Melanosome transfer between melanocytes and keratinocytes

RESUMO: A pele é o maior órgão do corpo humano e a sua pigmentação é essencial para a sua coloração e proteção contra os efeitos nocivos da radiação ultravioleta (UV). A pigmentação da pele resulta essencialmente de três processos: a síntese e o armazenamento de melanina pelos melanócitos, em organelos especializados denominados melanossomas; o transporte dos melanossomas dentro dos melanócitos; e finalmente, a transferência dos melanossomas para os queratinócitos adjacentes. Nos queratinócitos, a melanina migra para a região perinuclear apical da célula para formar um escudo protetor,responsável pela proteção do DNA dos danos causados pela radiação UV. Os melanócitos estão localizados na camada basal da epiderme e contactam com 30-40 queratinócitos. Em conjunto, estas células formam a “unidade melano-epidérmica”. Apesar dos processos de síntese e transporte de melanina nos melanócitos estarem bastante bem caracterizados, os mecanismos moleculares subjacentes à transferência inter-celular de melanina são menos conhecidos e ainda controversos. Dados preliminares obtidos pelo nosso grupo, que se basearam na observação de amostras de pele humana por microscopia electrónica, indicam que a forma predominante de transferência de melanina na epiderme consiste na exocitose dos melanossomas pelos melanócitos e subsequente endocitose da melanina por queratinócitos. Para além disso sabe-se que as proteínas Rab, que controlam o tráfego membranar, estão envolvidas em várias etapas de pigmentação da pele, nomeadamente na biogénese e no transporte de melanina. Assim, dado o seu papel fundamental nestes processos, questionámo-nos sobre o seu envolvimento na transferência de melanina. Com este trabalho, propomo-nos a expandir o conhecimento atual sobre a transferência de melanina na pele, através do estudo detalhado dos seus mecanismos moleculares, identificando as proteínas Rab que regulam o processo. Pretendemos também confirmar o modelo de exo/endocitose como sendo o mecanismo principal de transferência de melanina. Primeiro, explorámos a regulação da secreção de melanina pelos melanócitos e analisámos o papel de proteínas Rab neste processo. Os resultados foram obtidos recorrendo a um método in vitro, desenvolvido previamente no laboratório, que avalia a quantidade de melanina segregada para o meio de cultura por espectrofotometria, e ainda por microscopia, contando o número de melanossomas transferidos para os queratinócitos. Através de co-culturas de melanócitos e queratinócitos, verificou-se que os queratinócitos estimulam a libertação de melanina dos melanócitos para o meio extra-celular, bem como a sua transferência para os queratinócitos. Além disso, a proteína Rab11b foi identificada como um regulador da exocitose de melanina e da sua transferência para os queratinócitos. De facto, a diminuição da expressão de Rab11b em melanócitos provocou a redução da secreção de melanina estimulada por queratinócitos, bem como da transferência desta. Em segundo lugar, para complementar o nosso estudo, centrámos a nossa investigação na internalização de melanina por queratinócitos. Especificamente, usando uma biblioteca de siRNA, explorámos o envolvimento de proteínas Rab na captação de melanina por queratinócitos. Como primeira abordagem, usámos esferas fluorescentes como substituto de melanina, avaliando os resultados por citometria de fluxo. No entanto, este método revelou-se ineficaz uma vez que a internalização destas esferas é independente do recetor PAR-2 (recetor 2 ativado por protease), que foi previamente descrito como essencial na captação de melanina por queratinócitos Posteriormente, foi desenvolvido um novo protocolo de endocitose baseado em microscopia, usando melanossomas sem a membrana envolvente (melanocores) purificados do meio de cultura de melanócitos, incluindo um programa informático especialmente desenhado para realizar uma análise semi-automatizada. Após internalização, os melanocores acumulam-se na região perinuclear dos queratinócitos, em estruturas que se assemelham ao escudo supranuclear observado na pele humana. Seguidamente, o envolvimento do recetor PAR-2 na captação de melanocores por queratinócitos foi confirmado, utilizando o novo protocolo de endocitose desenvolvido. Para além disso, a necessidade de quatro proteínas Rab foi identificada na internalização de melanocores por queratinócitos. A redução da expressão de Rab1a ou Rab5b em queratinócitos diminuiu significativamente o nível de internalização de melanocores, enquanto o silenciamento da expressão de Rab2a ou Rab14 aumentou a quantidade de melanocores internalizados por estas células. Em conclusão, os resultados apresentados corroboram as observações anteriores, obtidas em amostras de pele humana, e sugerem que o mecanismo de transferência predominante é a exocitose de melanina pelos melanócitos, induzida por queratinócitos, seguida por endocitose pelos queratinócitos. A pigmentação da pele tem implicações tanto ao nível da cosmética, como ao nível médico, relacionadas com foto-envelhecimento e com doenças pigmentares. Assim sendo, ao esclarecer quais os mecanismos moleculares que regulam a transferência de melanina na pele, este trabalho pode conduzir ao desenvolvimento de novas estratégias para modular a pigmentação da pele.----------------ABSTRACT: Skin pigmentation is achieved through the highly regulated production of the pigment melanin in specialized organelles, termed melanosomes within melanocytes. These are transported from their site of synthesis to the melanocyte periphery before being transferred to keratinocytes where melanin forms a supra-nuclear cap to protect the DNA from UVinduced damage. Together, melanocytes and keratinocytes form a functional complex, termed “epidermal-melanin unit”, that confers color and photoprotective properties to the skin. Skin pigmentation requires three processes: the biogenesis of melanin; its intracelular transport within the melanocyte to the cell periphery; and the melanin transfer to keratinocytes. The first two processes have been extensively characterized. However, despite significant advances that have been made over the past few years, the mechanisms underlying inter-cellular transfer of pigment from melanocytes to keratinocytes remain controversial.Preliminary studies from our group using electron microscopy and human skin samples found evidence for a mechanism of coupled exocytosis-endocytosis. Rab GTPases are master regulators of intracellular trafficking and have already been implicated in several steps of skin pigmentation. Thus, we proposed to explore and characterize the molecular mechanisms of melanin transfer and the role of Rab GTPases in this process. Moreover, we investigated whether the exo/endocytosis model is the main mechanism of melanin transfer. We first focused on melanin exocytosis by melanocytes. Then, we started to investigate the key regulatory Rab proteins involved in this step by establishing an in vitro tissue culture model of melanin secretion. Using co-cultures of melanocytes and keratinocytes, we found that keratinocytes stimulate melanin release and transfer. Moreover, depletion of Rab11b decreases keratinocyte-induced melanin exocytosis by melanocytes. In order to determine whether melanin exocytosis is a predominant mechanism of melanin transfer, the amount of melanin transferred to keratinocytes was then assayed in conditions where melanin exocytosis was inhibited. Indeed, Rab11b depletion resulted in a significant decrease in melanin uptake by keratinocytes. Taken together, these observations suggest that Rab11b mediates melanosome exocytosis from melanocytes and transfer to keratinocytes. To complement and extend our study, we of melanin by keratinocytes. Thus, we aimed to explore the effect of depleting Rab GTPases on melanin uptake and trafficking within keratinocytes. As a first approach, we used fluorescent microspheres as a melanin surrogate. However, the uptake of microspheres was observed to be independent of PAR-2, a receptor that is required for melanin uptakecentred our attention in the internalization of melanin by keratinocytes. Thus, we aimed to explore the effect of depleting Rab GTPases on melanin uptake and trafficking within keratinocytes. As a first approach, we used fluorescent microspheres as a melanin surrogate. However, the uptake of microspheres was observed to be independent of PAR-2, a receptor that is required for melanin uptake.Therefore, we concluded that microspheres were uptaken by keratinocytes through a different pathway than melanin. Subsequently, we developed a microscopy-based endocytosis assay using purified melanocores (melanosomes lacking the limiting membrane) from melanocytes, including a program to perform a semi-automated analysis. Melanocores are taken up by keratinocytes and accumulate in structures in the perinuclear area that resemble the physiological supranuclear cap observed in human skin. We then confirmed the involvement of PAR-2 receptor in the uptake of melanocores by keratinocytes, using the newly developed assay. Furthermore, we identified the role of four Rab GTPases on the uptake of melanocores by keratinocytes. Depletion of Rab1a and Rab5b from keratinocytes significantly reduced the uptake of melanocores, whereas Rab2a, and Rab14 silencing increased the amount the melanocores internalized by XB2 keratinocytes. In conclusion, we present evidence supporting keratinocyte-inducedmelanosome exocytosis from melanocytes, followed by endocytosis of the melanin core by keratinocytes as the predominant mechanism of melanin transfer in skin. Although advances have been made, there is a need for more effective and safer therapies directed at pigmentation disorders and also treatments for cosmetic applications. Hence, the understanding of the above mechanisms of skin pigmentation will lead to a greater appreciation of the molecular machinery underlying human skin pigmentation and could interest the pharmaceutical and cosmetic industries.

