Projeto dos controlos eletrónicos de um veículo unipessoal de mobilidade urbana

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Electrotécnica e de Computadores

Implementação e validação de um método de pesquisa e quantificação de Vitamina E por HPLC

As vitaminas são substâncias orgânicas presentes em muitos alimentos, em pequenas quantidades e indispensáveis ao funcionamento do organismo. A ausência sistemática destas resulta, quase sempre, em crescimento e desenvolvimento deficientes e em casos extremos pode conduzir a doenças graves, como por exemplo, a demência (vitaminas do complexo B), o raquitismo (vitamina D), o escorbuto (vitamina C). Em 1968 a American Food and Nutrition Board reconheceu oficialmente a vitamina E como um nutriente essencial para os seres humanos, pois possui uma importante função no organismo, como antioxidante, ao inibir a oxidação de lípidos insaturados e ao prevenir o dano oxidativo celular pela inativação de radicais livres e espécies reativas de oxigênio. O interesse nesta vitamina é cada vez maior, devido às funções que desempenha no organismo como agente antioxidante, envolvido no retardamento do envelhecimento e na proteção de doenças crônicas não transmissíveis, como Parkinson, Alzheimer, cancro e doenças cardiovasculares. O presente trabalho tem como objetivo a implementação e validação de um método de pesquisa e quantificação da vitamina E na manteiga por cromatografia líquida de alta eficiência, no laboratório de Química da empresa SGS, expandindo desta forma, as capacidades da empresa nesta área. Para tal foram avaliados parâmetros como linearidade, limites de deteção e quantificação, repetibilidade, precisão intermédia e exatidão. Os resultados mostram que o método é linear para uma gama de trabalho entre 5,00 e 50,00 mg/L com um limite de deteção e quantificação de 1,27 mg/L e 3,84 mg/L, respetivamente. O método apresentou repetibilidade e precisão intermédia aceitáveis, com coeficientes de variação inferiores a 5%, limite de repetibilidade de 1,37 mg/kg e variabilidade de resultados associados ao método de 0,19 mg/L. A exatidão do método foi aferida recorrendo a ensaios de recuperação, tendo-se obtido percentagens de recuperação médias superiores a 80%.

Estado de saúde oral das crianças entre os 3 e os 5 anos, a frequentar as escolas do Cacém, com pais portugueses e imigrantes

Contexto: A cárie dentária é um problema de saúde pública, com elevada prevalência em todo o mundo. Ao longo das últimas décadas, várias investigações revelam que a cárie dentária está relacionada com factores sociais e comportamentais. Condições sociais e económicas deficientes, diminuem o acesso à informação e conhecimento, bem como limitam o acesso a serviços especializados de saúde. Os migrantes são um grupo populacional em que estes factores têm especial relevo. Este trabalho tem como objectivo descrever o estado de saúde oral relativamente à cárie dentária, de crianças dos 3 aos 5 anos, filhas de pais imigrantes e portugueses, a frequentar jardim-de-infância, na zona do Cacém- Sintra. Métodos: A amostra deste estudo é composta por 183 crianças, dos 3 aos 5 anos, a frequentar os jardins-de-infância de 3 Instituições Particulares de Solidariedade Social, situadas no Cacém. Os dados foram recolhidos através de um questionário dirigido aos pais e de uma ficha individual de rastreio dentário realizado às crianças. Para aferir a associação entre as variáveis foram aplicados: o teste do Qui-Quadrado de Person, o teste t de Student e o modelo de regressão logística, com o cálculo dos respectivos odds-ratio. O nível de significância estatístico foi de 5%. Resultados: Nas famílias estudadas 36,1% dos pais e 38,3% das mães são imigrantes; 44% das crianças têm pelo menos um progenitor de origem estrangeira. A maioria das famílias tem 2 filhos (45%) e 54,6% das crianças do estudo são primeiros filhos; 48,6% das crianças já foram a uma consulta de saúde oral, e igual percentagem nunca foi a uma consulta desta especialidade; 89% das crianças da amostra escovam os dentes diariamente. A prevalência de cárie na dentição decídua encontrada nesta amostra foi de 25,1%, com um cpo’d grupo de 0,7. Estão livres de história de cárie 84,7% das raparigas e 66,3% dos rapazes (p= 0,004). Verifica-se que os rapazes têm um risco 2,3 vezes maior (OR=2,34) de não ter saúde oral do que as raparigas (p=0,02) e que as crianças que já foram à consulta de saúde oral têm um risco, cerca de 3 vezes maior (OR=3,21) de apresentar um cpo ≠0 do que as crianças que nunca foram à consulta. Conclusão: Nesta amostra não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas no cpo’d individual das crianças filhas de imigrantes e de portugueses. O cpo’d demonstrou estar associado à idade, sexo e ida à consulta de saúde oral. Existe uma necessidade emergente de um maior conhecimento do estado de saúde oral destas comunidades, avaliando até que ponto estão mais vulneráveis ao aparecimento de doenças orais.

Influência da humidade no comportamento mecânico de compósitos de madeira-plástico

As crescentes questões ambientais têm vindo a impor, entre outras, a necessidade da reciclagem dos desperdícios produzidos por diversos setores (agricultura, indústria e serviços). Nesta ótica têm vindo a surgir um conjunto alargado de produtos compósitos que incluem os compósitos de madeira-plástico (Wood Plastic Composites). Estes compósitos têm vindo a competir com os produtos de madeira em diversos nichos de mercado, sendo o maior deles os revestimentos de piso em ambiente exterior, vulgarmente designados de deckings. Estes compósitos são comercializados salientando as suas vantagens relativamente à madeira maciça, como seja maior durabilidade biológica e menor variabilidade de propriedades mecânicas e físicas. No final do ano 2013 e início de 2014, foram reportadas uma série de anomalias na aplicação de réguas de compósitos madeira-plástico, nomeadamente a diminuição do desempenho físico e mecânico destes materiais, quando sujeitos a períodos prolongados de humidificação. Embora, para a maioria dos casos reportados, estas anomalias se devam a condições deficientes de aplicação, a possibilidade de alteração de características à flexão, quando sujeitos a condições de uma aplicação exterior, ainda não se encontra bem estudada. Na presente dissertação são avaliados e apresentados os efeitos no comportamento à flexão de três tipos diferentes de réguas de compósito madeira-plástico, quando sujeitos a condições de humidade permanente ou cíclica. Para este efeito, foram conduzidos um conjunto de ensaios, nomeadamente, de flexão para determinação da pré-carga, de resistência à humidade e de variação dimensional e de módulo de elasticidade devido à imersão em água e a ambiente húmido. Posteriormente, os resultados obtidos foram sujeitos a uma verificação aos Estados Limite de Serviço. Os resultados revelaram reduzidas variações dimensionais (inchamento) e perdas significativas de módulo de elasticidade, apenas devido à exposição a elevados níveis de humidade, mostrando-se o caso de exposição prolongada a água líquida o mais gravoso. Relativamente aos Estados Limite de Serviço, sobretudo a longo prazo, os resultados mostraram-se bastante gravosos, nomeadamente para o material de menor qualidade.

