DNA damage induced by acrylamide: roe of genetic polymorphisms in DNA damage levels

RESUMO:Em 1994 a acrilamida (AA) foi classificada pela IARC como um provável cancerígeno para o homem. Para além da utilização de AA em numerosas aplicações industriais, a AA está também presente numa grande variedade de alimentos ricos em amido e processados a temperaturas elevadas. Esta exposição através da ingestão de produtos alimentares despoletou elevadas preocupações ao nível do risco para a saúde pública e poderá implicar um risco adicional para o aparecimento de cancro. A glicidamida (GA), o metabolito epóxido formado a partir da oxidação da AA provavelmente através do citocromo P450 2E1, é considerada por vários estudos, o principal responsável pela carcinogenicidade da AA. Actualmente existe uma escassez de resultados relativamente aos mecanismos de genotoxicidade da AA e GA em células de mamífero. Por este motivo, o objectivo deste estudo centra-se na avaliação das consequências genéticas da exposição à AA e GA, recorrendo-se para tal ao uso de células de mamífero como modelo. Tendo como base este objectivo avaliou-se a citotoxicidade da AA e GA, através do ensaio do MTT, e realizaram-se dois testes citogenéticos, o teste das aberrações cromossómicas (CAs) e o teste da troca de cromátides irmãs (SCEs), de modo a avaliar as lesões de DNA induzidas por estes compostos em células de hamster Chinês V79. Os resultados globalmente mostraram que a GA é mais citotóxica e clastogénica do que a AA. No âmbito deste trabalho, foi também efectuada a quantificação de aductos específicos de DNA, nomeadamente N7-(2-carbamoil-2-hidroxietil)guanina (N7-GA-Gua) e N3-(2-carbamoil-2-hidroxietil)adenina (N3-GA-Ade). Os resultados obtidos permitem afirmar que os níveis de N7-GA-Gua e a concentração de GA apresentam uma relação linear dose-resposta. Foi também identificada uma óptima correlação entre os níveis de N7-GA-Gua e a frequência de troca de cromátides irmãs. Adicionalmente, e de forma a compreender os mecanismos de toxicidade da AA, estudaram-se os mecanismos dependentes da modulação do glutationo reduzido (GSH), nomeadamente da butionina sulfoximina (BSO), um inibidor da síntese de GSH, do GSH-monoetil estér (GSH-EE), um composto permeável nas células e que é intra-celularmente hidrolisado a GSH e ainda do GSH adicionado exogenamente ao meio de cultura, em células V79. Os resultados obtidos reforçaram o papel da modulação do GSH nos efeitos de citotoxicidade e clastogenicidade da AA. Para além dos estudos efetuados com células V79, procedeu-se também à determinação da frequência de SCEs, à quantificação de aductos específicos de DNA, bem como ao ensaio do cometa alcalino em amostras de dadores saudáveis expostos à AA e GA. Tanto os resultados obtidos através do ensaio das SCE, como pela quantificação de aductos específicos de DNA, ambos efectuados em linfócitos estimulados, originaram resultados comparáveis aos obtidos anteriormente para as células V79, reforçando a ideia de que a GA é bastante mais genotóxica do que a AA. Por outro lado, os resultados obtidos pelo ensaio do cometa para exposição à AA e GA mostraram que apenas esta última aumenta o nível das lesões de DNA. Outro objectivo deste trabalho, foi a identificação de possíveis associações existentes entre as lesões de DNA, quantificadas através do ensaio das SCEs e do cometa, e biomarcadores de susceptibilidade, tendo em conta os polimorfismos genéticos individuais envolvidos na destoxificação e nas vias de reparação do DNA (BER, NER, HRR e NHEJ) em linfócitos expostos à GA. Tal permitiu identificar associações entre os níveis de lesão de DNA determinados através do ensaio das SCEs, e os polimorfismos genéticos estudados, apontando para uma possível associação entre o GSTP1 (Ile105Val) e GSTA2 (Glu210Ala) e a frequência de SCEs. Por outro lado, os resultados obtidos através do ensaio do cometa sugerem uma associação entre as lesões de DNA e polimorfismos da via BER (MUTYH Gln335His e XRCC1 Gln39Arg) e da via NER (XPC Ala499val e Lys939Gln), considerando