Avaliação de tecnologias de redução de volume das lamas produzidas em ETAR

O adequado tratamento da água residual revela-se de extrema importância na preservação dos recursos naturais e da qualidade de vida. Esse tratamento é caracterizado pela produção de subprodutos que incluem resíduos removidos da água residual e lama produzida no tratamento da mesma. Ao longo do tempo, as directrizes europeias têm vindo a ser cada vez mais restritivas quanto aos valores limite que determinam a qualidade de emissão da água residual ou de deposição da lama, por forma a minimizar os impactes negativos no local de recepção dos mesmos e redução dos custos de transporte, no caso da lama, pelo que a ETAR deve ser planeada de forma a garantir o cumprimento da legislação em vigor, de acordo com a qualidade da água residual afluente à estação. O tratamento na estação divide-se em linha de fase líquida e sólida. No tratamento convencional da fase sólida, a lama é tratada segundo a sequência de etapas espessamento, estabilização e desidratação. Nesta dissertação será dada especial relevância à linha de fase sólida, com o intuito de apresentar, caracterizar e comparar as tecnologias (além do tratamento convencional) que se encontram em fase experimental ou já implantadas em ETAR e têm como objectivo a redução do volume da lama produzida. Será desenvolvida uma aplicação informática de apoio à decisão quanto à tecnologia indicada, de acordo com as variáveis seleccionadas pelo utilizador. As tecnologias dividem-se em: processos biológicos, hidrólise, oxidação avançada, química, térmica e mecânica. Nos biológicos a redução do volume da lama pode ser garantida pela predação dos microrganismos, pela manutenção/inibição do metabolismo e pela alteração/introdução de um reactor biológico na estação. A hidrólise é optimizada após doseamento de enzimas ou por aumento da temperatura. A oxidação avançada é caracterizada pelas tecnologias de ozonização, processo de Fenton, oxidação por ar húmido e oxidação electroquímica. A tecnologia química depende da adição de reagente ácido, alcalino ou outro. A tecnologia mecânica abrange a sonificação, o moinho de rotação, o reactor de homogeneização, a aplicação de campo eléctrico, a aplicação de radiação gama, recurso a técnicas centrífugas e aplicação de pressão na lama. A elevação da temperatura de reacção por meio convencional, por aplicação de radiação de micro-ondas ou garantindo o ciclo de congelamento/aquecimento pertencem à tecnologia térmica. Estas tecnologias podem ser aplicadas numa fase anterior ou posterior da estabilização da lama por forma a melhorar a biodegradabilidade dos compostos orgânicos e reduzir o número de microrganismos viáveis. As tecnologias actuam por meio de libertação de energia, radiação ou pressão no sentido de garantir os objectivos descritos e podem ser aplicadas individualmente ou combinadas (sistema híbrido). Assim o consumo energético, o incremento de matéria orgânica e a capacidade de redução da quantidade de lama são factores que devem ser considerados na escolha da melhor tecnologia que se adequa a cada ETAR.