Indicadores de prognóstico em utentes com disfunção do ombro submetidos a uma intervenção terapêutica direcionada para a estabilidade dinâmica da escápulo-torácica

RESUMO: Introdução/ Objetivo: Segundo a revisão sistemática de Chester e colaboradores (2013b)apenas dois fatores de prognóstico demonstraram uma associação consistente com o resultado que foram a duração dos sintomas e a funcionalidade na avaliação inicial. O objetivo do estudo é identificar indicadores de bom e mau prognóstico em utentes com disfunção do complexo articular do ombro (DCAO), tendo por base, aspetos da avaliação inicial do utente e critérios de alta de abolição da dor, aumento da funcionalidade e da estabilidade dinâmica considerando uma intervenção terapêutica direcionada para o aumento da estabilidade dinâmica da escápulo-torácica. Metodologia: Efetuou-se um estudo de coorte clínico retrospetivo. Para tal, aplicou-se um protocolo de intervenção terapêutica e analisou-se os resultados. A amostra foi constituída por 82 indivíduos com DCAO [53 com síndrome do conflito subacromial (SCSA) e 29 com instabilidade da glenoumeral (IGU)], residentes nos distritos de Lisboa, Setúbal e Santarém com o intuito de iniciar tratamento de fisioterapia. A análise dos dados foi efetuada tendo em consideração dois procedimentos: análise univariada (através do método de Kaplan-Meier para cada CVP) e análise multifatorial (pela análise de regressão de Cox e regressão logística nos grupos de utentes com SCSA, IGU e DCAO). Resultados: O tempo mediano de continuação no tratamento em fisioterapia foi de 7 semanas para os utentes com SCSA e 6 semanas para utentes com IGU. Segundo o teste de Logrank, na análise univariada, existem sete e oito covariáveis preditoras (CVP) com associação estatisticamente significativa (p<0,05) para o subgrupo SCSA e IGU, respectivamente. De acordo com estes resultados, a primeira parte da DASH e a SPADI são as únicas CVP com associação comuns às duas disfunções. Pela análise multifatorial e, em congruência com o teste de Wald, nenhuma das CVP contribui estatisticamente para o modelo preditivo de continuidade do tratamento de fisioterapia em qualquer um dos três modelos estudados: subgrupo SCSA, subgrupo IGU e utentes com DCAO. Conclusão: Por uma análise univariada verificou-se que existem CVP associadas à alta dos tratamentos em fisioterapia e estas não são as mesmas em ambas as DCAO. Contudo, a magnitude do efeito de cada CVP nos modelos multifatoriais definidos para os grupos de utentes com SCSA, IGU e DCAO não demonstraram valor estatisticamente significativo pelo que não foi possível determinar modelos de prognóstico em utentes com DCAO.-------------ABSTRACT: Background/ Purpose: According with the systematic review from Chester and collaborators (2013b) just two prognostic factors demonstrated a consistent association with the outcome: the duration of symptoms and functionality in the initial assessment. The purpose of the study is to identify indicators of good and poor prognosis in patients with shoulder’s dysfunctions, based on aspects of the initial assessment and discharge criteria of absence of pain, increased functionality and dynamic stability considering a therapeutic intervention used to increase the dynamic stability of scapulo-thoracic. Methodology: It was conducted a retrospective study of clinical cohort. For this purpose it was applied a protocol with therapeutic intervention and the results were analyzed. The sample consisted of 82 individuals with shoulder’s dysfunction (53 with subacromial impingement (SIMP) and 29 with shoulder instability (SINS) residing in the districts of Lisbon, Setúbal and Santarém in order to start physiotherapy. Data analysis was performed taking into account two procedures: univariate analysis [using the Kaplan-Meier method for each co-variant predictor variable (CVP)] and multifactorial analysis [analysis by Cox regression and logistic regression on groups of patients with SIMP, SINS and shoulder’s dysfunction (SD)]. Results: The median time of follow-up treatment at physical therapy was 7 weeks for patients with SIMP and 6 weeks for patients with SINS. According to the Logrank test in the univariate analysis, there are seven and eight CVP with a statistically significant association (p<0.05) for the patients with SIMP and SINS, respectively. According to these results, the first part of the DASH and SPADI are the only CVP common to both disorders association. By multifatorial analyses, and in agreement with the Wald test, none of the CVP contributes statistically to the predictive model of continuity of physiotherapy treatment in any of the three studied models: patients with SIMP, patients with SINS and patients with SD. Conclusion: In an univariate analysis, it was verified that there are CVP associated with discharge from treatments of physical therapy and these are not the same in both SD. However, the magnitude of effect of each CVP in multifactorial models for defined patients groups with SIMP, SINS and SD showed no statistically significant. Therefore, it was not possible to determine prognostic models for patients with SD.

Intervenção da fisiopetarpia em indivíduos com osteoartrose do joelho: características da prática clínica e resultados obtidos em contexto de prática convencionada

RESUMO: Introdução: A osteoartrose do joelho em particular constitui uma das maiores causas de incapacidades no dia-a-dia, morbilidade e aumento dos custos de saúde na população, na medida em que é uma condição que quando sintomática progride para um padrão que incluí dor articular, perda de força, incapacidade para a marcha e redução da aptidão física. A sua prevalência aumenta com a idade, 7% entre pessoas dos 65-70 anos, e 11,2% para aqueles com 80 anos ou mais, pouco variando entre os estudos existentes. Um recente estudo da Organização Mundial da Saúde (OMS) refere que a osteoartrose é a quarta causa mais importante de incapacidade entre as mulheres e a oitava entre os homens. Objetivo do estudo: Descrever a intervenção da fisioterapia em contexto de prática clínica convencionada e os resultados obtidos em indivíduos com OA, ao nível da intensidade da dor, capacidade funcional e perceção global de melhoria. Desenho Metodológico: Trata-se de um Estudo de coorte prospetivo onde foram incluídos indivíduos de ambos os géneros, entre os 60 e os 80 anos, com osteoartrose do joelho referenciada clinicamente. Após o consentimento informado, os pacientes foram, avaliados em quatro momentos: num primeiro momento (T0), antes de iniciarem o tratamento; (T1) após 4 semanas do início do tratamento; (T2) coincidente com o final do tratamento; e (T3) 3 meses após o início do tratamento. Foi utilizado um Questionário de Caracterização Sócio-Demográfica e Clínica, a Escala numérica da dor – END, o questionário KOOS (Knee Injury and Osteoarthritis Outcome Score) e a versão portuguesa da Patient Global Impression Change (PGIC-PT). A base de seleção dos indivíduos foi realizada numa clínica convencionada do Algarve. Resultados: Foi observado um aumento significativo em todos os outcomes avaliados pelo KOOS, END e PGIC num período até 3 meses após a intervenção. Na avaliação da END em T3 o valor da média foi de 1,63(±0,71). Para o KOOS nas subescalas Sintomas foi de 87,60(±5,86), Dor 85,71(±3,99), AVD 78,23(±3,48), ADL 67,71(±7,16), QV 80,71(±9,14), para a PGIC-AVD 5,29(±0,57), PGIC-DOR 5,97(±0,61). Os resultados obtidos pelo teste de Friedman, revelaram um valor de p<0,005. Assim, a melhoria da incapacidade funcional reportada pelos participantes neste grupo é estatisticamente diferente, e de forma significativa nos diferentes momentos de recolha de dados, durante e após o tratamento (X2 (3)=208,862, p<0,005)/ (X2(3)=205,041, p<0,005). Por fim os valores do somatório dos participantes, que estão inseridos em no grupo dos “Bons Resultados”( ≥5) foi de 27,14% em T0 passando para 100,00% em T3, enquanto que o grupo dos “Maus Resultados”(<5) foi de 72,86% em T0 e 100% em T3. Conclusão: Os resultados do presente estudo sugerem que a intervenção da Fisioterapia efetuadas em clínicas convencionadas nos casos da Osteoartrose do joelho são efetivas na redução significativa dos níveis de dor e incapacidade funcional e na Perceção global de melhoria em pacientes com Osteoartrose do joelho. ---------- ABSTRACT: Introduction: Osteoarthritis of the knee in particular is a major cause of disabilities in their day-to-day morbidity and increased healthcare costs in the population, in that it is a disease that when symptomatic progresses to a pattern that included joint pain, strength loss, inability to walk and reduction of physical fitness. It is referred as a risk factor for falls and fractures. Its prevalence increases with age, 7% of people between 65-70 years, and 11.2% for those aged 80 or more, ranging from some existing studies. A recent study by the World Health Organization (WHO) reports that osteoarthritis is the fourth leading cause of disability among women and eighth among men. Objective: To describe the characteristics and the outcomes of the physiotherapy practice in patients with knee osteoarthritis. Methodology: A prospective cohort study, with 70 individuals, aged between 60 and 80 years with the diagnosis of knee osteoarthritis and referred to physiotherapy treatment, was carried out. After informed consent, patients were evaluated in four different moments: at baseline (T0), before starting treatment; 4 weeks after starting their treatment (T1); 8 weeks after starting their treatment (T2); and in a 3 months follow-up (T3). Patients were assessed for their socio-demographic and clinical characteristics, pain intensity (using the numeric pain rating scale- NRS), disability (using the Knee Injury and Osteoarthritis Outcome Score), and for their global impression of change (using the Portuguese version of the Patient Glogal Impression of Change scale). Results: The findings of this study indicate a significant increase in all outcomes assessed (pain, disability and global impression of change), during and after the physiotherapy treatment. At T3, the average value for the NRS was 1.63 (± 0.71). For KOOS in the symptoms subscales was 87.60 (± 5.86), pain 85.71 (± 3.99), ADL 78.23 (± 3.48), ADL 67.71 (± 7.16), QV 80.71 (± 9.14) for the PGIC-AVD 5.29 (± 0.57), PGIC-PAIN 5.97 (± 0.61). The results obtained though the Friedman test revealed a p-value <0.005. Thus, the improvement of functional capacity reported by participants in the group was statistically different at the different moments of data collection, during and after treatment (X 2 (3) = 208.862, p <0.005) / (X 2 (3) = 205.041, p <0.005). Conclusion: The results of this study show that the physiotherapy treatments made on agreed clinics in cases of osteoarthritis of the knee, are effective in significant reduction in the levels of pain and disability and in perception of overall improvement perception in patients with osteoarthritis of the Knee.

