Desenvolvimento de um ensaio de hibridação múltipla (MHA-MULTIPLE REGION HYBRIDIZATION ASSAY) para identificação presumível de vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 (HIV-1) dos subtipos B, G e de formas recombinantes CRF14_BG e CRF02_AG circulantes em Portugal

A maioria dos métodos utilizados na caracterização genética do HIV-1 baseia-se na análise de regiões específicas do genoma viral, fornecendo informação parcial sobre o mesmo e, por consequência, revelando-se inadequados para a identificação de vírus recombinantes. O único método que permite uma caracterização integral do genoma viral passa pela sua sequenciação completa. No entanto, este é um método dispendioso, laborioso e de difícil implementação quando se pretende a análise de elevados números de amostras. Como alternativa a este último, o conjunto de métodos genericamente designados de MHA (Multiple Region Hybridization Assay) baseiam-se na amplificação, por PCR em tempo-real, de várias regiões ao longo do genoma viral e na sua caracterização com sondas específicas (TaqMan). Tendo este modelo por base, o objectivo deste estudo foi o desenvolvimento de um ensaio de hibridação múltipla (MHABG0214) passível de ser aplicado ao estudo de um elevado número de amostras. Este método foi desenvolvido tendo como objectivo a genotipagem as estirpes circulantes dominantes na epidemia Portuguesa, nomeadamente os subtipos B, G e formas genéticas recombinantes CRF02_AG e CRF14_BG. Com base em alinhamentos de sequências de referência de genoma completo, delinearam-se primers universais e subtipo-específicos para a amplificação de diversas regiões codificantes distribuídas ao longo do genoma do HIV-1 (Gag, Protease, Transcriptase Reversa, Integrase, Rev, Gp120 e Gp41). A optimização foi efectuada, inicialmente, para um conjunto de amostras de referência e seguidamente avaliada num conjunto de 50 amostras clínicas. O MHABG0214 foi implementado numa estratégia de PCR em tempo-real, numa detecção dependente de SYBR® Green I para todas as regiões ou, como alternativa, usando sondas TaqMan (Gp41). Apresentamos ainda uma estratégia em que a análise de resultados se baseia, simplesmente, numa abordagem usando PCR/gel de agarose convencional. Estas abordagens constituem ferramentas úteis na identificação das estirpes de HIV-1 em Portugal.

Caracterização e diagnóstico do centro histórico de Ourém

Relatório de Estágio apresentado para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Gestão do Território, especialização em Planeamento e Ordenamento do Território

Expressão e purificação da proteína E3 do vírus chikungunya (CHIKV)