os genes isoladamente ou combinados. Estes estudos contribuem para um melhor entendimento da genotoxicidade e carcinogenicidade da AA e GA em células de mamífero, bem como da variabilidade da susceptibilidade individual na destoxificação e reparação de lesões de DNA provocadas pela exposição a estes xenobióticos alimentares. ----------- ABSTRACT:Acrylamide (AA) has been classified as a probable human carcinogen by IARC. Besides being used in numerous industrial applications, AA is also present in a variety of starchy cooked foods. This AA exposure scenario raised concerns about risk in human health and suggests that the oral consumption of AA is an additional risk factor for cancer. A considerable number of findings strongly suggest that the reactive metabolite glycidamide (GA), an epoxide generated presumably by cytochrome P450 2E1, plays a central role in AA carcinogenesis. Until now there are a scarcity of results concerning the mechanisms of genotoxicity of AA and GA in mammalian cells. In view of that, the study described in this thesis aims to unveil the genetic consequences of AA and GA exposure using mammalian cells as a model system. With this aim we evaluated the cytotoxicity of AA and GA using the MTT assay and subsequently performed two cytogenetic end-points: chromosomal aberrations (CAs) and sister chromatid exchanges (SCEs), in order to evaluate DNA damage induced by these compounds in V79 Chinese hamster cell line. The results showed that GA was more cytotoxic and clastogenic than AA. Within the scope of this thesis the quantification of specific DNA adducts were also performed, namely N7-(2-carbamoyl-2-hydroxyethyl)guanine (N7-GA-Gua) and N3-(2-carbamoyl-2-hydroxyethyl)adenine (N3-GA-Ade). Interestingly, the GA concentration and the levels of N7-GA-Gua presented a linear dose-response relationship. Further, a very good correlation between the levels of N7-GA-Gua and the extent of SCEs were observed. In order to understand the mechanisms of AA-induced toxicity, the modulation of reduced glutathione (GSH)-dependent mechanisms were studied, namely the evaluation of the effect of buthionine sulfoximine (BSO), an effective inhibitor of GSH synthesis, of GSH-monoethyl ester (GSH-EE), a cell permeable compound that is intracellularly hydrolysed to GSH and also of GSH endogenously added to culture medium,z in V79 cell line. The overall results reinforced the role of GSH in the modulation of the cytotoxic and clastogenic effects induced by AA.Complementary to the studies performed in V79 cells, SCEs, specific DNA-adducts and alkaline comet assay in lymphocytes from healthy donors exposed to AA and GA were also evaluated. Both, the frequency of SCE and the quantification of specific GA DNA adducts, produced comparable results with those obtained in V79 cell line, reinforcing the idea that GA is far more genotoxic than AA. Further, the DNA damaging potential of AA and GA in whole blood leukocytes evaluated by the alkaline comet assay, showed that GA, but not AA, increases DNA damage. Additionally, this study aimed to identify associations between DNA damage and biomarkers of susceptibility, concerning individual genetic polymorphisms involved in detoxification and DNA repair pathways (BER, NER, HRR and NHEJ) on the GA-induced genotoxicity assessed by the SCE assay and by the alkaline comet assay. The extent of DNA damage determined by the levels of SCEs induced by GA seems to be modulated by GSTP1 (Ile105Val) and GSTA2 (Glu210Ala) genotypes. Moreover, the results obtained from the comet assay suggested associations between DNA damage and polymorphisms of BER (MUTYH Gln335His and XRCC1 Gln399Arg) and NER (XPC Ala499Val and Lys939Gln) genes, either alone or in combination. The overall results from this study contribute to a better understanding of the genotoxicity and carcinogenicity of AA and GA in mammalian cells, as well as the knowledge about the variability in individual susceptibility involved in detoxification and repair of DNA damage due to these dietary xenobiotics.

