Biological activity of well defined hydantoin derivatives on efflux pump systems of bacteria and cancer cells

A multi-resistência a antibióticos e medicamentos usados em quimioterapia é um dos grandes problemas com os quais as instituições de saúde se debatem hoje em dia. A acção provocada por bombas de efluxo é uma das suas causas. Estas bombas têm uma importância fundamental, uma vez que, ao expelirem todo o tipo de tóxicos para o exterior das células, também expelem medicamentos, fazendo com que estes não tenham o efeito desejado dentro delas. As bombas de efluxo são transportadores que se encontram nas membranas de todo o tipo de células. Existem dois grandes tipos de bombas de efluxo: as primárias e as secundárias. As primeiras conferem multi-resistência principalmente em células eucariotas, como as células do cancro em humanos, tendo como função a mediação da repulsa de substâncias tóxicas por intermédio da hidrólise de ATP. A primeira a ser descoberta e mais estudada destas bombas foi a ABCB1 que é o gene que codifica a glicoproteína-P (P de permeabilidade). Enquanto as secundárias, que são a maior fonte de multi-resistência em bactérias, promovem a extrusão de substâncias tóxicas através da força motriz de protões. Neste tipo de bombas são conhecidas quatro famílias principais, das quais uma das mais importantes é a superfamília RND, uma vez que inclui a bomba AcrAB-TolC, que é muito importante no metabolismo xenobiótico de bactérias Gramnegativas, nomeadamente a E.coli. Com o objectivo de reverter a multi-resistência, tanto em células eucariotas como procariotas, têm-se desenvolvido estratégias de combate que envolvem a descoberta de substâncias que inibam as bombas de efluxo. Assim sendo, ao longo dos tempos têm sido descobertas variadas substâncias que cumprem este objectivo. É o caso, por exemplo, dos derivados de fluoroquinolonas usados como inibidores de bombas de efluxo em bactérias ou do Tamoxifen, utilizado na terapia de pacientes com cancro da mama. Um dos grupos de substâncias estudados para o desenvolvimento de possíveis compostos que actuem como reversores de multi-resistência são os compostos derivados de hidantoínas. Estes, são conhecidos por possuírem uma grande variedade de propriedades bioquímicas e farmacológicas, sendo portanto usados para tratarem algumas doenças em humanos, como a epilepsia. Nestes, estão englobados compostos com actividade anti-convulsão que constitui a sua grande mais-valia e, dependente da substituição no anel que os constitui, uma grande variedade de outras propriedades farmacológicas como a anti-fungica, a anti-arritmica, a anti-viral, a anti-diabética ou por exemplo a antagonização de determinados receptores, como os da serotonina. Apesar de pouco usados em estudos experimentais para desenvolver substâncias anti-carcinogénicas, existem alguns estudos com este efeito. Objectivos: O presente projecto envolve o estudo de bombas de efluxo primárias e secundárias, em células eucariotas e procariotas, respectivamente. Em bactérias, foram usados quatro modelos experimentais: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterococcus faecalis ATCC 29212, E. coli AG 100 e Salmonella Enteritidis NCTC 13349. Em células de cancro foram usadas, células T de linfoma de rato parentais e células T de linfoma de rato transfectadas com o gene humano MDR-1. O principal objectivo deste estudo foi a pesquisa de novos moduladores de bombas de efluxo presentes em bactérias e células do cancro, tentando assim