, a exofucosila����o das mo- DCs humanas utilizando uma ��(1,3)-fucosiltransferase aumenta significativamente a express��o de HCELL e, portanto, estas células apresentam uma capacidade aumentada para se ligarem �� E-selectina em condi����es de fluxo hemodin��mico. Estes resultados destacam o papel do HCELL no desencadeamento do TEM das CD14-S mo-DCs e sugerem que estrat��gias para potenciar a express��o de HCELL poder��o impulsionar o recrutamento de mo-DCs para locais de inflama����o. 3) Outro obst��culo para alcan��ar o sucesso promissor de vacinas baseadas em DCs �� o estabelecimento de abordagens eficientes que poder��o melhorar o estado de matura����o e apresenta����o antig��nica das DCs. Por conseguinte, foram investigadas abordagens alternativas que podem superar este obst��culo. Atrav��s da remo����o de ��cido si��lico de superf��cie celular das DCs, conseguiu-se induzir a matura����o de DC humanas e de ratinhos. Notavelmente, tanto as DCs humanas como as de ratinho, ao serem desialiladas mostraram uma capacidade aumentada para induzir a prolifera����o de células T, para secretar citocinas Th1 e para induzir a morte espec��fica de células tumorais. Em adi����o, as DCs desialiladas apresentam uma maior capacidade de apresenta����o cruzada de antig��nios tumorais ��s células T citot��xicas. Colectivamente, o presente estudo oferece uma vis��o chave para optimizar a capacidade das DCs em induzir respostas imunit��rias anti-tumorais, e indica que o tratamento com sialidase �� uma nova tecnologia para melhorar a efic��cia e aplicabilidade das vacinas baseadas em DCs. Coletivamente, os nossos resultados demostram como a glicosila����o e a sua manipula����o podem modular a imunidade. Concretamente, atrav��s de uma rea����o de exofucosila����o conseguimos aumentar fortemente a capacidade de os leuc��citos extravasarem para os tecidos afectados, enquanto que a remo����o dos n��veis de ��cido si��lico da superf��cie celular das DCs, induz potentes respostas anti-tumorais mediadas por células T citot��xicas. ------------------------------------ ABSTRACT: Glycosylation is the most widely form of protein post-translational modification and is involved in many physiological and pathological processes. Specifically, certain patterns of glycosylation are associated with determined stages of cell differentiation and can modulate processes like cell-signaling and migration and host-pathogen interactions. As such, glycosylation plays a crucial role in the modulation of several immune events. However, how glycans execute this immune-modulation and, therefore, influence immunity is still poorly unknown. Specifically, some terminal sialic acid-modified determinants are known to be involved in several physiological immune processes, including leukocyte trafficking into sites of inflammation and cell immune activation. Therefore, in this work, we sought to investigate more deeply how the expression of these glycosidic structures affects events form both innate and adaptive immune responses. To this end, we divided our work into three main parts: 1) Immunity critically depends on the ability of sentinel circulating cells to infiltrate injured sites, of which leukocyte binding to endothelial E-selectin is the critical first step. Thus, we first analyzed the structure and function of the E-selectin ligands expressed on native human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), providing novel insights into the molecular effectors governing adhesion of circulating monocytes, and of circulating CD4+T, CD8+T and B cells, to vascular endothelium under hemodynamic shear conditions. Strikingly, monocytes show a higher ability to tether and roll on endothelial cells than lymphocyte subsets. This is due to the fact that human circulating monocytes uniformly display a wide repertoire of E-selectin binding glycoproteins, namely the E-selectin-binding glycoforms of CD43 (CD43E) and CD44 (HCELL), in addition to the previously described E-selectin-binding glycoform of PSGL-1 (CLA). In addition, we also observed a differential ability of the different lymphocyte subsets to bind to Eselectin under hemodynamic shear stress conditions, and these differences were highly correlated with their individual expression of E-selectin binding glycoproteins. While CD4+T cells show a robust E-selectin binding ability, CD8+T and B cells show little to no E-selectin reactivity. CD4+T cell potent Eselectin rolling activity is conferred by HCELL expression, in addition to the previously reported E-selectin-binding glycoproteins CD43E and CLA. CD8+T cells display no HCELL and low amounts of CLA and CD43E, whereas B cells lack E-selectin ligand expression. Moreover, enforced exofucosylation of cell surface of these cells noticeably increases expression of functional E-selectin ligands among all leukocytes subsets, with cell type-dependent specificity in the protein scaffolds that are modified. Taken together, these findings redefine our understanding of the molecular mechanisms governing the trafficking patterns of PBMCs that are relevant in the context of acute or chronic inflammatory conditions. 