Contributo da curva de débito-volume na detecção da obstrução da via aérea central

RESUMO: Introdução: A obstrução da via aérea central (OVAC) refere-se a um processo patológico que conduz a limitação do fluxo de ar ao nível do espaço glótico e subglótico, traqueia e brônquios principais. O seu correcto diagnóstico e tratamento constituem um território de interesse e preocupação para os profissionais de saúde, e requerem um profundo conhecimento da sua etiologia, fisiologia, diagnóstico e opções terapêuticas dado o potencial em originar significativa morbilidade e mortalidade. A avaliação da OVAC abrange múltiplas vertentes, entre as quais se salienta o componente clínico (sinais e sintomas), a repercussão fisiopatológica (função respiratória) e o estudo imagiológico (TC do tórax e broncoscopia). A compilação destes dados associada à etiologia, constituem factores importantes para estabelecer o prognóstico, determinar a necessidade de tratamento ou delinear uma futura intervenção terapêutica. A broncoscopia é o Gold Standard de avaliação desta condição, mas desde há cerca de 40 anos a curva de débito-volume constitui uma ferramenta não invasiva de detecção de OVAC. Apesar deste método ser utilizado até os nossos dias, poucos têm sido os estudos com o objectivo de verificar a sensibilidade e especificidade da curva de débito-volume na detecção de OVAC, bem como averiguar a relação entre as alterações morfológicas e quantitativas da mesma com a localização, o tipo e o grau da obstrução. Material e Métodos: Entre 1 de Novembro de 2009 e 30 de Abril de 2010, os doentes com indicação para a realização de broncoscopia diagnóstica ou terapêutica na Unidade de Técnicas Invasivas Pneumológicas (UTIP) do Centro Hospitalar Lisboa Norte – Hospital Pulido Valente (CHLN – HPV) foram seleccionados de forma consecutiva de acordo com os critérios de inclusão e exclusão. As avaliações (broncoscopia, curva de débito-volume e avaliação da dispneia) realizaram-se com um intervalo de tempo máximo de sete dias. A broncoscopia flexível foi realizada segundo as normas da British Thoracic Society e as curvas de débito-volume segundo as normas da ATS/ERS TaskForce 2005. Para a avaliação da dispneia recorreu-se à escala de dispneia MRC (Medical Research Council). Um painel de peritos realizou a avaliação da morfologia da curva de débito-volume (sugestiva ou não de OVAC) e um elemento independente a verificação dos critérios quantitativos e morfológicos (variáveis intra e extratorácica e fixa) da curva. O estudo foi aprovado pela Comissão de Ética para a Saúde do CHLN e todos os doentes assinaram um consentimento informado de participação. Resultados: Estudaram-se 82 doentes, 36 (44%) dos quais com OVAC. A predominância foi do género masculino, em relação ao feminino. A sensibilidade e especificidade dos critérios quantitativos da curva de débito-volume na detecção de OVAC foi de 91.3% e 88.9% respectivamente. Quando se utilizaram os critérios morfológicos da curva de débito-volume os valores foram de 93.5% e 30.6%. A agregação dos critérios morfológicos e quantitativos permitiu alcançar uma sensibilidade de 95.7% e especificidade de 86.1%. Nesta amostra, o critério quantitativo com maior ocorrência foi o FEF50/FIF50≥1 (83% dos doentes com OVAC). Este mostrou relacionar-se com todas as localizações de obstrução excepto o terço médio da traqueia. Mostrou, ainda, ter uma relação forte e positiva com o grau e tipo de obstrução (intra e extraluminal). O segundo foi o FEV1/PEF≥8, presente em 36% dos casos de OVAC. Relacionou-se com as obstruções no terço inferior da traqueia e brônquio principal direito (BPD). Também apresentou relação forte e positiva com o grau de obstrução e com os tipos de obstrução anteriormente descritos. Quanto à sintomatologia foi possível associar o grau de obstrução com o de dispneia e a presença de estridor com o grau e localização da obstrução na traqueia. Conclusões: Os resultados deste estudo demonstram que os critérios quantitativos da curva de débito-volume têm elevada sensibilidade e especificidade na detecção de OVAC. O critério FEV50/FIF50≥1 tem um bom poder discriminativo na detecção dessa condição, tendo sido relacionado com a localização, o grau e o tipo de obstrução. O critério FEV1/PEF≥8, embora com menor poder discriminativo, também se relaciona com o grau, a localização e o tipo de obstrução. A morfologia da curva tem uma boa sensibilidade mas baixa especificidade na detecção de OVAC, mas a agregação entre os critérios morfológicos e quantitativos aumenta a sensibilidade e especificidade. A dispneia e o estridor foram relacionados com o grau de obstrução e o último com a localização ao nível da traqueia.-------------ABSTRACT: Introduction: Central airway obstruction (CAO) refers to a pathological process that leads to restriction of airflow at the level of the glottis and subglottis, trachea and main bronchi. It’s proper diagnosis and treatment is an area of interest and concern to health professionals, and requires a deep knowledge of its etiology, physiology, diagnosis and treatment options, concerning the potential to cause significant morbidity and mortality. The evaluation of CAO covers multiple aspects: the clinical component (signs and symptoms), the pathophysiological effect (lung function) and the imaging study (bronchoscopy and chest CT). The compilation of this data associated with the etiology, are important for establishing prognosis, determine the need for treatment or outline a future therapeutic intervention. Bronchoscopy is the gold standard for evaluating this condition, but for the last 40 years the flow-volume loop has been used as a noninvasive tool for detecting CAO. Although this method is still in use, only few studies were made in order to verify its sensitivity and specificity in detecting CAO, and investigate the relation between morphological and quantitative changes of the curve to location, type and degree of obstruction. Methods: Between 1st November 2009 and 30th April 2010, patients with indication to perform diagnostic or therapeutic bronchoscopy in Interventional Pulmonology Unit - Hospital Pulido Valente (CHLN - HPV), were selected consecutively according to the inclusion and exclusion criteria. All assessments (bronchoscopy, flow-volume loop and dyspnea) were carried out within a period of seven days. The flexible bronchoscopy was performed according to the standards of the British Thoracic Society and the flow-volume loops in accordance with the standards of the ATS / ERS Taskforce 2005. For the evaluation of dyspnea was used to MRC dyspnea scale (Medical Research Council). A panel of experts evaluated the morphology of flow-volume loop (suggestive or non-suggestive of CAO) and an independent element established the quantitative criteria and morphological (intra and extrathoracic variables and fixed) of the curve. This study was approved by the Ethics Committee for Health CHLN and all the patients signed an informed consent to participate. Results: We’ve studied 82 patients, 36 (44%) of those with CAO. The majority of the patients were males, compared to females. The sensitivity and specificity of the quantitative criteria of the flow-volume curve in detecting CAO was 91.3% and 88.9% respectively. When we used the morphological criteria of flow-volume loop these values were 93.5% and 30.6%. The combination of quantitative and morphological criteria produced values of 95.7% sensitivity and 86.1% specificity. FEF50/FIF50≥1 was the most representative quantitative criterion (83% of patients with CAO) and it was correlated with all sites of obstruction except in the middle third of the trachea. It has shown a strong and positive association with the degree and type of obstruction (intra and extraluminal). The second was the FEV1/PEF ≥ 8, present in 36% of cases of CAO. It could be correlated with the obstruction in the lower third of the trachea and right main bronchus. It also showed a strong positive relation with the degree and types of obstruction described above. Regarding symptoms, we found a link between the degree of obstruction and dyspnea. The presence of stridor was correlated with the location and the degree of obstruction in the trachea. Conclusion: The results of this study demonstrate that the quantitative criteria of the flow-volume loop have a high sensitivity and specificity in detecting CAO. The criterion FEV50/FIF50 ≥ 1 has a good discriminative power to detect this condition and was related to the location, degree and type of obstruction. The criterion FEV1/PEF ≥ 8, although with a weaker discriminative power, also relates to the degree, location and type of obstruction. The morphology of the curve has a good sensitivity but low specificity in detecting CAO although the combination between the morphological and quantitative criteria increases sensitivity and specificity. Dyspnea and stridor were related to the degree of obstruction and the last one with its location in the trachea.