RESUMO: O vírus chikungunya (CHIKV) é um vírus de RNA, com invólucro, da família Togaviridae, transmitido por mosquitos Aedes spp. Distribuído por largas regiões de África e Ásia, causa grandes epidemias de artrite grave. A semelhança de sintomas com outras doenças como a dengue e a malária e a persistência de IgM específicas, dificultam o diagnóstico da infeção por CHIKV. A deteção no sangue de E3, uma glicoproteína viral secretada, a incluir num ensaio imunoenzimático poderá melhorar o diagnóstico nos países onde as técnicas de biologia molecular são de difícil acesso. Para testar a utilidade de E3 num ensaio de diagnóstico, esta deverá ser expressa em quantidade, purificada e usada para produção de anticorpos específicos. Para expressar E3 numa forma solúvel, suscetível de ser purificada num único passo cromatográfico sem proteases, recorreu-se à estratégia da fusão com o domínio de ligação à quitina (CBD)-inteína (IMPACT™ System, NEB). A sequência codificadora de E3 foi amplificada a partir de RNA viral, clonada em pTYB21 e expressa em E. coli como uma proteína de fusão insolúvel de 64 kDa. A expressão a 12ºC induzida por IPTG 0,1 mM aumentou a solubilidade de CBD-inteína-E3. A aplicação de lisados celulares em colunas de quitina originou a retenção de CBD-inteína-E3 na matriz. Porém, a autoclivagem da inteína na coluna, induzida com reagentes tiol, foi pouco eficiente e mesmo a proteína E3 separada não eluiu da coluna. E3 foi ainda expressa em E. coli com uma cauda de seis histidinas (E3[His]6) por clonagem no vetor pET28b(+). Lisados celulares aplicados em colunas de níquel permitiram a eluição de uma proteína de 9 kDa, compatível com a massa molecular estimada para E3[His]6, ainda que com outros contaminantes proteicos. A identidade da proteína de 9 kDa será confirmada pela indução de anticorpos com esta preparação e reatividade daqueles com células infetadas com CHIKV.----------------ABSTRACT: Chikungunya virus (CHIKV) is an enveloped, positive strand RNA virus belonging to the family Togaviridae. Transmitted by Aedes spp mosquitoes, CHIKV causes large epidemics of severe arthritogenic disease in Africa and Asia and represents a serious threat in countries where vectors are present. Symptoms similarity with other diseases, e.g. dengue and malaria, along with CHIKV IgM persistence turns accurate CHIKV diagnosis a difficult task in low-income countries. Detection of E3, a small secreted viral glycoprotein, to be included in an immunoenzymatic test was envisaged as a possible improvement in CHIKV diagnosis. To test the diagnostic value of E3, recombinant E3 should be expressed and purified to generate antibodies. In order to express CHIKV E3 in a soluble form amenable to purification by a single step affinity chromatography, the chitin binding domain (CBD)-intein fusion strategy without proteases (IMPACT™ System, NEB) was employed. The E3 coding sequence was amplified from viral RNA, cloned in pTYB21 and expressed in E. coli ER2566 as an insoluble 64 kDa CBD-intein-E3 fusion protein. Solubility was partially achieved by lowering the expression temperature to 12ºC and the inducer (IPTG) concentration to 0.1 mM. Clarified cell lysate loaded onto a chitin column allowed ligation of the fusion protein but the intein-mediated cleavage efficiency was low and E3 failed to elute from the column as demonstrated by SDS-PAGE. E3 was further expressed with a six histidine tag, E3[His]6, employing the pET System (Novagen). E3[His]6 was expressed in E. coli Rosetta (30ºC, 0.4 mM IPTG) as a 9 kDa protein. Soluble cell extracts in 20-40 mM imidazole, applied onto a nickel column and eluted with 500 mM imidazole yielded a protein preparation enriched in the 9kDa protein. The 9 kDa will be used as antigen to generate antibodies that upon reaction with CHIKV infected cells will confirm its identity.

Seroprevalência e subtipos do vírus da hepatite C circulantes em indivíduos co-infectados com o vírus da imunodeficiência humana