Dor crónica lombar

RESUMO: A Dor Crónica Lombar (DCL) não especifica é entendida como, presença de dor persistente na região lombar, com duração de pelo menos 12 semanas ou presença de recorrências de dor por um período de seis meses, sem causa física específica, isto é, de origem desconhecida (Airaksinen, et al., 2006; Bekkering et al., 2003; Krismer & van Tulder, 2007). Em Portugal, 36% de pessoas referem dor crónica, sendo que em 40% destes casos são relativos a dor crónica lombar (Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, 2007 cit. por APED, 2007 e Castro-Lopes, Saramago, Romão & Paiva, 2010). A frequência de DCL não é só elevada em Portugal como em todos os países desenvolvidos, estimando-se que a sua prevalência varie entre 23 a 30% (Walker, 2000; Cassidy, Cote, Carroll & Kristman, 2005). É também conhecido, que esta condição representa elevadas taxas de absentismo laboral e incapacidade funcional (Nakamura, Nishiwaki, Ushida & Toyama, 2011; Webb et al., 2003; Sá, Baptista, Matos & Lessa, 2008), afigurando cerca de 80% dos custos dos cuidados de saúde (Waddell, 1998). A fisioterapia é uma intervenção comunmente utilizada na DCL (Airaksinen et al., 2006; Savigny et al., 2009). Esta considera variadíssimas modalidades e múltiplos procedimentos de intervenção, com enorme diversidade na conjugação dos mesmos (Airaksinen et al., 2006; Savigny et al., 2009; Moníz & Cruz, 2012), assim como no número de sessões realizadas por episódio de cuidados (Moníz & Cruz, 2012), tornando quase impossível determinar um qualquer padrão de tratamentos (Gil, Cabri & Ferreira, 2009).

Adaptação cultural e contributo para a validação da pain attitudes and believes scale for physiotherapists (PABS-PT) para a população de fisioterapeutas portugueses

RESUMO: Introdução: Vários estudos têm encontrado evidência para a relação entre as crenças e atitudes dos profissionais de saúde, a sua abordagem de tratamento, referida como orientada segundo o modelo biomédico ou modelo biopsicossocial (Bishop, 2008; Mutsaers, 2012), e os resultados obtidos. É sugerido que, no tratamento da dor lombar crónica, os profissionais que orientam o seu raciocínio e prática segundo o modelo biomédico, tendem a obter piores resultados quando comparados com os obtidos pelos profissionais que orientam o seu raciocínio e prática segundo uma abordagem biopsicossocial. Esta área de estudo tem salientado a importância de desenhar instrumentos capazes de identificar a orientação preferencial dos profissionais de saúde no tratamento da dor crónica de natureza músculo-esquelética, entre os quais se encontra a “Pain Attitudes and Beliefs Scale for Physiotherapists” (PABS-PT). Objetivo: Adaptar culturalmente a PABS-PT para a população de fisioterapeutas portugueses que intervêm em utentes com dor (lombar) crónica, e contribuir para a sua validação Metodologia: A versão original (língua inglesa) do PABS-PT foi adaptada para a língua e cultura portuguesas, através das etapas definidas nas normas orientadoras estabelecidas para este processo (Beaton et al., 2002; MAPI Institute, 2001). A avaliação das propriedades psicométricas da versão portuguesa foi realizada com recurso a uma amostra de 202 fisioterapeutas e estudantes finalistas do curso de licenciatura em Fisioterapia. Inicialmente foi realizada a análise fatorial exploratória da escala através do método das componentes principais. Posteriormente avaliou-se a consistência interna das componentes obtidas com recurso ao alpha de Cronbach (α). Para analisar a validade de constructo foram correlacionadas as componentes obtidas com a versão portuguesa da “Health Care Providers’ Pain and Impairment Relationship Scale” (HC-PAIRS), recorrendo ao cálculo do coeficiente de Spearman. Resultados: O processo de adaptação cultural não revelou dificuldades importantes sendo considerado que a versão portuguesa da PABS-PT é de fácil compreensão e preenchimento, e os seus itens adequados para avaliar as crenças e atitudes dos fisioterapeutas portugueses relativas à intervenção na dor crónica músculo-esquelética. Os resultados revelaram uma estrutura fatorial de duas componentes, identificadas com as componentes da escala original que explicam 30,96% da variância total. A consistência interna encontrada é boa, para a componente biomédica (α de Cronbach = 0,826), mas muito fraca para a componente biopsicossocial (α de Cronbach= 0,589). Relativamente à validade convergente e discriminativa, foi encontrada uma associação estatisticamente significativa e positiva, entre as componentes 1 (biomédica) da versão nportuguesa da PABS e a HC-PAIRS (Rs = 0,481, p≤ 0,005), e negativa, fraca e significativa entre a pontuação total da componente 2 (biopsicossocial) e a HC-PAIRS (Rs = -0,038, p=0,612). Conclusão: A versão portuguesa do PABS-PT é de fácil compreensão e aparenta ser um instrumento válido para a medição da orientação preferencial dos fisioterapeutas, relativamente às suas atitudes e crenças na avaliação e tratamento de utentes com dor crónica de natureza músculo-esquelética. No entanto, a componente biopsicossocial requer uma análise mais aprofundada para que possa, com rigor, ser utilizada na definição de uma orientação preferencialmente biopsicossocial.--------------ABSTRACT: Introduction: Previous studies have found a relation between the beliefs and attitudes of health professionals, their treatment approach, which can follows a biomedical or a biopsychosocial orientation (Bishop, 2008; Mutsaers, 2012), and the outcomes obtained. Therefore, is suggested that the professionals who tend to approach chronic low back pain patients according to the biomedical model have worse outcomes than professionals who use a biopsychosocial approach in there clinical reasoning. This research field has highlighted the importance of developing measures capable of identifying the preferred orientation of health professionals in the treatment of chronic pain of musculoskeletal nature, including the “Pain Attitudes and Beliefs Scale for Physiotherapists” (PABS-PT). Objective: To cross culturally adapt and validate the PABS-PT for the Portuguese population of physiotherapists. Methodology: The original version (English version) of the PABS-PT was adapted to the Portuguese language and culture, through the guidelines established for these processes (Beaton et al., 2002; MAPI Institute, 2001). The psychometric evaluation of the Portuguese version was carried out on a sample of 202 p physiotherapist and final year students of the physiotherapy course. Initially, an exploratory factorial analysis was performed through the method of the main components. Then, the internal consistence of the main components was evaluated using the Cronbach’s alpha (α). The convergent construct validity was analysed through the correlation between the obtained components of PABS-PT and the Health Care Provider’s Pain and Impairment Relationship Scale (HC-PAIRS), using the Spearmen correlation coefficient. Results: No major difficulties were found during the cultural adaptation process of PABS-PT to Portugal, which means that the Portuguese version is easy to understand and fulfill, and items are appropriated to evaluate the beliefs and attitudes of the Portuguese physiotherapists who treat chronic pain of musculoskeletal origins. The results revealed a factorial structure of two components, as the original scale, explaining 30,96% of the total variance. Internal consistence results were good, for the biomedical component (Cronbach’s α = 0,826), but very weak for the biopsychosocial componente (Cronbach’s α = 0,589). Relatively to convergent and discriminative validity, a statistically significant association was found, between the components 1 (biomedical) of the Portuguese version of PABS-PT and the HC-PAIRS (Rs= 0,481, p≤ 0,005) and negative, weak and significant between the total score of component 2 (biopsychosocial) and the HC-PAIRS (Rs = -0,038, p=0,612). Conclusion: The Portuguese Version of PABS-PT is easy to understand and seems to be a valid instrument to measure the attitudes and beliefs of physiotherapists in the management of patients with chronic low back pain. However, the biopsychosocial component requires a further deep analysis to examine a preferable biopsychosocial orientation.