Increasing sales volume in mass business through inbound contact center

Field lab: Consulting lab

Essays in health economics: Volume-Outcome Effect, upcoding behaviour and the evaluation of a short-term intervention program

Evidence in the literature suggests a negative relationship between volume of medical procedures and mortality rates in the health care sector. In general, high-volume hospitals appear to achieve lower mortality rates, although considerable variation exists. However, most studies focus on US hospitals, which face different incentives than hospitals in a National Health Service (NHS). In order to add to the literature, this study aims to understand what happens in a NHS. Results reveal a statistically significant correlation between volume of procedures and better outcomes for the following medical procedures: cerebral infarction, respiratory infections, circulatory disorders with AMI, bowel procedures, cirrhosis, and hip and femur procedures. The effect is explained with the practice-makes-perfect hypothesis through static effects of scale with little evidence of learning-by-doing. The centralization of those medical procedures is recommended given that this policy would save a considerable number of lives (reduction of 12% in deaths for cerebral infarction).

The new economy: Essays in network economics and two-sided markets

Following the Introduction, which surveys existing literature on the technology advances and regulation in telecommunications and on two-sided markets, we address specific issues on the industries of the New Economy, featured by the existence of network effects. We seek to explore how each one of these industries work, identify potential market failures and find new solutions at the economic regulation level promoting social welfare. In Chapter 1 we analyze a regulatory issue on access prices and investments in the telecommunications market. The existing literature on access prices and investment has pointed out that networks underinvest under a regime of mandatory access provision with a fixed access price per end-user. We propose a new access pricing rule, the indexation approach, i.e., the access price, per end-user, that network i pays to network j is function of the investment levels set by both networks. We show that the indexation can enhance economic efficiency beyond what is achieved with a fixed access price. In particular, access price indexation can simultaneously induce lower retail prices and higher investment and social welfare as compared to a fixed access pricing or a regulatory holidays regime. Furthermore, we provide sufficient conditions under which the indexation can implement the socially optimal investment or the Ramsey solution, which would be impossible to obtain under fixed access pricing. Our results contradict the notion that investment efficiency must be sacrificed for gains in pricing efficiency. In Chapter 2 we investigate the effect of regulations that limit advertising airtime on advertising quality and on social welfare. We show, first, that advertising time regulation may reduce the average quality of advertising broadcast on TV networks. Second, an advertising cap may reduce media platforms and firms' profits, while the net effect on viewers (subscribers) welfare is ambiguous because the ad quality reduction resulting from a regulatory cap o¤sets the subscribers direct gain from watching fewer ads. We find that if subscribers are sufficiently sensitive to ad quality, i.e., the ad quality reduction outweighs the direct effect of the cap, a cap may reduce social welfare. The welfare results suggest that a regulatory authority that is trying to increase welfare via regulation of the volume of advertising on TV might necessitate to also regulate advertising quality or, if regulating quality proves impractical, take the effect of advertising quality into consideration. 3 In Chapter 3 we investigate the rules that govern Electronic Payment Networks (EPNs). In EPNs the No-Surcharge Rule (NSR) requires that merchants charge at most the same amount for a payment card transaction as for cash. In this chapter, we analyze a three- party model (consumers, merchants, and a proprietary EPN) with endogenous transaction volumes and heterogenous merchants' transactional benefits of accepting cards to assess the welfare impacts of the NSR. We show that, if merchants are local monopolists and the network externalities from merchants to cardholders are sufficiently strong, with the exception of the EPN, all agents will be worse o¤ with the NSR, and therefore the NSR is socially undesirable. The positive role of the NSR in terms of improvement of retail price efficiency for cardholders is also highlighted.

Basel III new capital requirements, impacts and bank behavior

For some years, researchers could not find a clear effect of capital adequacy on the risk profile of banks, as shareholders could increase the riskiness of the assets (qualitative effect), crowding-out the effect of reduced leverage (volume effect). Some shareholders might have the will to increase the riskiness of the assets, but they may lack the power to do so. Considering only ”powerful” shareholders, definitive conclusions were drawn but with constant ownership profile. In this paper I investigate whether there is a significant change in the type of shareholders in response to regulatory capital shocks and, if so, will the banking system be in the hands of more “desired” shareholders. I find that ownership profile responds to a regulatory shock, changing the risk appetite of the ruling power at the bank. I find more banks and the government in the ownership of undercapitalised banks and much less institutional shareholders and free float. I claim that these new shareholders may not the desired ones, given the objective of the regulatory change, as they are associated with a preference for more leverage. One possible explanation for this crowding-out effect is that regulators are trying to contain idiosyncratic risk (more linked to the riskiness of the assets) with a rule that contains systematic risk (capital adequacy). This has a distorting effect on ownership. Another insight can be drawn from the tests: supervisors should be aware of significant ownership movements that cause the crowding-out.