Mundialmente, estima-se que 40 milhões de pessoas estejam infectadas com VIH, 5 milhões das quais cronicamente infectadas com VHC. A co-infecção com VIH aumenta a taxa de persistência do VHC, acelera a velocidade de progressão da doença hepática e reduz significativamente a resposta à terapia do VHC. O VHC possui extensa diversidade genética, sendo classificado em seis genótipos e cerca de 90 subtipos com padrões epidemiológicos e resposta à terapia distintos. Tendo isto presente e devido a serem limitados os dados relativos aos genótipos e subtipos do VHC circulantes em Portugal e ainda ao facto de os utilizadores de drogas injectáveis (UDIs) serem um grupo de risco importante para a co-infecção por VIH e VHC, realizámos um estudo retrospectivo para determinar a prevalência da infecção por VHC e a distribuição de subtipos deste vírus num grupo de UDIs infectados com VIH. Amostras de plasma de 66 indivíduos (1998-2001) foram testadas para anticorpos anti-VHC (ensaio imunoenzimático) e RNA do VHC (amplificação da 5’UTR por RT-PCR). Para identificar os subtipos de VHC e detectar recombinantes, as amostras com RNA viral detectável foram sujeitas a amplificação, sequenciação e análise filogenética de sequências nucleotídicas parciais para C/E1 e NS5B. Encontrámos que 86,4% dos indivíduos possuíam anticorpos anti-VHC, 93,0% dos quais com infecção activa. Todas as amostras, exceptuando duas, com RNA viral detectável originaram amplicões para C/E1 e NS5B. A análise filogenética permitiu incluir as estirpes de VHC nos subtipos 1a (43,8%), 1b (3,6%), 2a (1,8%), 3a (21,1%), 4a (8,8%) e 4d (15,8%), revelando um padrão epidemiológico semelhante ao dos UDIs de outros países do Sul da Europa. Apenas uma amostra apresentou discordância entre os subtipos das duas regiões (4d para C/E1 e 4a para NS5B) sugerindo um potencial recombinante intragenótipo. No total, os subtipos 1a, 4a e 4d do VHC são responsáveis por 68,4% das infecções nos UDIs infectados com VIH analisados. Considerando que apenas 20-30% dos doentes positivos para VIH e co-infectados com os genótipos 1 e 4 respondem à terapia do VHC e que ocorre transmissão do VHC dos UDIs para a população em geral, são prioritários estudos alargados de vigilância epidemiológica e implementação de estratégias de prevenção para controlar ambos os vírus neste grupo de risco.

Avaliação económica da vacinação contra o vírus do papiloma humano 16 e 18 (CERVARIX®) : análise de custo-utilidade e custo-efetividade em mulheres dos 26 aos 55 anos em Portugal

RESUMO - O cancro do colo útero representa um importante problema de saúde pública em Portugal: é o terceiro cancro mais frequente nas mulheres entre os 15 e os 44 anos, originando a morte de 346 mulheres anualmente. Contudo, esta patologia é altamente evitável, nomeadamente, através da imunização contra a infeção HPV, que é a causa necessária para o desenvolvimento do cancro. A elevada prevalência da infeção em mulheres mais velhas sugere que a vacinação poderá ser uma estratégia custo-efetiva mesmo numa faixa etária superior. Para que seja racionalmente ponderada a comparticipação da vacina nestas mulheres é necessária a realização de um estudo fármaco-económico que comprove o custo-efetividade desta intervenção, já que o seu financiamento atual prevê apenas as mulheres não abrangidas pelo Programa Nacional de Vacinação, dos 18 aos 25 anos. Os objetivos do trabalho são realizar uma revisão da literatura sobre estudos de avaliação económica relativos à prevenção do CCU e avaliar a relação de custo-efetividade de vacinar mulheres contra o HPV entre os 26 e os 55 anos em comparação com a prática clínica corrente, em Portugal. É utilizado o Modelo Global Cervarix® e realiza-se uma análise de custo-utilidade e de custo-efetividade. Os resultados demonstraram que a vacinação em mulheres dos 26 aos 45 anos poderá ser uma opção custo-efetiva, permitindo um aumento de anos de vida, uma diminuição dos casos e mortes por CCU e um incremento de QALYs. O RCEI variou entre 7.914€/QALY e 29.049€/QALY com a vacinação aos 26 e aos 45 anos, respetivamente, para a alternativa de vacinação mais rastreio versus a situação atual de rastreio organizado e oportunístico, em Portugal.

Avaliação e seleção nos arquivos fotográficos digitais: o caso do Arquivo Histórico Parlamentar

Dissertação apresentada para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Ciências da Informação e Documentação – Área de especialização em arquivística

O povoado Pré-Histórico do Penedo da Cortegaça, Sintra

Dissertação apresentada para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção grau de Mestre em Arqueologia

Património industrial e turismo cultural: contributo para a criação de um itinerário turístico no Centro Histórico de Lisboa

Trabalho de Projecto apresentado para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Práticas Culturais para os Municípios

Representar a História: potencial e limites do documentário histórico na divulgação do passado