Unravelling the role of alpha 2,6 sialic acid on mouse dentritic cells functions

RESUMO: As células dendríticas (CDs) são fundamentais na imunomodulação e iniciação de respostas imunes adaptativas, enquanto os ácidos siálicos (Sias) são potenciais imunomoduladores. Estas células expressam níveis elevados da sialiltransferase ST6Gal-1, que transfere Sias para a posição terminal de oligossacáridos. De facto, a maturação de CDs está associada a uma diminuição da sialilação na sua superfície celular. Apesar de ter função biológica desconhecida, a forma solúvel, extracelular de ST6Gal-1 aumenta em cancros e inflamação. Ainda assim, esta foi recentemente identificada como moduladora da hematopoiese. Considerando o importante papel das CDs na iniciação de respostas anticancerígenas, uma ligação entre a sialilação extrínseca induzida por ST6Gal-1 extracelular e o seu papel na modulação de CDs deve ser identificada. Neste trabalho hipotetizou-se que a sialilação α2,6 extrínseca de CDs diminui o seu perfil de maturação mediante ativação por lipopolissacarídeo (LPS). O objetivo principal foi sialilar extrinsecamente em α2,6 CDs da medula óssea de murganhos, avaliando os seus perfis de maturação e de libertação de citocinas, após estimulação com LPS (por Citometria de Fluxo e ELISA, respetivamente). Ao contrário da hipótese, o perfil celular não foi modulado, usando várias abordagens. Por outro lado, a consequência da falta de α2,6 Sias na maturação de CDs foi avaliada analisando: 1) CDs da medula óssea de murganhos tratadas com sialidase, 2) CDs da medula óssea e 3) CDs das vias aéreas, ambas de murganhos deficientes em ST6Gal-1, comparando com a estirpe selvagem. Estes resultados sugerem que a perta total de α2,6 Sias se relaciona com o aumento da expressão do complexo de histocompatibilidade principal de classe II. Apesar de controverso, é provável existirem mecanismos inerentes à ativação por LPS, reduzindo a eficácia de ST6Gal-1 extracelular. Por outro lado, a modificação no perfil de CDs de murganhos deficientes em ST6Gal-1 poderá relacionar-se com uma predisposição para um estado inflamatório severo. Com isto, o trabalho desenvolvido abriu futuras linhas de investigação, nomeadamente explorar outros fatores envolvidos na (de)sialilação α2,6 de CDs, podendo ter impacto em imunoterapia com uso de CDs.--------------------------ABSTRACT: Dendritic cells (DCs) are vital for immunomodulation and the initiation of adaptive immune responses, whereas sialic acids (Sias) are potential immunomodulators. These cells express high levels of sialyltransferase ST6Gal-1, responsible for transferring Sias to the terminal position of oligosaccharide chains. Indeed, DCs’ maturation is associated with decreased cell surface sialylation. Although its biological significance is unknown, the soluble, extracellular form of ST6Gal-1 increases in cancers and inflammation. However, extracellular ST6Gal-1 was recently identified as modulator of hematopoiesis. Considering that DCs play a crucial role in the initiation of a productive anti-cancer immune response, a link between extrinsic sialylation by the extracellular ST6Gal-1 on DC function needs to be investigated. We hypothesize that extrinsic α2,6 sialylation of DCs diminishes their maturation features upon lipopolysaccharide (LPS) stimulation. The main goal was to extrinsically α2,6 sialylate mice bone marrow derived DCs (BMDCs) and to evaluate their maturation and cytokine profiles upon LPS stimulation (by Flow Cytometry and ELISA, respectively). Unlike the hypothesis, we observed that BMDCs’ profile is not modulated, even using several approaches. In contrast, the consequence of lacking cell surface α2,6 Sias in DC maturation was assessed by analysing: 1) sialidase treated BMDCs, 2) BMDCs from mice lacking ST6Gal-1 and 3) DCs from mice airways, comparing wild type with ST6Gal-1 knockout mice. These results suggest that overall lack in α2,6 Sias is related with increased expression of major histocompatibility class II (MHC-II). Although appearing to be controversial findings, other intracellular mechanisms might be occurring upon LPS-induced BMDC activation, probably reducing extracellular ST6Gal-1 effect. In opposite, the modification observed in DC profile of ST6Gal-1 knockout mice might be related to its predisposition to a more severe inflammatory status. With this, the developed work opened future lines of investigation, namely exploring other factors involved in α2,6 (de)sialylation of DC, which might have influence in immunotherapy using DCs.

Análise de perigos físicos não metálicos para a implementação da norma IFS em linhas automatizadas de padaria ultracongelada

As crises alimentares, a par de procedimentos nutricionais deficientes, vêm conferindo prioridade ao desenvolvimento de múltiplos aspetos de segurança e qualidade na indústria alimentar. Acresce ainda que a globalização do comércio também levou à necessidade de criação de padrões de qualidade e segurança alimentar tais como a IFS. Neste enquadramento, o objetivo deste estudo consistiu na análise de perigos físicos não metálicos, no âmbito da implementação da IFS, em unidades de padaria, numa indústria de produtos de panificação e pastelaria pré confecionados e ultracongelados. Inicialmente foi realizado um enquadramento teórico, o estudo do caso – PANICONGELADOS, massas congeladas SA, relativo ao processo produtivo das padarias 2 e 3. Procedeu-se posteriormente à análise dos perigos físicos não metálicos com incidência na avaliação das infraestruturas e equipamentos, revisão do SGSA, das metodologias e procedimentos estabelecidos para a gestão de perigos físicos relativos à produção, limpeza e higienização e manutenção. Com base no reconhecimento da situação apontaram-se as necessidades e oportunidades de melhoria. Definiram-se ainda as prioridades básicas para cumprimento dos requisitos relativos à obtenção da certificação IFS.

Primary cilia and the regulation of hedgehog signaling: link to cardiac development