contribuir para o desenvolvimento de novos agentes farmacológicos que consigam reverter a multi-resistência a medicamentos. Assim sendo foram testados trinta compostos derivados de hidantoínas: SZ-2, SZ-7, LL-9, BS-1, JH-63, MN-3, TD-7k, GG-5k, P3, P7, P10, P11, RW-15b, AD-26, RW-13, AD-29, KF-2, PDPH-3, Mor-1, KK-XV, Thioam-1, JHF-1, JHC-2, JHP-1, Fur-2, GL-1, GL-7, GL-14, GL-16, GL-18. Como forma de atingir estes objectivos, a actividade biológica dos trinta compostos derivados de hidantoínas foi avaliada nas quatro estirpes de bactérias da seguinte forma: foram determinadas as concentrações mínimas inibitórias dos trinta compostos como forma de definir as concentrações em que os compostos seriam utilizados. Os compostos foram posteriormente testadas com um método fluorométrico de acumulação de brometo de etídeo, que é um substrato comum em bombas de efluxo bacterianas, desenvolvido por Viveiros et al. A actividade biológica dos compostos derivados de hidantoínas nas células de cancro foi demonstrada por diferentes métodos. O efeito anti-proliferativo e citotóxico dos trinta compostos foi avaliado nas células T de linfoma de rato transfectadas com o gene humano MDR-1 pelo método de thiazolyl de tetrazólio (MTT). Como o brometo de etídeo também é expelido pelos transportadores ABC, estes compostos foram posteriormente testados com um método fluorométrico de acumulação de brometo de etídeo desenvolvido por Spengler et al nos dois diferentes tipos de células eucariotas. Resultados: A maioria dos compostos derivados de hidantoínas foi eficaz na modulação de bombas de efluxo, nas duas estirpes de bactérias Gram-negativas e nos dois diferentes tipos de células T de linfoma. Em contraste com estes resultados, nas duas estirpes de células Gram-positivas, a maioria dos compostos tiveram pouco efeito na inibição de bombas de efluxo ou até nenhum, em muitos dos casos. De uma maneira geral os melhores compostos nas diferentes estirpes de bactérias foram: Thioam-1, SZ-2, P3, Rw-15b, AD-26, AD-29, GL-18, GL-7, KF-2, SZ-7, MN-3, GL-16 e GL- 14. Foram portanto estes os compostos que provocaram maior acumulação de brometo de etídeo, inibindo assim com maior eficácia as bombas de efluxo. No presente estudo, a maioria dos compostos conseguiu inibir a resistência provocada pela bomba de efluxo ABCB1, tanto nas células parentais bem como nas células que sobre-expressam esta bomba, causando a acumulação de brometo de etídeo dentro das células. As células que sobreexpressam a bomba ABCB1 foram posteriormente testadas com citometria de fluxo que é a técnica padrão para pesquisa de inibidores de bombas de efluxo. Os compostos que foram mais efectivos na inibição da bomba ABCB1, causando assim maior acumulação de brometo de etídeo nas células que sobre-expressam esta bomba foram: PDPH-3, GL-7, KK-XV, AD-29, Thioam-1, SZ-7, KF-2, MN-3, RW-13, LL-9, P3, AD-26, JH-63 e RW- 15b. Este facto não corroborou totalmente os resultados da citometria de fluxo uma vez que os moduladores que provocaram maior inibição da bomba ABCB1 foram o MN-3, JH-63 e o BS-1, sendo que o último não foi seleccionado como um bom composto usando o método fluorométrico de acumulação de brometo de etídeo. Conclusão: Os compostos derivados de hidantoínas testados tiveram maior efeito nas estirpes de bactérias Gram-negativas do que nas Gram-positivas. Relativamente às células eucariotas, as estruturas mais activas apresentam substituintes aromáticos bem como alguns fragmentos aminicos terciários.