Tese apresentada para cumprimento dos requisitos necessários á obtenção do grau de Doutor em História, especialidade História Contemporânea

Infecção activa pelo vírus citomegálico humano em doentes internados com sépsis numa unidade de cuidados intensivos

Dissertação para obtenção de Grau de Mestre em Microbiologia Médica pela Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa

Cidade Guiada. Turismo e nobilitação urbana no centro histórico de Lisboa

No contexto europeu de revalorização dos centros históricos das cidades, Lisboa parece também adoptar estratégias que visam desenvolver o potencial económico da sua cidade interior. No entanto, enquanto no resto da Europa se opta por estratégias de nobilitação urbana que visam deslocar a elite cultural local para os centros históricos da cidade, de forma a revalorizá-los, Lisboa parece apostar na importação de uma elite cultural internacional para desenvolver esse processo de nobilitação. Como tal, no coração de Lisboa, prolifera uma indústria turística cada vez mais especializada, que se vai apropriando do espaço urbano, contribuindo para a transformação da paisagem social e humana da cidade. É neste contexto político e de transformação da cidade que o filme “Cidade Guiada” foi sendo construído. O filme narra assim a história de dois guias de turismo alternativo, Mara e Paulo, acompanhando os seus passeios pelo centro histórico da cidade de Lisboa, entre os bairros da Graça, Alfama e Mouraria. Nos bastidores das visitas guiadas, as duas personagens principais vão também expressando o seu olhar particular e crítico sobre o desenvolvimento do turismo em Lisboa e sobre as actuais dinâmicas de revalorização do centro da cidade, reconhecendo o turismo como um dos principais recursos adoptados para dinamizar a economia na cidade: “Enquanto outros países têm outras coisas a vender, Portugal vende as suas cidades.”

Infeção pelo vírus do herpes humano 6 na convulsão febril

Poster apresentado no IV Congresso Nacional de Virologia – VIII Encontro da Sociedade Portuguesa de Virologia, no Laboratório Nacional de Engenharia Civil, Lisboa, nos dias 25 e 26 de Outubro de 2013.

De Cabo Verde para Lisboa: Cartas e remessas científicas da expedição naturalista de João da Silva Feijó (1783-1796). Vol. I - Documentação do Arquivo Histórico Ultramarino

Transcrição dos documentos relativos à expedição naturalista de João da Silva Feijó a Cabo Verde (1783-96), existentes no Arquivo Histórico Ultramarino e respetivo enquadramento histórico

De Cabo Verde para Lisboa: Cartas e Remessas Científicas da Expedição de João da Silva Feijó (1783-1796). Vol. II – Documentação da Biblioteca Nacional de Portugal e do Arquivo Histórico do Museu Nacional de História Natural e da Ciência da Universidade de Lisboa

Revisão botânica das tabelas de plantas, em Fevereiro de 2015, por Maria Cristina Duarte

As literaturas contemporâneas espanhola e portuguesa como espaços culturais de memória histórico-política

Nesta dissertação analisamos a forma como quatro obras literárias contemporâneas se podem constituir como espaço cultural de memória histórico-política das décadas que em Portugal e Espanha se seguiram à implantação dos regimes democráticos. O trabalho incide na análise de Os Memoráveis, de Lídia Jorge, Novembro, de Jaime Nogueira Pinto, Las leyes de la frontera, de Javier Cercas, e Romanticismo, de Manuel Longares. Procede-se à análise comparativa dos quatro romances e à forma como cada um problematiza dois períodos fundamentais da história recente dos dois países. São também tratadas as questões relacionadas com o diálogo entre o conhecimento histórico e literário, o lado fictício e imaginário da história e a contribuição da memória para a reconstrução dos processos históricos. Procura-se também entender de que forma a literatura se constitui como uma forma de reflexão catártica e crítica, como suscita a problematização do momento presente, e que marcas pessoais e/ou autobiográficas os autores deixam transparecer nas suas obras.