Perfil imunológico de grávidas atópicas versus grávidas saudáveis

RESUMO: A prevalência das doenças atópicas tem vindo a aumentar, em especial ao nível dos países ocidentalizados. Vários fatores têm sido apontados para justificar este aumento de prevalência,destacando-se o reduzido tamanho das famílias, o elevado uso de antibióticos, a melhoria das condições sanitárias, bem como a diminuição quer das infeções de helmintas, quer da contaminação orofecal. Alguns estudos têm também avaliado a influência do ambiente pré-natal no desenvolvimento de atopia e asma. Da análise da literatura, parece inegável a importância deste período para o desenvolvimento do sistema imunitário. Neste âmbito, a transmissão de atopia à descendência em mulheres atópicas, e concretamente com asma alérgica, poderá ser moldada desde este período. A possibilidade de identificar marcadores de risco precoces para o desenvolvimento de atopia poderá ser o primeiro passo para o desenvolvimento de estratégias de prevenção para os indivíduos em risco. Este trabalho pretendeu abordar o sistema imunitário materno de forma a enriquecer a sua caraterização desde o terceiro trimestre da gravidez até ao fim do puerpério. Para além da exploração de perfis celulares e citocínicos maternos (nos quais se incluiu sobretudo a avaliação de diferentes populações de células T e B, com funções efetoras e reguladoras), foi também considerada a sua eventual relação com o desenvolvimento de atopia nas crianças. Foram recrutadas 135 mulheres com critérios para serem incluídas num dos 4 grupos do estudo: grávidas atópicas – GA (n=24), não grávidas atópicas – NGA (n=32), grávidas saudáveis – GS (n=44) e não grávidas saudáveis – NGS (n=35). Foram caraterizadas por Citometria de Fluxo populações de leucócitos e linfócitos, com particular interesse nos perfis maturativos de linfócitos T e B, bem como nas subpopulações de células T e B reguladoras. Foi ainda efetuada uma análise funcional, para avaliar a capacidade de produção de citocinas pelos linfócitos T e B. Foram igualmente avaliadas as concentrações de citocinas séricas por ensaios imunoenzimáticos. Estes parâmetros imunológicos maternos foram acompanhados desde o terceiro trimestre de gestação, até depois do puerpério (primeiras 6 semanas pós parto), e aos seis meses de idade, foi efetuada uma avaliação clínica das crianças. As mulheres não grávidas atópicas apresentaram contagens celulares mais elevadas para a generalidade das populações leucocitárias e linfocitárias (em relação a mulheres não grávidas saudáveis). Destaca-se ainda uma maior presença de eosinófilos nas mulheres NGA (p=0,0009; teste de Mann-Whitney U), que tinham igualmente os seus compartimentos linfocitários T e B mais ricos em células de memória, em relação às mulheres NGS. Para os perfis de regulação, verificou-se que as células T reguladoras se encontravam percentualmente aumentadas (p≤0,003; teste de Mann-Whitney U), tal omo as células T produtoras de IL10 após estimulação (p≤0,03; teste de Mann-Whitney U) em mulheres NGA. Também se observou uma maior expressão de Foxp3 (p=0,0002; teste de Mann-Whitney U), e ainda a diminuição dos níveis séricos de IFN-γ nas mulheres NGA (p=0,0019; teste de Mann-Whitney U), em relação a mulheres NGS. De um modo geral, as alterações verificadas nos parâmetros imunológicos de mulheres grávidas atópicas no terceiro trimestre da gravidez foram semelhantes às observadas em mulheres grávidas saudáveis. Comparadas com mulheres NGA, nas mulheres grávidas atópicas ocorreu uma alteração substancial da fórmula leucocitária, com um importante incremento de neutrófilos (p<0,0001; teste de Mann-Whitney U) e diminuição dos valores das restantes populações leucocitárias. A diminuição nas contagens de linfócitos totais estendeu-se a grande parte das subpopulações linfocitárias caraterizadas. Nos compartimentos linfocitários T e B foi possível observar uma diminuição das subpopulações de células de memória. Verificou-se igualmente na gravidez uma menor expressão de Foxp3 em mulheres GA (p<0,0001; teste de Mann-Whitney U) e ainda menos células B CD24HiCD38Hi circulantes (p=0,0012; teste de Mann-Whitney U). Ocrreu ainda uma diminuição relativa das células T CD4 produtoras de IFN-γ em mulheres GA (p≤0,024; teste de Mann-Whitney U), e uma maior presença de células T CD8 produtoras de IL17 (p=0,0172; teste de Mann-Whitney U), em relação ao observado em mulheres NGA. Depois do puerpério, no compartimento T de mulheres do grupo GA, verificou-se um aumento das populações de células de memória. Em comparação com a gravidez, após o puerpério o compartimento B, apresentou nas mulheres GA um aumento significativo da subpopulação de células B de transição (p<0,0001; teste de Wilcoxon). Verificou-se, igualmente em mulheres GA após o puerpério, uma maior expressão de Foxp3 nas células T reguladoras (p<0,0001; teste de Wilcoxon) e o aumento das populações de células T circulantes produtoras de IFN-γ (p≤0,0234; teste de Wilcoxon). As modulações das populações T e B desde a gravidez até depois do puerpério ocorreram de forma semelhante nas mulheres dos grupos GA e GS. Apesar de as mulheres GA manterem um perfil imunológico próximo do das mulheres GS depois do puerpério, aconteceu também neste período um processo de reaproximação ao perfil observado nas mulheres NGA. As mulheres GA com manifestações de risco para atopia na descendência (comparadas com mulheres GA sem manifestações de risco para atopia na descendência até aos 6 meses de vida) apresentaram uma maior proporção de células T e menor proporção de células B, percentagens mais elevadas de células T CD8 de memória efetoras, de células B de transição e de células B CD24HiCD38Hi, e contagens mais baixas de células B de memória. Na avaliação destes parâmetros como marcadores de risco para o desenvolvimento de atopia verificou-se que o parâmetro com melhor desempenho foi a percentagem de células B de transição, com uma Odds-Ratio de 54,0 [IC 95%: 4,2-692,9; (p=0,0005)], sensibilidade de 90,0% [IC 95%: 55,5 – 99,8] e especificidade de 85,7% [IC 95%: 57,2 – 98,2]. Este estudo foi pioneiro em Portugal, e no mundo, no que se refere ao acompanhamento do compartimento linfocitário B circulante, abordando o seu perfil de maturação, e em particular as células B com funções reguladoras, desde a gravidez até ao fim do puerpério, em mulheres atópicas e não atópicas. A este nível, encontram-se estudos na literatura a documentar a alteração do compartimento B durante a gravidez. O presente trabalho reporta agora que alterações, como a diminuição do número de células B em circulação, são impostas também na mulher atópica. Em suma, demonstrou-se a existência de um perfil imunológico caraterístico em mulheres atópicas, que sofre alterações significativas durante a gravidez, tendendo os parâmetros imunológicos a normalizar após o puerpério. O compartimento T, para o qual a literatura é mais rica em estudos e abordagens, demonstrou também neste trabalho oscilações caraterísticas entre o período pré e pós-natal. Verificaram-se sobretudo variações nos compartimentos de células T de memória, sem grandes alterações ao nível das células Treg no que se refere à sua presença em circulação. Apenas a registar a menor expressão de Foxp3 nas células Treg durante a gestação observada em mulheres atópicas, tal como em mulheres saudáveis (como também já foi relatado em estudos anteriores). Apesar de muitos dos dados se encontrarem em concordância com a literatura, quer no que se refere às subpopulações de células de memória, quer no que se refere às células Treg, também se encontram resultados discordantes, por exemplo documentando variações numéricas nas células Treg em circulação em mulheres atópicas e mulheres atópicas grávidas. A importância de harmonizar protocolos e fenótipos, parece crucial na abordagem de estudos futuros. Ao nível do risco para a atopia na descendência de mulheres atópicas, acrescentou-se ainda a possibilidade de definir marcadores não invasivos para a criança, em particular as células B de transição. Estas células, cuja maior presença em circulação no recém-nascido foi recentemente associada com manifestações alérgicas subsequentes, são agora apontadas já na mulher atópica, grávida do terceiro trimestre, como um elemento de risco para o desenvolvimento de atopia. Os marcadores de risco descritos, para além de facilmente poderem vir a ser englobados no âmbito dos normais rastreios maternos durante a gravidez, apresentam ainda a vantagem da precocidade do diagnóstico, permitindo não só a possibilidade de prevenção pós-natal, mas estendendo esta possibilidade ao período gestacional.