2) The ability of circulating dendritic cells (DCs) to extravasate at inflammatory sites is critical to the success of DC-based therapies. Therefore, we assessed the structure and function of adhesion molecules mediating the transendothelial migration (TEM) of human monocyte derived-DCs (mo-DCs), obtained either by CD14 positive immune-magnetic selection (CD14-S) or by plastic adherence of blood monocytes (PA-S). We report for the first time that the E-selectin binding glycoforms of PSGL-1, CD43 and CD44 are all expressed on CD14-S mo-DCs, in contrast to PA-S mo-DCs that express only CLA. Importantly, CD44 engagement on CD14-S mo-DCs, but not on PA-S mo-DCs, triggers VLA-4-dependent adhesiveness and programs TEM in absence of chemokine gradient. We also analyzed the E-selectin ligands expressed on mo-DCs generated from umbilical cord blood (UCB) monocytes, and unexpectedly, UCB mo-DCs do not express any glycoprotein with E-selectin reactivity. Furthermore, exoglycosylation of human mo-DCs using an ��(1,3)-fucosyltransferase significantly increases expression of HCELL, and therefore exofucosylated mo-DCs exhibit an augmented ability to bind to E-selectin under hemodynamic shear stress conditions. These findings highlight a role for HCELL engagement in priming TEM of CD14-S mo-DCs, and suggest that strategies to enforce HCELL expression could boost mo-DC recruitment to inflammatory sites. 3) Another obstacle to achieve the promising success of DC-based vaccines is the establishment of efficient approaches that could successfully enhance maturation and cross-presentation ability of DCs. Therefore, we investigated an alternative approach that can overcome this problem. Through removal of sialic acid content from DC cell surface we are able to elicit maturation of both human and mouse DCs. Notably, desialylated human and murine DCs showed enhanced ability to induce autologous T cell to proliferate, to secrete Th1 cytokines and to kill tumor cells. Moreover, desialylated DCs display enhanced cross-presentation of tumor antigens to cytotoxic CD8+ T cells. Collectively, this study offers key insight to optimize the ability of DCs to boost anti-tumor immune responses, and indicates that the treatment with an exogenous sialidase is a powerful new technology to improve the efficacy and applicability of DC-based vaccines. Overall, our findings show how glycosylation and its manipulation can modulate immunity. Concretely, through an exofucosylation reaction we are able to greatly augment the ability of leukocytes to extravasate into injured tissues, while removal of sialic acid moieties from cell surface of DCs, significantly potentiate their ability to induce anti-tumor cytotoxic T cell-mediate responses.

Elucidating the role of glycans in leucocyte function

RESUMO:O processo de glicosila����o �� a modifica����o p��s-traducional de prote��nas mais comum e est�� envolvido em v��rios processos fisiol��gicos e patol��gicos. Especificamente, certos perfis glicos��deos est��o correlacionados a estados espec��ficos de diferencia����o celular, e podem modular v��rios eventos celulares, como sinaliza����o celular, migra����o celular e intera����es hospedeiro-patog��nio. Assim sendo, a glicosila����o desempenha um papel crucial na modula����o de v��rios processos imunol��gicos. No entanto, permanece por esclarecer como as estruturas glicos��dicas influenciam a imunidade. Especificamente, algumas estruturas glicos��dicas terminais que est��o modificadas pela liga����o de ��cido si��lico desempenham um papel importante em v��rias fun����es do sistema imune, nomeadamente migra����o leucocit��ria em contexto de inflama����o e ativa����o de células imunes. Como tal, este trabalho teve como objectivo investigar como a express��o de certos glicanos influencia componentes importantes da resposta imune inata e adaptativa. Este trabalho est�� dividido em tr��s componentes principais: 1) A imunidade est�� amplamente dependente da