Analysis of the progress of lifelong learning strategies of Portuguese Economics and Management Schools

A Work Project, presented as part of the requirements for the Award of a Masters Degree in Management from the NOVA – School of Business and Economics

Genetic and functional analysis of the bacillus subtilis BSP1 gam cluster

Mannans (linear mannan, glucomannan, galactomannan and galactoglucomannan) are the major constituents of the hemicellulose fraction in softwoods and show great importance as a renewable resource for fuel or feedstock applications. As complex polysaccharides, mannans can only be degraded through a synergistic action of different mannan-degrading enzymes, mannanases. Microbial mannanases are mainly extracellular enzymes that can act in wide range of pH and temperature, contributing to pulp and paper, pharmaceutical, food and feed, oil and textile successful industrial applications. Knowing and controlling these microbial mannan-degrading enzymes are essential to take advantage of their great biotechnological potential. The genome of the laboratory 168 strain of Bacillus subtilis carries genes gmuA-G dedicated to the degradation and utilization of glucomannan, including an extracellular -mannanase. Recently, the genome sequence of an undomesticated strain of B. subtilis, BSP1, was determined. In BSP1, the gmuA-G operon is maintained, interestingly, however, a second cluster of genes was found (gam cluster), which comprise a second putative extracellular β-mannanase, and most likely specify a system for the degradation and utilization of a different mannan polymer, galactoglucomannan. The genetic organization and function of the gam cluster, and whether its presence in BSP1 strain results in new hemicellulolytic capabilities, compared to those of the laboratory strain, was address in this work. In silico and in vivo mRNA analyses performed in this study revealed that the gam cluster, comprising nine genes, is organized and expressed in at least six different transcriptional units. Furthermore, cloning, expression, and production of Bbsp2923 in Escherichia coli was achieved and preliminary characterization shows that the enzyme is indeed a β-mannanase. Finally, the high hemicellulolytic capacity of the undomesticated B. subtilis BSP1, demonstrated in this work by qualitative analyses, suggests potential to be used in the food and feed industries.

Wound Healing: a genetic approach in Drosophila

The wound healing response is an essential mechanism to maintain the integrity of epithelia and protect all organisms from the surrounding milieu. In the “purse-string” mechanism of wound closure, an injured epithelial sheet cinches its hole closed via an intercellular contractile actomyosin cable.(...)

Unraveling maternal and fetal genetic factors protecting from Pregnancy Associated Malaria in the mouse

Malaria is one of the most devastating diseases in the world. In Plasmodium endemic regions, pregnant women are among the most vulnerable groups. Pregnancy Associated Malaria (PAM) threatens both maternal and foetal lives. Despite differences between human and mouse placentas PAM mouse models recapitulate key pathological features of human PAM. Here we describe new PAM models of mid gestation infection in the C57BL/6 mouse.(...)

Host genetic factors in mouse malaria liver stage infection

Fundação para a Ciência e a Tecnologia

Implementation progress of mental health services in Rwanda: Bugesera district case