----------------------------ABSTRACT: The prevalence of atopic diseases has been increasing, especially in Westernized countries. Several factors have been suggested to justify this increase in prevalence, as the small size of families, the high use of antibiotics, the improvement in sanitation conditions, as well as the reduction of both helminth infections, and orofecal contamination. A few studies have adressed the influence of prenatal environment on the development of atopy and asthma. From literature, it seems undeniable the importance of the prenatal period for the development of the immune system. In this context, the transmission of atopy to the progeny in atopic women, and specifically in women with allergic asthma, can be modulated from this period on. The ability to detect early risk markers for the development of atopic diseases may be the first step in the development of prevention strategies for individuals at risk. This study aimed to approach the maternal immune system in order to enrich its characterization from the third trimester of pregnancy until the end of the puerperium period. In addition to the evaluation of the maternal cellular profiles (in which, mostly, diferente populations of T and B cells with effector and regulatory functions were included) and citokines, the relation between these profiles and the development of atopy in the progeny was also assessed. 135 women were recruited for this study, and fullfiled the inclusion criteria necessary to be included in one of the four groups preset: atopic pregnant women - GA (n = 24), atopic nonpregnant women - NGA (n = 32), healthy pregnant women - GS (n = 44) and healthy nonpregnant women - NGS (n = 35). Populations of leukocytes and lymphocytes, and particularty maturation profiles of T and B lymphocytes, as well as subpopulations of T and B cells with regulatory functions, were characterized by flow cytometry. Functional assays were also performed, to assess the ability of cytokine production by T and B lymphocytes. Serum cytokine concentrations were assessed as well by enzymatic immunoassays. These maternal imune parameters were monitored since the third trimester of pregnancy until the end of the puerperium period (first six weeks after delivery). A clinical evaluation of all the newborn children was performed at the age of six months. Non-atopic pregnant women presented higher cell counts for most leukocyte and lymphocyte populations (compared to healthy non-pregnant women). We should also highlight the increased presence of eosinophils in NGA women (p = 0,0009; Mann-Whitney U test). Again compared to NGS women, NGA women showed increased memory cells within the circulating T and B lymphocyte compartments. Considering the regulatory profiles, NGA women presented higher percentages of regulatory T cells (p≤0,003; Mann-Whitney U test) and IL10 producing T cells after stimulation (p≤0,03; Mann Whitney U), as well as increased expression of Foxp3 (p = 0,0002; Mann-Whitney U test), and also decreased serum levels of IFN-γ (p = 0,0019; test Mann-Whitney U test) compared to NGS women. In general, the changes observed in immune parameters of atopic pregnant women in the third trimester of gestation were similar to those observed in healthy pregnant women. Comparing pregnant and non-pregnant atopic women, an important change in leukocyte subsets was observed, with a significant increase of neutrophils (p <0,0001; Mann-Whitney U test) and the consequent diminution of the remaining leukocyte populations in the GA group. The decrease in total lymphocyte counts was extended to most of the lymphocyte subsets characterized. It was possible to detect a decrease in memory cell subsets within the T and B lymphocyte compartments, also. During pregnancy, a lower expression of Foxp3 was reported in GA women (p <0,0001; Mann-Whitney U test) and, besides, lesser CD24HiCD38Hi B cells were present in circulation in these women, compared to NGA women (p = 0,0012; Mann-Whitney U test). There was still a decrease in the percentages of IFN-γ-producing CD4 T cells in GA women (p≤0,024; Mann-Whitney U test) and a greater presence of IL17-producing CD8 T cells (p = 0,0172; Mann-Whitney U test), compared to the levels observed in NGA women. At the end of the puerperium, there was an increase in memory cell subpopulations within the T cell compartment of GA women. Compared with the pregnancy evaluation, after puerperium, the B cell compartment showed a significant increase in the transitional subpopulation (p<0,0001; Wilcoxon test), in GA women. Moreover, after puerperium, GA women exhibited a greater expression of Foxp3 in Treg cells (p <0,0001; Wilcoxon test) and there was an increase in circulating IFN-γ-producing T cells (p≤0,0234; Test Wilcoxon). The modulations of T and B cell subpopulations from pregnancy until the end of puerperium were similar in women of GA and GS groups. Although at the end of puerperium, GA women still kept an immune profile close the one observed in GS women, at this time point, there were also signs of rapprochement between the immune profiles observed in women of GA and NGA groups. GA women with atopic manifestations in the offspring (compared to GA women without atopic manifestations in the offspring at the age of 6 months) presented higher proportions of T cells and lower proportions of B cells, higher percentages of effector memory CD8 T cells, transitional B cells and CD24HiCD38Hi B cells, and, finally, lower absolute counts of memory B cells. In the evaluation of these parameters as risk markers for the development of atopy, the parameter which presented the best performance was the percentage of transitional B cells, with an Oddsratio of 54,0 [95% CI: 4,2 to 692,9; (p = 0,0005)], sensitivity of 90,0% [95% CI: 55,5 to 99,8] and a specificity of 85,7% [95% CI: 57,2 to 98,2]. This study was a pioneer in Portugal, and in the world, in what concerns the monitoring of the circulating B cell compartment, addressing not only the maturation profile, but, in particular, B cells with regulatory functions, from pregnancy untill after puerperium, in atopic and non-atopic women. Literature presents evidence of a typical change in circulating B cells during pregnancy. This study now reports that changes, such as the decrease in the number of circulating B cells,/ are also imposed by pregnancy in atopic woman. In brief, it demonstrated the existence of a characteristic immune profile in atopic women, which undergoes significant alterations during pregnancy, tending to normalize after the puerperium. As for the T cell compartment, for which the literature is richer in studies and approaches, this study also showed characteristic fluctuations between the pre- and postnatal periods. There were variations mostly in the memory subsets within the T cell compartment, without major changes in regulatory T cells regarding their presence in circulation. Only the expression of Foxp3 in Treg cells presented lower levels during pregnancy, in both atopic and healthy women (as previously reported in other studies). Although much of the data now reported are in agreement with literature, regarding either memory cell subsets or regulatory T cells, there are also conflicting results, for example documenting changes in the numbers of regulatory T cells circulating in atopic pregnant and atopic non-pregnant women. The importance of harmonizing protocols and phenotypes seems crucial for the establishement of future studies. Considering the risk for atopy in the offspring of atopic women, this study added the possibility to define non-invasive markers for the child, in particular transitional B cells. These cells, whose greater presence in circulation in newborns has recently been associated with subsequent allergy development, are here identified in atopic pregnant women in the third trimester of gestation as a risk factor in the development of atopy in their progeny. The risk factors described, besides having the capacity to easily become integrated within the normal maternal screening protocols during pregnancy, also have the advantage of an early diagnosis, allowing not only the possibility of postnatal prevention but extending this possibility to the prenatal period.