RESUMO: As células eucarióticas evoluíram um sistema de sinalização complexo que lhes permite responder aos sinais extracelulares e intracelulares. Desta forma, as vias de sinalização são essenciais para a sobrevivência da célula e do organismo, uma vez que regulam processos fundamentais, tais como o desenvolvimento, o crescimento, a imunidade, e a homeostase dos tecidos. A via de transdução de sinal Hedgehog (Hh) envolve o receptor Patched1 (Ptch1), que tem um efeito inibidor sobre a proteína Smoothened (Smo) na ausência dos seus ligandos, as proteínas Sonic hedgehog (Shh). Estas proteínas são reguladores fundamentais do desenvolvimento embrionário, como ilustrado pelas malformações drásticas observadas em embriões humanos e de murganho com perturbações da transdução de sinal da via Hh e que incluem polidactilia, defeitos craniofaciais e malformações ósseas. Igualmente importantes são as consequências da ativação inapropriada da via de sinalização Hh na formação de tumores. Curiosamente, os componentes desta via localizam-se nos cílios primários. Além disso, demonstrou-se que esta localização é crucial para a sinalização através da via Hh. Na presença dos ligandos, Ptch1 é internalizado e destinado a degradação ou sequestrado num compartimento da célula de onde não pode desempenhar o seu papel inibitório. A proteína Arl13b é uma pequena GTPase pertencente à família Arf/Arl da superfamília Ras de pequenas GTPases e foi implicada no síndrome de Joubert, uma ciliopatia caracterizada por ataxia congénita cerebelar, hipotonia, atrso mental e cardiopatia congénita. Murganhos deficientes para Arl13b, chamado hennin (hnn) morrem morrem prematuramente ao dia 13,5 de gestação (E13,5) e exibem anomalias morfológicas nos cílios que levam à interrupção da sinalização Hh. Além disso, a Arl13b está diretamente envolvida na regulação da via Hh, controlando a localização de vários componentes desta via nos cílios primários. Neste trabalho, mostramos que a Arl13b se localiza em circular dorsal ruffles (CDRs), que são estruturas de actina envolvidas em macropinocitose e internalização de recetores, e que regula a sua formação. Além disso, aprofundámos o conhecimento do processo de ativação da via de sinalização Hh, mostrando que as CDRs sequestram seletivamente e internalizam o recetor Ptch1. As CDRs formam-se minutos após ativação da via por ligandos Shh ou pelo agonista de Smo SAG e continuam a ser formadas a partir daí, sugerindo uma indução contínua da reorganização do citoesqueleto de actina quando a via está ativada. Observámos ainda que a inibição da formação de CDRs através do silenciamento de WAVE1, uma proteína necessária para a formação destas estruturas, resulta na diminuição da ativação da via de sinalização Hh. Além disso, o bloqueio da macropinocitose, que se segue ao fecho das CDRs, através do silenciamento de uma proteína necessária para a cisão de macropinossomas, nomeadamente a proteína BARS, tem um efeito semelhante. Estes resultados sugerem que as CDRs e a macropinocitose são necessárias para a ativação da via de sinalização Hh e indicam que esta via de internalização controla os níveis de sinal Hh. Durante o desenvolvimento, as células proliferativas dependem do cílio primário para a transdução de várias vias de sinalização. A via Hh induz a diferenciação do músculo cardíaco. Por conseguinte, os murganhos deficientes na via de sinalização Hh exibem uma variedade de defeitos de lateralidade, incluindo alteração do looping do coração, como pode ser visto em murganhos deficientes para Arl13b. Por conseguinte, investigámos o papel da Arl13b no desenvolvimento do coração. Mostramos que a Arl13b é altamente expressa no coração de embriões de murganho e de murganhos adultos ao nível do mRNA e da proteína. Além disso, o perfil de distribuição da Arl13b no coração segue o dos cílios primários, que são essenciais para o desenvolvimento cardíaco. Corações de murganhos hnn no estadio E12,5 mostram um canal átrio-ventricular aberto, espessamento da camada compacta ventricular e aumento do índice mitótico no ventrículo esquerdo. Além disso, um atraso de 1 a 2 dias no desenvolvimento é observado em corações de murganhos hnn, quando comparados com controlos selvagens no estadio E13,5. Assim, estes resultados sugerem que a Arl13b é necessária para o desenvolvimento embrionário do coração e que defeitos cardíacos podem contribuir para a letalidade embrionária de murganhos hnn. Em suma, foi estabelecido um novo mecanismo para a regulação dos níveis de superfície do recetor Ptch1, que envolve a remodelação do citoesqueleto de actina e a formação de CDRs após a ativação da via de sinalização Hh. Este mecanismo permite um feedback negativo que evita a repressão excessiva da via através da remoção de Ptch1 da superfície da célula. Além disso, determinou-se que uma mutação de perda de função na Arl13b causa defeitos cardíacos durante o desenvolvimento, possivelmente relacionados com a associação dos defeitos em cílios primários e na sinalização Hh, existentes em murganhos deficientes para Arl13b. A via de sinalização Hh tem tido um papel central entre as vias de sinalização, uma vez que a sua regulação é crucial para o funcionamento apropriada da célula. Assim, a descoberta de um novo mecanismo de tráfego através de macropinocitose e CDRs que controla a ativação e repressão da via de sinalização Hh traz novas perspetivas de como esta via pode ser regulada e pode ainda conduzir à identificação de novos alvos e estratégias terapêuticas. --------------------ABSTRACT: Eukaryotic cells have evolved a complex signaling system that allows them to respond to extracellular and intracellular cues. Signaling pathways are essential for cell and organism survival, since they regulate fundamental processes such as development, growth, immunity, and tissue homeostasis. The Hedgehog (Hh) pathway of signal transduction involves the receptor Patched1 (Ptch1), which has an inhibitory effect on Smoothened (Smo) in the absence of its ligands, the Sonic hedgehog (Shh) proteins. These proteins are fundamental regulators of embryonic development, as illustrated by the dramatic malformations seen in human and mouse embryos with perturbed Hh signal transduction that include polydactyly, craniofacial defects and skeletal malformations. Equally important are the consequences of inappropriate activation of the Hh signaling response in tumor formation. Interestingly, the components of this pathway localize to primary cilia. Moreover, it has been shown that this localization is crucial for Hh signaling. However, in the presence of the ligands, Ptch1 is internalized and destined for degradation or sequestered in a cell compartment where it no longer can play its inhibitory role. ADP-ribosylation factor-like (Arl) 13b, a small GTPase belonging to Arf/Arl family of the Ras superfamily of small GTPases has been implicated in Joubert syndrome, a ciliopathy characterized by congenital cerebellar ataxia, hypotonia, intellectual disability and congenital heart disease. Arl13b-deficient mice, called hennin (hnn) die at embryonic day 13.5 (E13.5) and display morphological abnormalities in primary cilia that lead to the disruption of Hh signaling. Furthermore, Arl13b is directly involved in the regulation of Hh signaling by controlling the localization of several components of this pathway to primary cilia. Here, we show that Arl13b localizes to and regulates the formation of circular dorsal rufles (CDRs), which are actin-basedstructures known to be involved in macropinocytosis and receptor internalization. Additionally, we extended the knowledge of the Hh signaling activation process by showing that CDRs selectively sequester and internalize Ptch1 receptors. CDRs are formed minutes after Hh activation by Shh ligands or the Smo agonist SAG and keep being formed thereafter, suggesting a continuous induction of actin reorganization when the pathway is switched on. Importantly, we observed that disruption of CDRs by silencing WAVE1, a protein required for CDR formation, results in down-regulation of Hh signaling activation. Moreover, the blockade of macropinocytosis, which follows CDR closure, through silencing of a protein necessary for the fission of macropinosomes, namely BARS has a similar effect. These results suggest that CDRs and macropinocytosis are necessary for activation of Hh signaling and indicate that this pathway of internalization controls Hh signal levels. During development, proliferating cells rely on the primary cilium for the transduction of several signaling pathways. Hh induces the differentiation of cardiac muscle. Accordingly, Hh-deficient mice display a variety of laterality defects, including alteration of heart looping, as seen in Arl13b-deficient mice. Therefore, we investigated the role of Arl13b in heart development. We show that Arl13b is highly expressed in the heart of both embryonic and adult mice at mRNA and protein levels. Also, Arl13b localization profile mimics that of primary cilia, which have been shown to be essential to early heart development. E12.5 hnn hearts show an open atrioventricular channel, increased thickening of the ventricular compact layer and increased mitotic index in the left ventricle. Moreover, a delay of 1 to 2 days in development is observed in hnn hearts, when compared to wild-type controls at E13.5. Hence, these results suggest that Arl13b is necessary for embryonic heart development and that cardiac defects might contribute to the embryonic lethality of hnn mice. Altogether, we established a novel mechanism for the regulation of Ptch1 surface levels, involving cytoskeleton remodeling and CDR formation upon Hh signaling activation. This mechanism allows a negative feedback loop that prevents excessive repression of the pathway by removing Ptch1 from the cell surface. Additionally, we determined that the Arl13b loss-offunction mutation causes cardiac defects during development, possibly related to the associated ciliary and Hh signaling defects found in Arl13b-deficient mice. Hh signaling has taken a center stage among the signaling pathways since its regulation is crucial for the appropriate output and function of the cell. Hence, the finding of a novel trafficking mechanism through CDRs and macropinocytosis that controls Hh signaling activation and repression brings new insights to how this pathway can be regulated and can lead to the discovery of novel therapeutic targets and strategies.