RESUMO: O Ministério da Saúde do Governo do Ruanda identifica a saúde mental como uma área de prioridade estratégica para a intervenção em resposta à alta carga dos transtornos mentais no Ruanda. Ao longo dos últimos 20 anos após o genocídio, o sector público reconstruiu sua Resposta Nacional de Saúde Mental com base no acesso equitativo aos cuidados, através do desenvolvimento de uma Política Nacional de Saúde Mental e novas estruturas de saúde mental. A política de Saúde Mental do Ruanda, revista em 2010, prima pela descentralização e integração dos serviços de saúde mental em todas as estruturas nacionais do sistema de saúde e ao nível da comunidade. O presente estudo de caso tem como objetivo avaliar a situação do sistema de saúde mental de um distrito típico de uma área rural no Ruanda, e sugerir melhorias, incluindo algumas estratégias para monitoras as mudanças. Os resultados do estudo permitirão ao Ruanda reforçar a sua capacidade para implementar o Plano Nacional de Saúde Mental ao nível dos distritos. O relatório também será útil para monitorar o progresso da implementação de serviços de saúde mental nos distritos, incluindo a prestação de serviços de base comunitária e a participação dos usuários, suas famílias e outros interessados na promoção, prevenção, assistência e reabilitação em saúde mental. Este estudo também procurou avaliar o progresso da implementação dos cuidados de saúde mental a nível descentralizado, com vista a compreender as implicações em termos de recursos desses processos. Foi realizada uma análise situacional num local do distrito, baseado em entrevistas com as principais partes interessadas responsáveis, usando o Instrumento de Avaliação de Sistemas de Saúde Mental da Organização Mundial da Saúde (WHO-AIMS). Os resultados sugerem que os recursos humanos para a saúde mental e serviços de base comunitária de saúde mental no distrito continuam a ser extremamente limitados. Os profissionais de saúde mental são adicionalmente limitados na sua capacidade para oferecer intervenções de emergência a pacientes psiquiátricos e garantir a continuidade do tratamento farmacológico a pacientes com condições crônicas. Para planejar efetivamente, de acordo com as necessidades da comunidade, sugerimos que o sistema de saúde mental deve envolver também os representantes das famílias e dos usuários no processo de planificação de modo a melhorar a sua contribuição no processo de implementação das atividades de saúde mental. Este estudo de caso do Distrito de Bugesera oferece a primeira análise de nível distrital dos serviços de saúde mental no Ruanda, e pode servir como uma mais-valia para a melhoria do sistema de saúde mental, incluindo a advocacia para a melhoria da qualidade dos cuidados de saúde mental a este nível, aumentando o financiamento para a implementação de serviços clínicos de saúde mental e os recursos humanos disponíveis para a prestação de cuidados de saúde mental, principalmente a nível dos cuidados primários.--------------------- ABSTRACT: To deal with the high burden of mental health disorders resulting from consequences of the 1994 genocide against Tutsis, the Rwanda Ministry of Health (MoH) considers mental health as a priority intervention. For the last 20 years, Ministry of Health focused on rebuilding a national and equity-oriented mental health program responding to the population needs in mental health. Mental health services are now decentralized and integrated in the national health system, from the community level up to the referral level. This study assessed the situation of mental health services in one rural district in Rwanda. It was aimed at assessing the progress of implementation of mental health care at the decentralized level, focusing on resource implications and processes. This study is based on interviews conducted with key stakeholders, using the World Health Organization's Assessment Instrument for Mental Health Systems (WHO-AIMS). Findings show that human resources for mental health care and community-based mental health services of the assessed district remain extremely limited. Mental health professionals face limitation regarding the ability to provide emergency management of psychiatric patients and to ensure continuity of psychopharmacological treatment of patients with chronic conditions. To improve the implementation process of mental health interventions and activities, a planning process based on community needs and the involvement of representatives of families and users in planning process should be considered. The Bugesera case study on the situation of mental health services can serve as a baseline for improvement of the mental health program in Rwanda, in terms of quality care services, infrastructure and equipment, human and financial resources.

Cerebral vasculopathy in children with sickle cell disease A study of genetic modulators of the disease