habilidade das células circulantes migrarem para os tecidos inflamados, sendo que a liga����o de leuc��citos �� Eselectina endotelial �� o primeiro passo. Assim, n��s analis��mos a estrutura e fun����o dos ligandos de E-selectina que s��o expressos pelas células humanas mononucleares de sangue perif��rico (PBMCs), fornecendo novos conhecimentos para a compreens��o dos intervenientes moleculares que mediam a liga����o dos mon��citos, células CD4+ e CD8+T e células B ao endot��lio vascular. Surpreendentemente, os mon��citos apresentaram maior capacidade de liga����o �� E-selectina comparativamente aos linf��citos. Esta observa����o pode ser explicada pelo facto de os mon��citos humanos expressarem, uniformemente, um vasto report��rio de glicoprote��nas que exibem afinidade de liga����o �� E-selectina, nomeadamente: as glicoformas do CD43 (CD43E) e do CD44 (HCELL), em adi����o �� j�� previamente reportada glicoforma da PSGL-1 (CLA). Consistentemente, a diferente capacidade que as diversas popula����es linfocit��rias apresentam de se ligar �� E-selectina, est�� integralmente relacionada com a sua express��o de glicoprote��nas com afinidade de liga����o �� E-selectina. Enquanto que as células CD4+T apresentam uma elevada reatividade �� E-selectina, as células CD8+T e B demonstram pouca ou nenhuma capacidade de liga����o �� E-selectina. Esta atividade de liga����o �� E-selectina das células CD4+T �� conferida pela express��o de HCELL, em adi����o ��s j�� previamente reportadas CLA e CD43E. As células CD8+ T n��o expressam HCELL e apenas expressam pequenas quantidades de CLA e CD43E, enquanto que as células B n��o expressam ligandos de Eselectina. Mais, a exofucosila����o da superf��cie destas células, levou ao dram��tico aumento da express��o dos ligandos de E-selectina em todos as popula����es leucocit��rias, verificando-se que a cria����o de certos ligandos de E-selectina est�� dependente do tipo de célula, ap��s fucosila����o. Colectivamente, estes resultados redefinem o nosso conhecimento acerca dos mecanismos moleculares que governam o tr��fico das células mononucleares de sangue perif��rico em contexto de inflama����o. 2) A habilidade das células dendr��ticas (DCs) para extravasarem em locais de inflama����o �� crucial para o sucesso da terapia com DCs. Assim, analis��mos a estrutura e fun����o das mol��culas de ades��o que mediam a migra����o transendotelial (TEM) das DCs. Para isso, foram usadas DCs geradas a partir da diferencia����o de mon��citos (mo-DCS), obtidos quer pelo m��todos de separa����o imuno-magn��tica de células CD14+ (CD14-S) ou por isolamento por ader��ncia ao pl��stico (PA-S). Os resultados obtidos indicam que as glicoformas de liga����o �� Eselectina de PSGL-1, CD43 e CD44 s��o expressas pelas CD14-S mo-DCs, enquanto que as PA-S mo-DCs expressam apenas CLA. �� importante notar que a liga����o do CD44 nas mo-DCs, mas n��o nas PA-S mo-DCs, desencadeia a ativa����o e consequente ades��o da VLA-4 ao endot��lio na aus��ncia de um gradiente de quimiocinas. Procedeu-se tamb��m �� an��lise dos ligandos E-selectina expressos em mo-DCs geradas a partir de mon��citos do sangue do cord��o umbilical (UCB) e, inesperadamente, as UCB mo-DCs n��o expressam qualquer glicoprote��na com reatividade �� E-selectina. Al��m disso, a exofucosila����o das mo- DCs humanas utilizando uma ��(1,3)-fucosiltransferase aumenta significativamente a express��o de HCELL e, portanto, estas células apresentam uma capacidade aumentada para se ligarem �� E-selectina em condi����es de fluxo hemodin��mico. Estes resultados destacam o papel do HCELL no desencadeamento do TEM das CD14-S mo-DCs e sugerem que estrat��gias para potenciar a express��o de HCELL poder��o impulsionar o recrutamento de mo-DCs para locais de inflama����o. 3) Outro obst��culo para alcan��ar o sucesso promissor de vacinas baseadas em DCs �� o estabelecimento de abordagens eficientes que poder��o melhorar o estado de matura����o e apresenta����o antig��nica das DCs. Por conseguinte, foram investigadas abordagens alternativas que podem superar este obst��culo. Atrav��s da remo����o de ��cido si��lico de superf��cie celular das DCs, conseguiu-se induzir a matura����o de DC humanas e de ratinhos. Notavelmente, tanto as DCs humanas como as de ratinho, ao serem desialiladas mostraram uma capacidade aumentada para induzir a prolifera����o de células T, para secretar citocinas Th1 e para induzir a morte espec��fica de células tumorais. Em adi����o, as DCs desialiladas apresentam uma maior capacidade de apresenta����o cruzada de antig��nios