The role of s-nitrosothiols and rho-kinase 1 in glucose and lipid metabolism

RESUMO: Na sociedade contemporânea a diabetes tipo 2 e a obesidade estão a aumentar exponencialmente, representando um grave problema de saúde pública. De acordo com a IDF “A diabetes e a obesidade são o principal problema de saúde pública do século XXI’. Para além destas duas patologias, a prevalência de esteatose hepática não-alcoólica (NAFLD), entre a população obesa e diabética, é de cerca de 90%. O aumento da obesidade, diabetes e NAFLD tem uma forte correlação com o aumento do consumo de gorduras e açúcares, acompanhado de um decréscimo acentuado da actividade física. A obesidade, diabetes e NAFLD tem sido escrupolosamente investigada mas as terapêuticas disponíveis continuam a ser muito limitadas. Tendo em conta o número crescente e alarmante de obesos e diabéticos o conhecimento detalhado da patofisiologia da obesidade, diabetes e NAFLD, tendo em vista a necessidade extrema de desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas, é da mais elevada urgência. O fígado é reconhecido como um orgão primordial no controlo da homeostase. No estado pós-prandial, o fígado converte a glucose em glicogénio e lípidos. Em contraste, no estado de jejum, o fígado promove a produção de glucose. Sistemas neuronais e hormonais, bem como o estado metabólico do fígado, controlam de forma muito precisa a alternância entre os diferentes substratos metabólicos, dependente do estado prandial. A insulina tem um papel central no controlo do metabolismo energético no fígado; se, por um lado, inibe a produção hepática de glucose e corpos cetónicos, por outro, promove a glicólise e a lipogénese. O metabolismo energético no fígado é também regulado por vários factores de transcrição e co-reguladores que, por sua vez, são regulados pela insulina, glucagina e outras hormonas metabólicas. Em conjunto, todos estes factores e reguladores vão controlar de forma muito estreita a gluconeogénese, a β-oxidação e a lipogénese, no fígado. Para além dos já conhecidos reguladores do metabolismo hepático, novas moléculas têm sido estudadas como tendo um papel fundamental na regulação do metabolismo energético no fígado. Qualquer desequilíbrio no metabolismo hepático vai contribuir para a insulino-resistência, NAFLD e diabetes tipo 2. O principal objectivo do trabalho de investigação aqui apresentado é o contributo para o estudo detalhado da patogénese da diabetes e obesidade, num contexto de dietas ricas em açúcares e gorduras, e com a perspectiva de explorar novas estratégias terapêuticas. Os objectivos específicos deste trabalho eram: primeiro, determinar se o tratamento com glutationo (GSH) e óxido nítrico (NO) era suficiente para melhorar a insulino-resistência associada ao elevado consumo de sacarose; segundo, determinar o papel da Rho-kinase 1 (ROCK1) na regulação do metabolismo hepático da glucose e dos lípidos; e terceiro, estudar o efeito do metilsulfonilmetano (MSM) em doenças metabólicas associadas à obesidade. Na primeira parte deste trabalho de investigação foram utilizados ratos Wistar machos sujeitos a uma dieta rica em sacarose (HS). Tal como esperado, estes animais apresentavam insulino-resistência e hiperinsulinémia. A dieta HS levou ao aumento dos níveis hepáticos de NO e ao decréscimo dos níveis de GSH no fígado. Em jejum, a administração intraportal de GSH e NO, a animais saudáveis promoveu um aumento significativo da sensibilidade à insulina. Também nestes animais, a administração intravenosa de S-nitrosotióis, compostos orgânicos que contém um grupo nitroso acoplado a um átomo de enxofre de um tiol, promoveu o aumento significativo da sensibilidade à insulina. Pelo contrário, em animais sujeitos à dieta HS, as doses padrão de GSH + NO e de S-nitrosotióis não conseguiram promover o aumento da sensibilidade à insulina. No entanto, ao aumentar a dose de S-nitrosotióis administrados por via intravenosa, foi possível observar o aumento da sensibilidade à insulina dependente da dose, indicando um possível papel dos S-nitrosotióis como sensibilizadores de insulina. O estudo detalhado do papel dos S-nitrosotióis na via de sinalização da insulina revelou que há um aumento da fosforilação do receptor da insulina (IR) e da proteína cinase B (Akt), sugerindo um efeito dos S-nitrosotióis nesta via de sinalização. Os resultados apresentados nesta primeira parte sugerem que os S-nitrosotióis promovem a correcta acção da insulina, podendo vir a ser importantes alvos terapêuticos. Na segunda parte deste trabalho de investigação utilizámos murganhos, com uma delecção específica da ROCK1 no fígado, e sujeitos a uma dieta rica em lípidos (HFD). Foi possível concluir que a ausência da ROCK1 no fígado previne a obesidade, melhora a sensibilidade à insulina e protege contra a esteatose hepática. A ausência de ROCK1 no fígado levou a um decréscimo significativo da expressão génica de genes associados à lipogénese, com uma diminuição acentuada do fluxo metabólico associado a esta via. Pelo contrário, a sobreexpressão de ROCK1, exclusivamente no fígado, promove a insulino-resistência e a esteatose hepática no contexto de obesidade induzida pela dieta. Para além disto, a delecção da ROCK1 no fígado de animais obesos e diabéticos, os murganhos deficientes em leptina, corroborou os dados obtidos no primeiro modelo animal, com a franca melhoria da hiperglicémia, hiperinsulinémia e esteatose hepática. Os dados que compõem esta parte do trabalho de investigação sugerem que a ROCK1 tem um papel crucial na regulação do metabolismo lipídico. Na terceira e última parte deste trabalho de investigação foi investigado o efeito do composto metilsulfunilmetano (MSM), um composto organosulfúrico naturalmente presente em plantas e utilizado também como suplemento dietético, em murganhos obesos e insulino-resistentes, por exposição a uma dieta rica em lípidos (DIO). O tratamento com MSM melhorou a insulino-resistência e protegeu contra a esteatose hepática. O conteúdo hepático em triglicéridos e colesterol também diminuíu de forma significativa nos animais DIO sujeitos ao tratamento com MSM, bem como a expressão génica associada à lipogénese. Para além disto, o tratamento com MSM levou a uma diminuição da expressão génica associada à inflamação. De realçar que o tratamento com MSM levou a uma melhoria do perfil hematopoiético destes animais, tanto na medula óssea como no sangue. Para comprovar o efeito benéfico do MSM na obesidade e insulino-resistência utilizámos murganhos deficientes no receptor da leptina, e por isso obesos e diabéticos, tendo observado um perfil semelhante ao obtido para murganhos sujeitos a uma dieta rica em lípidos e tratados com MSM. Concluímos, através dos dados recolhidos, que o MSM como suplemento pode ter efeitos benéficos na hiperinsulinémia, insulino-resistência e inflamação que caracterizam a diabetes tipo 2. Em resumo, os dados obtidos neste trabalho de investigação mostram que os S-nitrosotióis podem ter um papel importante como sensibilizadores da insulina, promovendo um aumento da sensibilidade à insulina num contexto de dietas ricas em sacarose. Para além disto, estudos in vitro, sugerem que os S-nitrosotióis regulam, especificamente, a via de sinalização da insulina. Este trabalho teve também como objectivo o estudo da ROCK1 como regulador do metabolismo da glucose e dos lípidos no fígado. Através do estudo de animais com uma delecção ou uma sobreexpressão da ROCK1 no fígado mostrou-se que esta tem um papel crucial na patogénese da obesidade e diabetes tipo 2, especificamente através do controlo da lipogénese de novo. Finalmente, foi também objectivo deste trabalho, explorar o efeito do MSM em animais DIO e deficientes em leptina. O tratamento com MSM protege de forma evidente contra a obesidade e insulino-resistência, com especial enfâse para a capacidade que esta molécula demonstrou ter na protecção contra a inflamação. Em conjunto os vários estudos aqui apresentados mostram que tanto os S-nitrosotióis como a ROCK1 têm um papel na patogénese da obesidade e diabetes tipo 2 e que a utilização de MSM como suplemento às terapêuticas convencionais pode ter um papel no tratamentos de doenças metabólicas.