Optimization of wastewater quality in the Sines refinery

In order to address and resolve the wastewater contamination problem of the Sines refinery with the main objective of optimizing the quality of this stream and reducing the costs charged to the refinery, a dynamic mass balance was developed nd implemented for ammonia and polar oil and grease (O&G) contamination in the wastewater circuit. The inadequate routing of sour gas from the sour water stripping unit and the kerosene caustic washing unit, were identified respectively as the major source of ammonia and polar substances present in the industrial wastewater effluent. For the O&G content, a predictive model was developed for the kerosene caustic washing unit, following the Projection to Latent Structures (PLS) approach. Comparison between analytical data for ammonia and polar O&G concentrations in refinery wastewater originating from the Dissolved Air Flotation (DAF) effluent and the model predictions of the dynamic mass balance calculations are in a very good agreement and highlights the dominant impact of the identified streams for the wastewater contamination levels. The ammonia contamination problem was solved by rerouting the sour gas through an existing clogged line with ammonia salts due to a non-insulated line section, while for the O&G a dynamic mass balance was implemented as an online tool, which allows for prevision of possible contamination situations and taking the required preventive actions, and can also serve as a basis for establishing relationships between the O&G contamination in the refinery wastewater with the properties of the refined crude oils and the process operating conditions. The PLS model developed could be of great asset in both optimizing the existing and designing new refinery wastewater treatment units or reuse schemes. In order to find a possible treatment solution for the spent caustic problem, an on-site pilot plant experiments for NaOH recovery from the refinery kerosene caustic washing unit effluent using an alkaline-resistant nanofiltration (NF) polymeric membrane were performed in order to evaluate its applicability for treating these highly alkaline and contaminated streams. For a constant operating pressure and temperature and adequate operating conditions, 99.9% of oil and grease rejection and 97.7% of chemical oxygen demand (COD) rejection were observed. No noticeable membrane fouling or flux decrease were registered until a volume concentration factor of 3. These results allow for NF permeate reuse instead of fresh caustic and for significant reduction of the wastewater contamination, which can result in savings of 1.5 M€ per year at the current prices for the largest Portuguese oil refinery. The capital investments needed for implementation of the required NF membrane system are less than 10% of those associated with the traditional wet air oxidation solution of the spent caustic problem. The operating costs are very similar, but can be less than half if reusing the NF concentrate in refinery pH control applications. The payback period was estimated to be 1.1 years. Overall, the pilot plant experimental results obtained and the process economic evaluation data indicate a very competitive solution through the proposed NF treatment process, which represents a highly promising alternative to conventional and existing spent caustic treatment units.

Impacto da crise no volume e perfil de internamento de doentes com VIH-SIDA em Portugal Continental : análise temporal 2001-2012

RESUMO - Contexto: O início da crise económica em Portugal no ano de 2009 colocou o país numa grave recessão económica aliada a diversas medidas de austeridade. Como consequência assistiu-se, ao nível nacional, uma diminuição do PIB, aumento do desemprego e assim como uma série de restrições orçamentais em várias áreas, nomeadamente a da saúde. Apesar de existir inúmeros estudos que avaliaram o impacto das recessões económicas na saúde os resultados são controversos e não existe um consenso quanto a esta associação. No que se refere às doenças infeciosas o número de estudos é bastante mais reduzido. O objetivo deste estudo foi o de analisar o impacto da crise atual no volume e perfil de internamento de doentes com VIH/SIDA, de forma a complementar a escassa evidência existente neste domínio. Metodologia: Foram analisados 53,296 episódios de internamento nos hospitais do SNS entre o ano de 2001 e 2012, cujo diagnóstico principal é a infeção pelo VIH/SIDA. Considerou-se o ano de 2009 como o ano inicial da crise. Através de regressões multivariadas avaliou-se o impacto da crise no volume de doentes internados, duração de internamento, número de co-morbilidades, risco de ser admitido via urgência e risco de mortalidade no internamento. Adicionalmente repetiu-se a análise por região NUTS II de Portugal Continental (Norte, Alentejo, LVT, Centro e Algarve). Resultados: A crise não teve impacto no volume de doentes internados. No entanto, após o ano de 2009, registou-se uma diminuição de 5.6% na duração de internamento; um aumento de 1.6% no número de co-morbilidades; um aumento de 11.1% no risco de ser admitido via urgência e um aumento de 8.6% do risco de mortalidade no internamento. As análises por região permitiram verificar que as regiões mais afetadas pela crise foram a região LVT e a região Norte. Conclusão: A crise em Portugal não teve impacto na incidência de internamentos por VIH/SIDA. Porém o aumento do número de co-morbilidades, do risco de ser admitido via urgência e do risco de mortalidade no internamento parece refletir um agravamento da severidade dos casos após o ano de 2009. Adicionalmente a diminuição da duração de internamento com o efeito da crise poderá refletir tanto aumento da eficiência dos cuidados prestados ou ao contrário, uma diminuição da sua qualidade.