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Entre os contributos etiológicos das principais LMEMSLT observam-se distintas perspectivas fisiopatológicas, diversos factores de risco – determinantes na óptica dos diversos investigadores – assim como díspares suportes conceptuais na elaboração dos métodos de identificação e avaliação do risco de LMEMSLT. A frequente insuficiência de informação e até, eventualmente, a presença de elementos cientificamente pouco robustos (ou mesmo hipotéticos) no procedimento de obtenção dos resultados finais (scores) com cada método de avaliação do risco, julga-se determinar a obtenção de distintos resultados no mesmo posto de trabalho e deu origem à principal questão de investigação: será possível identificar qual o(s) método(s) de avaliação do risco de LMEMSLT mais adequado (s) face à presença de factores de risco no local de trabalho? O presente estudo foi efectuado numa empresa da indústria automóvel e analisou a utilização de uma estratégia gradativa de selecção de instrumentos de identificação de factores de risco e de métodos de avaliação integrada do risco de LMEMSLT, no sentido de contribuir para a efectividade do processo de identificação e avaliação do risco destas lesões em meio industrial. No essencial, utilizou-se uma adaptação da estratégia de avaliação do risco de Malchaire (Malchaire, 1999), analisando os dois primeiros passos, os mais frequentes e que se consideram essenciais: a identificação de factores de risco e a avaliação do risco. Utilizaram-se como ponto de partida as classificações do risco em postos de trabalho onde a aplicação do método OCRA – base do projecto de norma Europeu prEN 1005-5 para a estimativa do risco de LMEMSLT – identificou níveis de risco moderados e/ou elevados (score OCRA ≥ 16,5). Assim analisaram-se postos de trabalho (n=71) classificados pelo método OCRA (Occhipinti, 1998) como de risco de LMEMSLT moderado (n=37) e elevado (n=34). Registou-se em vídeo a actividade de trabalho e analisaram-se os principais factores de risco (postura, força, repetitividade e exposição a vibrações). Aplicaram-se diversos instrumentos: (1) de identificação de factores de risco – filtros HSE (HSE, 2002) e OSHA (Silverstein, 1997) – e (2) de análise do risco – métodos RULA (McAtamney; Corlett, 1993), SI (Moore; Garg, 1995) e HAL (Lakto et al., 1997). Dos resultados globais da aplicação dos referidos filtros e métodos é possível destacar que os resultados dos filtros são no essencial semelhantes, enquanto os métodos apresentam discrepâncias mais evidentes: o método OCRA classificou os 71 postos de trabalho como de risco, o método SI classificou 41 postos com esse nível, o método HAL classificou 35 postos como de risco e o método RULA classificou apenas 26 postos de risco (OCRA-RULA rS=-0,126 n.s.). Apesar disso as relações existentes entre os seus resultados apresentam algumas semelhanças (p<0,001): OCRA-SI rSp=0,520 e OCRA-HAL rSp=0,422. Destaque, igualmente, para as divergências entre os postos classificados de risco elevado com os diversos métodos, isto é, por exemplo de entre os 41 postos com scores de risco da aplicação do método SI apenas se encontram12 postos classificados de risco pelo método RULA. Os resultados dos filtros permitiram no geral identificar a presença ou ausência dos principais factores de risco, apesar de se verificarem distintos resultados de validade preditiva particularmente a nível da postura (HSE=0,75; OSHA=0,57) e da aplicação de força (HSE=0,59; OSHA=0,80). Os resultados dos métodos permitem evidenciar ponderações diversas para os factores de risco analisados, apresentando semelhanças em situações de aplicação de força (OCRA=0,80; SI=0,80; HAL=0,78), de dissemelhanças na análise da presença de posturas extremas (OCRA=0,62; SI=0,68; RULA=0,48) e da repetitividade (OCRA=0,66; SI=0,35; RULA=0,43; HAL=0,39) ou, em oposição, não incluindo na sua avaliação do risco determinados factores de risco, como é o caso da exposição a vibrações (SI, RULA e HAL) ou da avaliação das posturas (HAL). Deste modo, conclui-se pela pertinência da utilização de um filtro que permita a identificação dos factores de risco presentes em cada posto de trabalho e por consequência oriente a selecção do método mais indicado ou ainda, em oposição, do método contra-indicado. Este trabalho, como um contributo para uma efectiva identificação e avaliação do risco de LMEMSLT, alerta para a necessidade de elaboração

Métodos não-paramétricos

Recorrer aos testes paramétricos usuais em muitas situações reais, em que dispomos de amostras de pequena dimensão, e a grande variabilidade da magnitude dos dados lança dúvidas sobre a eventual gaussianidade dos dados, parece metodologicamente errado. A abordagem não-paramétrica, em que a magnitude dos dados é moderada por pesos que levam a que apenas se considerem os respectivos sinais, ou os ranks das observações, ou apenas contagens em classes, leva frequentemente a resultados mais fiáveis, e em algumas circunstâncias mais eficientes.