-------------------------------ABSTRACT: In modern western societies type 2 diabetes and obesity are increasing exponentially, representing a somber public concern. According to the International Diabetes Federation (IDF) ‘Diabetes and Obesity are the biggest public health challenges of the 21st century’. Aside from these the prevalence of nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD), among the diabetic and obese population, is as high as 90%. It is now well established that the increase in obesity, diabetes and NAFLD strongly correlates with an increase in fat and sugar intake in our diet, alongside physical inactivity. The pathogenesis of obesity, diabetes and NAFLD has been thoroughly studied but the treatment options available are still narrow. Considering the alarming number in the obese and diabetic population the complete understanding of the pathogenesis, keeping in mind that new therapeutic strategies need to be attained, is of the highest urgency. The liver has been well established as a fundamental organ in regulating whole-body homeostasis. In the fed state the liver converts the glucose into glycogen and lipids. Conversely, in the fasted state, glucose will be produced in the liver. Neuronal and hormonal systems, as well as the hepatic metabolic states, tightly control the fast to fed switch in metabolic fuels. Insulin has a central role in controlling hepatic energy metabolism, by suppressing glucose production and ketogenesis, while stimulating glycolysis and lipogenesis. Liver energy metabolism is also regulated by various transcription factors and coregulators that are, in turn, regulated by insulin, glucagon and other metabolic hormones. Together, these regulators will act to control gluconeogenesis, β-oxidation and lipogenesis in the liver. Aside from the well-established regulators of liver energy metabolism new molecules are being studied has having a role in regulating hepatic metabolism. Any imbalance in the liver energy metabolism is a major contributor to insulin resistance, NAFLD and type 2 diabetes. The overall goal of this research work was to contribute to the understanding of the pathogenesis of diabetes and obesity, on a setting of high-sucrose and high-fat diets, and to explore potential therapeutic options. The specific aims were: first, to determine if treatment with glutathione (GSH) and nitric oxide (NO) was sufficient to ameliorate insulin resistance induced by high-sucrose feeding; second, to determine the physiological role of rho-kinase 1 (ROCK1) in regulating hepatic and lipid metabolism; and third, to study the effect of methylsulfonylmethane (MSM) on obesity-linked metabolic disorders. In the first part of this research work we used male Wistar rats fed a high-sucrose (HS) diet. As expected, rats fed a HS diet were insulin resistant and hyperinsulinemic. HS feeding increased hepatic levels of NO, while decreasing GSH. In fasted healthy animals administration of both GSH and NO, to the liver, was able to increase insulin sensitivity. Intravenous administration of S-nitrosothiols, organic compounds containing a nitroso group attached to the sulfur atom of a thiol, in fasted control animals also increased insulin sensitivity. Under HS feeding the standard doses of GSH + NO and S-nitrosothiols were unable to promote an increase in insulin sensitivity. However, the intravenous administration of increasing concentrations of S-nitrosothiols was able to restore insulin sensitivity, suggesting that S-nitrosothiols have an insulin sensitizing effect. Investigation of the effect of S-nitrosothiols on the insulin signaling pathway showed increased phosphorylation of the insulin receptor (IR) and protein kinase B (Akt), suggesting that S-nitrosothiols may have an effect on the insulin signaling pathway. Together, these data showed that S-nitrosothiols promote normal insulin action, suggesting that they may act as potential pharmacological tools. In the second part of this research work we used liver-specific ROCK1 knockout mice fed a high-fat (HF) diet. Liver-specific deletion of ROCK1 prevented obesity, improved insulin sensitivity and protected against hepatic steatosis. Deficiency of ROCK1 in the liver caused a significant decrease in the gene expression of lipogenesis associated gene, ultimately leading to decreased lipogenesis. Contrariwise, ROCK1 overexpression in the liver promoted insulin resistance and hepatic steatosis in diet-induced obesity. Furthermore, liver-specific deletion of ROCK1 in obese and diabetic mice, the leptin-deficient mice, improved the typical hyperglycemia, hyperinsulinemia and liver steatosis. Together, these data identify ROCK1 as a crucial regulator of lipid metabolism. In the third and final part of this research work we investigated the effect of MSM, an organosulfur compound naturally found in plants and used as a dietary supplement, on diet-induced obese (DIO) and insulin resistant mice. MSM treatment ameliorated insulin resistance and protected against hepatosteatosis. Hepatic content in triglycerides and cholesterol was significantly decreased by MSM treatment, as well as lipogenesis associated gene expression. Furthermore, MSM treated mice had decreased inflammation associated gene expression in the liver. Importantly, FACS analysis showed that MSM treatment rescued the inflammatory hematopoietic phenotype of DIO mice in the bone marrow and the peripheral blood. Moreover, MSM treatment of the obese and diabetic mice, the leptin-deficient mice, resulted in similar effects as the ones observed for DIO mice. Collectively, these data suggest that MSM supplementation has a beneficial effect on hyperinsulinemia, insulin resistance and inflammation, which are often found in type 2 diabetes. In conclusion, this research work showed that S-nitrosothiols may play a role as insulin sensitizers, restoring insulin sensitivity in a setting of high-sucrose induced insulin resistance. Furthermore, in vitro studies suggest that S-nitrosothiols specifically regulate the insulin signaling pathway. This research work also investigated the role of hepatic ROCK1 in regulation of glucose and lipid metabolism. Using liver-specific ROCK 1 knockout and ROCK1 overexpressing mice it was shown that ROCK1 plays a role in the pathogenesis of obesity and type 2 diabetes, specifically through regulation of the de novo lipogenesis pathway. Finally, this research work aimed to explore the effect of MSM in DIO and leptin receptor-deficient mice. MSM strongly protects against obesity and insulin resistance, moreover showed a robust ability to decrease inflammation. Together, the individual studies that compose this dissertation showed that S-nitrosothiols and ROCK1 play a role in the pathogenesis of obesity and type 2 diabetes and that MSM supplementation may have a role in the treatment of metabolic disorders.