Estudo do volume cerebeloso de doentes com síndrome de Down com diferentes graus de demência

O principal objectivo deste trabalho é determinar as diferenças existentes entre os volumes cerebelosos de pacientes com síndrome de Down e de uma população controlo. Adicionalmente, pretende-se verificar se os resultados obtidos a partir de uma segmentação automática coincidem com os resultados obtidos da segmentação manual. A população com síndrome de Down é composta por 7 sujeitos, 3 do sexo masculino e 4 do sexo feminino, e idades compreendidas entre os 25 e os 36 anos. A população controlo é constituída por 7 sujeitos, 6 do sexo masculino e 1 do sexo feminino, com idades compreendidas entre os 22 e os 46 anos. Os volumes do cerebelo e do volume total intracraniano foram calculados a partir de imagens de ressonância magnética, de forma manual e automática. Os softwares MRIcron e Freesurfer/FSL foram utilizados para a segmentação manual e automática dos volumes, respectivamente. Após a obtenção dos dados foi realizada uma análise correlativa de forma a identificar a semelhança existente entre os dados obtidos de forna manual e automática, e também, verificar a relação existente entre o volume cerebeloso e a idade dos sujeitos. Com o objectivo de avaliar a concordância entre resultados, foi ainda aplicado o método de Bland-Altman, de forma a visualizar graficamente a dispersão existente entre os valores obtidos. Os resultados obtidos neste estudo permitem afirmar que existe uma maior correlação entre os volumes obtidos do Freesurfer, e os volumes calculados manualmente. Os resultados ainda mostram que os pacientes com síndrome de Down têm volumes cerebelosos reduzidos em comparação com os resultados da população controlo. Da análise da relação do volume cerebeloso com a idade não foi possível obter resultados satisfatórios.

Efectividade e volume: uma aplicação a hospitais portugueses

RESUMO - Contexto: a avaliação da qualidade como tema potencialmente importante para utentes e prestadores de cuidados de saúde. A taxa de mortalidade como medida de resultados com um adequado ajustamento do risco. A existência de determinadas características estruturais do hospital às quais está associada uma menor mortalidade. Objectivos: identificar diferenças no desempenho e na taxa de mortalidade dos hospitais e investigar que características estruturais justificam essas diferenças. Metodologia: foram seleccionados os episódios de internamento das doenças de maior mortalidade hospitalar. A medida de desempenho considerada foi a comparação entre a mortalidade observada e a mortalidade esperada, calculada a partir da escala preditiva da mortalidade do Disease Staging, recalibrada para Portugal. A medida de desempenho foi analisada por hospital, doença e grupo de doenças. A ordenação dos hospitais pelo desempenho foi comparada com a ordenação dos hospitais pela taxa de mortalidade observada. O desempenho dentro de cada hospital foi analisado para um grupo de doenças seleccionadas. A relação entre o valor da medida de desempenho e as variáveis «número de episódios», «índice tecnológico» e «gravidade dos doentes tratados» foi analisada através da regressão linear para o conjunto dos episódios e para cada doença e grupo de doenças. Resultados: foram incluídos 379 074 episódios, agrupados em 21 doenças e 8 grupos de doenças e tratados em 81 hospitais. A taxa de mortalidade observada foi de 12%. Existiam diferenças no desempenho por hospital, alguns dos quais se destacam pelo seu melhor/pior nível de desempenho. Foram observadas as limitações da taxa de mortalidade bruta como instrumento de análise do desempenho, no contexto de hospitais com diferentes níveis de risco dos doentes tratados. Para além disso, evidenciou-se que a análise do hospital como um todo ou em cada uma das partes tem resultados distintos, dada a existência de diferentes níveis de desempenho dentro do hospital. Finalmente, verificou- se que a relação entre volume e desempenho, quando existe, é, na quase totalidade dos casos, não linear e inversa à referida na literatura.

On project finance and the first road concession in Portugal

In broad sense, Project Financing1 as a mean of financing large scale infrastructural projects worldwide has had a steady growth in popularity for the last 20 years. This growth has been relatively unscathed from most economic cycles. However in the wake of the 2007 systemic Financial Crisis, Project Financing was also in trouble. The liquidity freeze and credit crunch that ensued affected all parties involved. Traditional Lenders, of this type of financial instrument, locked-in long-term contractual obligations, were severely hit with scarcity of funding compounded by rapidly increasing cost of funding. All the while, Banks were “rescued” by the concerted actions of Central Banks and other Multi-Lateral Agencies around the world but at the same time “stressed” by upcoming regulatory effort (Basel Committee). This impact resulted in specific changes to this type of long-term financing. Changes such as Commercial Banks’ increased risk aversion; pricing increase and maturities decrease of credit facilities; enforcement of Market Disruption Event clauses; partial responsibility for project risk by Multilateral Agencies; and adoption of utility-like availability payments in other industrial sectors such as transportation and even social infrastructure. To the extent possible, this report is then divided in three parts. First, it begins with a more instructional part, touching academic literature (theory) and giving the Banks perspective (practice), but mostly as an overview of Project Finance for awareness’ sake. The renowned Harvard Business School professor – Benjamin Esty, states2 that Project Finance is a “relatively unexplored territory for both empirical and theoretical research” which means that academic research efforts are lagging the practice of Project Finance. Second, the report presents a practical case regarding the first Road Concession in Portugal in 1998 ending with the lessons learned 10 years after Financial Close. Lastly, the report concludes with the analysis of the current trends and changes to the industry post Financial Crisis of the late 2000’s. To achieve this I’ll reference relevant papers, books on the subject, online articles and my own experience in the Project Finance Department at a major Portuguese Investment Bank. Regarding the latter, with the signing of a confidentiality agreement, I’m duly omitting sensitive and proprietary bank information.