tumorais ��s células T citot��xicas. Colectivamente, o presente estudo oferece uma vis��o chave para optimizar a capacidade das DCs em induzir respostas imunit��rias anti-tumorais, e indica que o tratamento com sialidase �� uma nova tecnologia para melhorar a efic��cia e aplicabilidade das vacinas baseadas em DCs. Coletivamente, os nossos resultados demostram como a glicosila����o e a sua manipula����o podem modular a imunidade. Concretamente, atrav��s de uma rea����o de exofucosila����o conseguimos aumentar fortemente a capacidade de os leuc��citos extravasarem para os tecidos afectados, enquanto que a remo����o dos n��veis de ��cido si��lico da superf��cie celular das DCs, induz potentes respostas anti-tumorais mediadas por células T citot��xicas. ---------------------------- ABSTRACT: Glycosylation is the most widely form of protein post-translational modification and is involved in many physiological and pathological processes. Specifically, certain patterns of glycosylation are associated with determined stages of cell differentiation and can modulate processes like cell-signaling and migration and host-pathogen interactions. As such, glycosylation plays a crucial role in the modulation of several immune events. However, how glycans execute this immune-modulation and, therefore, influence immunity is still poorly unknown. Specifically, some terminal sialic acid-modified determinants are known to be involved in several physiological immune processes, including leukocyte trafficking into sites of inflammation and cell immune activation. Therefore, in this work, we sought to investigate more deeply how the expression of these glycosidic structures affects events form both innate and adaptive immune responses. To this end, we divided our work into three main parts: 1) Immunity critically depends on the ability of sentinel circulating cells to infiltrate injured sites, of which leukocyte binding to endothelial E-selectin is the critical first step. Thus, we first analyzed the structure and function of the E-selectin ligands expressed on native human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), providing novel insights into the molecular effectors governing adhesion of circulating monocytes, and of circulating CD4+T, CD8+T and B cells, to vascular endothelium under hemodynamic shear conditions. Strikingly, monocytes show a higher ability to tether and roll on endothelial cells than lymphocyte subsets. This is due to the fact that human circulating monocytes uniformly display a wide repertoire of E-selectin binding glycoproteins, namely the E-selectin-binding glycoforms of CD43 (CD43E) and CD44 (HCELL), in addition to the previously described E-selectin-binding glycoform of PSGL-1 (CLA). In addition, we also observed a differential ability of the different lymphocyte subsets to bind to Eselectin under hemodynamic shear stress conditions, and these differences were highly correlated with their individual expression of E-selectin binding glycoproteins. While CD4+T cells show a robust E-selectin binding ability, CD8+T and B cells show little to no E-selectin reactivity. CD4+T cell potent Eselectin rolling activity is conferred by HCELL expression, in addition to the previously reported E-selectin-binding glycoproteins CD43E and CLA. CD8+T cells display no HCELL and low amounts of CLA and CD43E, whereas B cells lack E-selectin ligand expression. Moreover, enforced exofucosylation of cell surface of these cells noticeably increases expression of functional E-selectin ligands among all leukocytes subsets, with cell type-dependent specificity in the protein scaffolds that are modified. Taken together, these findings redefine our understanding of the molecular mechanisms governing the trafficking patterns of PBMCs that are relevant in the context of acute or chronic inflammatory conditions. 2) The ability of circulating dendritic cells (DCs) to extravasate at inflammatory sites is critical to the success of DC-based therapies. Therefore, we assessed the structure and function of adhesion molecules mediating the transendothelial migration (TEM) of human monocyte derived-DCs (mo-DCs), obtained either by CD14 positive immune-magnetic selection (CD14-S) or by plastic adherence of blood monocytes (PA-S). We report for the first time that the E-selectin binding glycoforms of PSGL-1, CD43 and CD44 are all expressed on CD14-S mo-DCs, in contrast to PA-S mo-DCs that express only CLA. Importantly, CD44 engagement on CD14-S mo-DCs, but not on PA-S mo-DCs, triggers VLA-4-dependent adhesiveness