Sickle cell disease (SCD) is a genetic disorder with recessive transmission, caused by the mutation HBB:c.20A>T. It originates hemoglobin S that forms polymers inside the erythrocyte, upon deoxygenation, deforming it and ultimately leading to premature hemolysis. The disease presents with high heterogeneity of clinical manifestations, the most devastating of which, ischemic stroke, occurs in 11% of patients until 20 years of age. In this study, we tried to identify genetic modifiers of risk and episodes of stroke by studying 66 children with SCD, grouped according to the degree of cerebral vasculopathy (Stroke, Risk and Control). Association studies were performed between the three phenotypic groups and hematological and biochemical parameters of patients, as well as with 23 polymorphic regions in genes related to vascular cell adhesion (VCAM-1, THBS-1 and CD36), vascular tonus (NOS3 and ET-1) and inflammation (TNF-α and HMOX-1). Relevant data was collected from patient’s medical records. Known genetic modulators of SCD (beta-globin cluster haplotype and HBA and BCL11A genotypes) and putative genetic modifiers of cerebral vasculopathy were characterized. Differences in their distribution among groups were assessed. VCAM-1 rs1409419 allele C and NOS3 rs207044 allele C were associated to stroke events, while VCAM-1 rs1409419 allele T was found to be protective. Alleles 4a and 4b of NOS3 27 bp VNTR appeared to be respectively associated to stroke risk and protection. HMOX-1 longer STRs seemed to predispose to stroke. Higher hemoglobin F levels were found in Control group, as a result of Senegal haplotype or of BCL11A rs11886868 allele T, and higher lactate dehydrogenase levels, marker of hemolysis, were found in Risk group. Molecular mechanisms underlying the modifier functions of the relevant genetic variants are discussed.

Genetic algorithm for shipping route estimation with long-range tracking data : automatic reconstruction of shipping routes based on the historical ship positions for maritime safety applications

Ship tracking systems allow Maritime Organizations that are concerned with the Safety at Sea to obtain information on the current location and route of merchant vessels. Thanks to Space technology in recent years the geographical coverage of the ship tracking platforms has increased significantly, from radar based near-shore traffic monitoring towards a worldwide picture of the maritime traffic situation. The long-range tracking systems currently in operations allow the storage of ship position data over many years: a valuable source of knowledge about the shipping routes between different ocean regions. The outcome of this Master project is a software prototype for the estimation of the most operated shipping route between any two geographical locations. The analysis is based on the historical ship positions acquired with long-range tracking systems. The proposed approach makes use of a Genetic Algorithm applied on a training set of relevant ship positions extracted from the long-term storage tracking database of the European Maritime Safety Agency (EMSA). The analysis of some representative shipping routes is presented and the quality of the results and their operational applications are assessed by a Maritime Safety expert.

Implementação de um modelo de geometric semantic genetic programming para aplicação naval

Recaí sob a responsabilidade da Marinha Portuguesa a gestão da Zona Económica Exclusiva de Portugal, assegurando a sua segurança da mesma face a atividades criminosas. Para auxiliar a tarefa, é utilizado o sistema Oversee, utilizado para monitorizar a posição de todas as embarcações presentes na área afeta, permitindo a rápida intervenção da Marinha Portuguesa quando e onde necessário. No entanto, o sistema necessita de transmissões periódicas constantes originadas nas embarcações para operar corretamente – casos as transmissões sejam interrompidas, deliberada ou acidentalmente, o sistema deixa de conseguir localizar embarcações, dificultando a intervenção da Marinha. A fim de colmatar esta falha, é proposto adicionar ao sistema Oversee a capacidade de prever as posições futuras de uma embarcação com base no seu trajeto até à cessação das transmissões. Tendo em conta os grandes volumes de dados gerados pelo sistema (históricos de posições), a área de Inteligência Artificial apresenta uma possível solução para este problema. Atendendo às necessidades de resposta rápida do problema abordado, o algoritmo de Geometric Semantic Genetic Programming baseado em referências de Vanneschi et al. apresenta-se como uma possível solução, tendo já produzido bons resultados em problemas semelhantes. O presente trabalho de tese pretende integrar o algoritmo de Geometric Semantic Genetic Programming desenvolvido com o sistema Oversee, a fim de lhe conceder capacidades preditivas. Adicionalmente, será realizado um processo de análise de desempenho a fim de determinar qual a ideal parametrização do algoritmo. Pretende-se com esta tese fornecer à Marinha Portuguesa uma ferramenta capaz de auxiliar o controlo da Zona Económica Exclusiva Portuguesa, permitindo a correta intervenção da Marinha em casos onde o atual sistema não conseguiria determinar a correta posição da embarcação em questão.