The role of α2,3- and α2,6-sialylation

RESUMO: Os glicoconjugados que decoram a superfície celular e os lípidos e proteínas secretados ocupam o ponto de encontro onde normalmente ocorrem interacções críticas homólogas (hospedeiro-hospedeiro) e heterólogas (hospedeiro-patogénio). Apesar de ser largamente aceite que os glicanos são parte integrante do processo de imunidade, continua a não ser claro qual o papel que os glicanos, em toda a sua diversidade, tomam no quadro geral da imunidade. Os glicanos, que são frequentemente terminados por resíduos de ácido siálico, podem ser alterados por factores externos, tais como patogénios, ou por acontecimentos fisiológicos celulares específicos. Normalmente em posição terminal, as glico-estruturas que contêm ácido siálico assumem um papel fundamental numa quantidade substancial de receptores imunes envolvidos na adesividade e tráfico celular, tal como as Selectinas e as Siglecs, das quais se sabe apresentarem uma relevante função imune. À altura do início desta tese, era sabido que os ácidos siálicos expressos à superfície das células poderiam modular mecanismos importantes nas respostas imunes adaptativas. Considerando a posição de charneira que as células dendríticas (DCs) ocupam na transição da resposta imune inata para a adaptativa, antecipámos que os ácidos siálicos poderiam também modular mecanismos relevantes nas DCs humanas. As DCs têm uma função muito relevante na verificação e captura antigénica, migração para os gânglios linfáticos e apresentação antigénica aos linfócitos, uma sequência de funções que conduz, em ultima instância, à indução da resposta inata adaptativa. Considerando estas premissas, a nossa hipótese principal foi que os ácidos siálicos podem influenciar funções relevantes das DCs, tais como captura de antigénios, maturação, migração para os gânglios linfáticos e apresentação antigénica às células Para testar esta hipótese, dividimos o trabalho em quatro partes: 1) Analisámos os glicanos sialilados de superfície, expressos durante a diferenciação de monócitos humanos em DCs (moDCs). Os nossos dados mostraram que a expressão dos glicanos com ligações em O (O-glicanos) e sialilados em α2,3, assim como glicanos com ligações em N (N-glicanos) sialilados em α2,6 e α2,3 aumentou durante o processo de diferenciação das moDCs. Contribuindo para esta nova configuração glicosídica, três sialiltransferases (STs) poderão estar envolvidas: a ST6Gal-1 correlaciona-se com a expressão aumentada de N-glicanos sialilados em α2,6; a ST3Gal-1 contribui para a sialilação em α2,3 de O-glicanos, em especial de antigénios T; e a ST3Gal-4 poderá ser responsável pelo aumento de N-glicanos sialilados em α2,3. Após estímulo e consequente maturação das moDCs, ambos os níveis de expressão génica de ST6Gal-1 e ST3Gal-4 são negativamente modificados sendo, também, que a expressão de ST3Gal-1 varia consoante o estímulo. 2) Estudámos posteriormente as consequências da modulação dos ácidos siálicos de superfície nas funções das DCs. Observámos que a remoção dos ácidos siálicos de superfície diminui significativamente a capacidade de macropinocitose e endocitose mediada por receptores nas moDCs. Em contrapartida, o tratamento com sialidase aumentou significativamente a capacidade das moDCs para fagocitar Escherichia coli. Determinou-se também que este mecanismo requer a existência de ácido siálico presente nas E. coli indicando um mecanismo de interacção hospedeiro-patogénio dependente de ácido siálico em ambas as partes envolvidas. As moDCs tratadas com sialidase também apresentam um nível superior de expressão de moléculas de MHC e moléculas co-estimulatórias, sugerindo um fenótipo celular mais maduro. Recorrendo ao modelo de ratinho, utilizaram-se DCs derivadas de células da medula (BMDCs) de ratinhos deficientes em ST3Gal-1 e ST6Gal-1. Estes ensaios revelaram que quer a endocitose quer a maturação são influenciadas por modificações 37 nos glicanos sialilados em α2,3 ou α2,6. A detecção e quantificação de proteínas Nglicosiladas e sialiladas em α2,6 apontou para um potencial envolvimento de integrinas β2 nestes mecanismos. 3) O efeito da sialilação em α2,6 na migração das DCs para os gânglios linfáticos foi também analisado. Observámos que BMDCs deficientes para ST6Gal-1 apresentam uma redução de cerca de 50% nos níveis de migração das DCs para os gânglios linfáticos, tal como aferido em ensaios de inflamação in situ e estudos de transferência adoptiva de células. Uma redução dos níveis deste tipo de migração foi também observada quando BMDCs nativas foram transferidas para ratinhos receptores deficientes em ST6Gal-1. São, contudo, necessários mais ensaios de forma a identificar as moléculas envolvidas neste processo. 4) Por último, analisámos o impacto da sialilação na estimulação antigénica das DCs às células T. Assim, concluiu-se que moDCs tratadas com sialidase apresentam um nível de expressão superior de IL-12, TNF-ɑ, IL-6 e IL-10, e activação do factor de transcrição nuclear kappa B (NF-κB). As DCs tratadas com sialidase induziram uma maior proliferação nas células T, com expressão correspondente de interferão-γ. Este dado sugere que a remoção de ácidos siálicos de superfície contribui para o desenvolvimento de uma resposta pro-inflamatória do tipo 1 por células T auxiliares (resposta Th1). Considerando estes dados no seu todo, concluímos que o ácido siálico tem um papel marcante nas funções imunes das DCs. Alterações à concentração de ácido siálico à superfície das células podem alterar a endocitose/fagocitose, maturação, migração para os tecidos e gânglios linfáticos e capacidade estimulatória para com as células T. Complementando estes dados, as ligações glicosídicas de ácidos siálicos criados por ST6Gal-1 e ST3Gal-1 são funcionalmente relevantes. A modulação programada da sialilação do glicocálice, mediada por sialidases individuais ou sialiltransferases é uma possibilidade aceitável para a melhoria da fagocitose por DCs e da sua potência imunológica. Este facto tem um significado particular para imunoterapias baseadas em DCs, podendo provar-se decisivo para a sua eficiência e aplicabilidade num futuro muito próximo.-------------------------------ABSTRACT: Glycans decorating cell surface and secreted proteins and lipids occupy the junction where critical host–host and host-pathogen interactions occur. In spite of the wide acceptance that glycans are centrally implicated in immunity, exactly how glycans and their variety and variability contribute to the overall immune response remains poorly defined. Glycans, frequently terminated by sialic acid residues, may be modified by external factors such as pathogens or upon specific physiological cellular events. The terminal, privileged positions of sialic acid-modified structures makes them key, fundamental determinants for a number of immune receptors with known involvement in cellular adhesiveness and cell trafficking, such as Selectins and Siglecs, with known relevant immune functions. At the time this thesis was initiated, it was established that sialic acids expressed at cell surface could modulate important mechanisms of the adaptive immune responses. Given the key role of dendritic cells (DCs) in the transition from innate to the adaptive immune responses, we anticipated that sialic acids could also modulate important mechanisms of human DCs. DCs have a relevant role in antigen screening and uptake, migration to lymph nodes and antigen presentation to lymphocytes, ultimately triggering the adaptive immune response. Therefore, our primary hypothesis was that sialic acids may modulate DC functions, such as antigen uptake, maturation, homing to lymph nodes and antigen presentation to T cells. To test this hypothesis, we divided our work in four parts. 1) Surface sialylated glycans expressed during differentiation from human monocytes to DCs (moDCs) were analyzed. Our data showed that α2,3-sialylated O-glycans and α2,6- and α2,3-sialylated N-glycans expression increased during moDC differentiation. Three main sialyltransferases (STs) are committed with this new glycan configuration: ST6Gal- 1 correlates with the increased expression of α2,6-sialylated N-glycans; ST3Gal-1 32 contributes for the α2,3-sialylation of O-glycans, especially T antigens; and ST3Gal-4 may contribute for the increased α2,3-sialylated N-glycans. Upon moDC maturation, ST6Gal-1 and ST3Gal-4 are downregulated and ST3Gal-1 is altered in a stimulus dependent manner. 2) We subsequently analyzed the consequences of the modulation of cell surface sialic acids in DC functions. We observed that removing surface sialic acid by sialidase significantly decreased the capacity of moDCs to micropinocytose and receptormediated endocytose. In contrast, treatment with a sialidase significantly improved the capacity of moDCs to phagocytose Escherichia coli. The improved phagocytosis mechanism required E. coli sialic acids, indicating a mechanism of host–pathogen interaction dependent on sialic acid moieties. Sialidase-treated moDCs have increased expression of MHC and co-stimulatory molecules, suggesting a more mature phenotype. Experiments using mouse bone marrow-derived DCs (BMDCs) from ST3Gal-1-/- and ST6Gal-1-/- strains indicated that endocytosis and maturation are influenced by changes in either α2,3 or α2,6-sialylated glycans. The analysis of α2,6-sialylated, N-glycosylated proteins, strongly suggested the potential involvement of β2 integrins, underlying these mechanisms. 3) The effect of α2,6-sialylation in DC homing to lymph nodes was also analyzed. We observed that BMDCs deficient for ST6Gal-1 have an almost 50% reduction in DC homing, as assayed by in situ inflammation and adoptive transfer studies. A reduction in DC homing was also observed when wild type BMDCs were transferred into ST6Gal-1-/- recipient mice. Further investigations are necessary to identify the molecules involved in this process. 4) Finally, we also analyzed the impact of sialylation on DCs ability to prime T cells. Sialidase-treated moDCs show increased gene expression of IL-12, TNF-α, IL-6 and IL- 10 cytokines, and activation of the transcription factor nuclear factor-κB. Sialidase33 treated DCs induced a higher proliferative response of T cells with concomitant higher expression of interferon-γ, suggesting that the clearance of cell surface sialic acids contributes to the development of a T helper type 1 proinflammatory response. Together, our data strongly support sialic acid’s relevance in DC immune functions. Alterations of cell surface sialic acid content can alter the endocytosis/phagocytosis, maturation, migration/homing and the ability for T cell priming in human DCs. Moreover, sialic acid linkages created by ST6Gal-1 and ST3Gal-1 are functionally relevant. The engineering of cell surface sialylation, mediated by individual sialidases or sialyltransferases is a likely possibility to fine tune DC phagocytosis and immunological potency, with particular significance to DC-based therapies.

Análise do acesso aos cuidados de reabilitação em Angola

RESUMO - Angola é um país em desenvolvimento e dado o baixo número de profissionais na reabilitação e a centralização dos cuidados desta área na capital do país, Luanda, é pertinente caraterizar o acesso dos utentes e perceber em que medida é que a oferta destes cuidados satisfaz as necessidades atuais da população. Sendo assim, este estudo teve como objetivos, avaliar o acesso dos utentes do Centro de Referência Nacional público para Reabilitação em Angola, CMFR, e identificação de áreas prioritárias de ação para promoção de igualdade no acesso. A análise metodológica consistiu na recolha e análise de dados dos utentes que acederam ao CMFR de Setembro de 2014 a Janeiro de 2015 e pesquisa documental abrangente, não-sistemática, sobre equidade e acesso a cuidados de saúde em Reabilitação a nivel internacional e em Angola. Para o tratamento e recolha de dados foram consideradas variáveis sociodemográficas e caraterizadoras do acesso onde se fez a caraterização da população em estudo, análise das variáveis resultantes do acesso ao CMFR através de uma análise de regressão.