and programs TEM in absence of chemokine gradient. We also analyzed the E-selectin ligands expressed on mo-DCs generated from umbilical cord blood (UCB) monocytes, and unexpectedly, UCB mo-DCs do not express any glycoprotein with E-selectin reactivity. Furthermore, exoglycosylation of human mo-DCs using an ��(1,3)-fucosyltransferase significantly increases expression of HCELL, and therefore exofucosylated mo-DCs exhibit an augmented ability to bind to E-selectin under hemodynamic shear stress conditions. These findings highlight a role for HCELL engagement in priming TEM of CD14-S mo-DCs, and suggest that strategies to enforce HCELL expression could boost mo-DC recruitment to inflammatory sites.3) Another obstacle to achieve the promising success of DC-based vaccines is the establishment of efficient approaches that could successfully enhance maturation and cross-presentation ability of DCs. Therefore, we investigated an alternative approach that can overcome this problem. Through removal of sialic acid content from DC cell surface we are able to elicit maturation of both human and mouse DCs. Notably, desialylated human and murine DCs showed enhanced ability to induce autologous T cell to proliferate, to secrete Th1 cytokines and to kill tumor cells. Moreover, desialylated DCs display enhanced cross-presentation of tumor antigens to cytotoxic CD8+ T cells. Collectively, this study offers key insight to optimize the ability of DCs to boost anti-tumor immune responses, and indicates that the treatment with an exogenous sialidase is a powerful new technology to improve the efficacy and applicability of DC-based vaccines. Overall, our findings show how glycosylation and its manipulation can modulate immunity. Concretely, through an exofucosylation reaction we are able to greatly augment the ability of leukocytes to extravasate into injured tissues, while removal of sialic acid moieties from cell surface of DCs, significantly potentiate their ability to induce anti-tumor cytotoxic T cell-mediate responses.

An��lise de ciclo de vida da tecnologia fotovoltaica em Portugal

�� impens��vel viver nos dias de hoje sem energia el��ctrica. Com o aumento das altera����es clim��ticas, �� fulcral substituir ou diminuir a depend��ncia dos combust��veis f��sseis, apostando em tecnologias de produ����o de energia mais limpas e amigas do ambiente. Neste seguimento, as energias renov��veis surgem como uma boa alternativa a este problema. A tecnologia fotovoltaica aproveita a energia solar para a produ����o de electricidade, apresentando a vantagem de n��o produzir emiss��es durante a sua opera����o e ter um tipo de instala����o distribu��da, mas p��e-se em causa o seu ciclo de vida. O principal objectivo desta disserta����o �� analisar o ciclo de vida da tecnologia fotovoltaica em Portugal, consistindo o objectivo secund��rio em comparar esta tecnologia com outras fontes de electroprodu����o, tamb��m em Portugal. Do ponto de vista ambiental, de maneira a ser poss��vel identificar as fases cr��ticas do ciclo de vida e comparar as tecnologias, foi utilizado o m��todo Ecoblok, que fornece indicadores de desempenho. Ap��s a an��lise, constatou-se que os principais impactes no ciclo de vida est��o ligados �� fase de produ����o da célula, montagem do painel e componentes do sistema (BOS). Os indicadores mais cr��ticos s��o a extrac����o de recursos, emiss��o de gases de efeito de estufa e a polui����o da ��gua e do solo. Em rela����o �� extrac����o de mat��rias-primas, o sil��cio �� abundante, mas requer elevadas quantidades de energia na sua transforma����o. Dentro dos tipos de tecnologia fotovoltaica, o sil��cio monocristalino gera mais impactes ambientais comparado com o sil��cio policristalino. Esta diferen��a est�� relacionada com o processo produtivo do sil��cio monocristalino, um processo mais lento e com maior consumo de energia. Na compara����o da tecnologia fotovoltaica com outras fontes de energia, verificou-se que a tecnologia de g��s natural apresenta mais impactes gerados nos indicadores extrac����o de ��gua, extrac����o de recursos e emiss��o de gases de efeito de estufa; j�� a tecnologia h��drica gera mais impactes no indicador uso do solo. Nos indicadores polui����o da ��gua e solo e polui����o do ar, a tecnologia fotovoltaica apresenta o valor mais elevado de todas as tecnologias. A fonte de energia fotovoltaica apresenta a vantagem de ter uma produ����o mais est��vel e previs��vel durante o ano e de o seu hor��rio de produ����o coincidir com as horas de maior consumo energ��tico.