Imunohistoquímica no diagnóstico da glomerulonefrite membranosa: estudo comparativo de binómios cromogênio + coloração de contraste

A glomerulonefrite membranosa faz parte das doenças glomerulares que provocam glomerulonefrite crônica, apresentando-se como uma das causas da doença renal terminal. As técnicas de imunofluorescência são o gold standard no estudo imunológico desta patologia em biópsia renal, através da deteção de imunocomplexos (e.g. IgG e C3) e do seu padrão de distribuição granular característico. No entanto, a imunofluorescência não permite uma contextualização histológica e os fluorocromos utilizados possuem um reduzido tempo de atividade, ao contrário das técnicas imunoenzimáticas que utilizam cromogénios coloridos precipitados que permitem a obtenção de uma marcação permanente e a sua contextualização histológica por via da utilização de eficientes colorações de contraste. Com a finalidade de contribuir para a qualidade do diagnóstico da glomerulonefrite membranosa, em biópsias renais, procurou-se, com esta pesquisa, identificar uma técnica imunoenzimática, através da conjugação entre diferentes cromogênios e colorações de contraste, que permita a deteção de depósitos de IgG e C3, com padrão granular. Foram constituídos diferentes binômios cromogênio + coloração, com os cromogênios 3,3›- Diaminobenzidine Tetrahydrochloride e 3-Amino-9-ethylcarbazole e as colorações Periodic Acid Schiff, Periodic Acid Methenamine Silver e Hematoxilina. Foram utilizadas 72 secções de tecido provenientes de seis de casos de biópsias renais com diagnóstico de glomerulonefrite membranosa, fixados em formalina a 10% e incluídos em parafina. A recolha de dados foi realizada por observação microscópica com preenchimento de uma grelha de classificação dos parâmetros: preservação da morfologia, intensidade da marcação específica, quantidade relativa de estruturas marcadas, marcação inespecífica/fundo, contraste e padrão da marcação, que permitiu a classificação dos binómios estudados num score quantitativo de 0-100 pontos. O binômio que apresentou melhores resultados foi 3-Amino-9-ethylcarbazole + Hematoxilina (score 71,81) e o binômio 3,3›- Diaminobenzidine Tetrahydrochloride+Periodic Acid Methenamine Silver (score 7,81), apresentou os piores resultados. O resultado do teste Kruskal-Wallis indica-nos a presença de diferenças estatísticas entre os binómios em estudo (p=0,000). A Hematoxilina pode ser considerada a coloração mais eficaz, pois cumpriu a sua função de auxiliar e facilitar a observação do tipo de padrão com os dois cromogênios utilizados. O cromogênio 3-Amino-9-ethylcarbazole apresentou resultados semelhantes aos produzidos pelo 3,3›-Diaminobenzidine Tetrahydrochloride, no entanto, permitiu identificar em todos os casos o padrão granular de imunomarcação, ao contrário do que aconteceu com este último.

Coloração de May-Grünwald Giemsa em amostras de secreções brônquicas processadas em ThinPrep®: comparação de três métodos de pós-processamento

O processamento de amostras citológicas em meio líquido e a coloração de May-Grünwald Giemsa (MGG) fazem parte da rotina em anatomia patológica. Na origem desta investigação esteve a possibilidade do uso desta coloração em amostras processadas em ThinPrep (TP). Estudou-se a fase compreendida entre o processamento de amostras em TP e a coloração com MGG – pós-processamento. O objetivo do estudo consistiu em avaliar diferentes métodos de pós-processamento em amostras de secreções brônquicas processadas pela metodologia TP e coradas com MGG. Utilizaram-se 32 amostras de secreções brônquicas, processadas em TP. De cada amostra obtiveram-se três lâminas, nas quais se aplicaram três métodos de pós-processamento: secagem ao ar; imersão em solução salina de tampão Tris; imersão em etanol a 96%. Realizou-se a coloração de MGG e as lâminas foram avaliadas por três avaliadores independentes, relativamente à constituição da amostra e qualidade da coloração. Este último parâmetro resultou da soma da pontuação obtida para os detalhes nuclear e citoplasmático (escala de 0 a 4 valores). Aplicaram-se os testes estatísticos One-Way ANOVA (p=0,05) e de Tukey. Para a qualidade de coloração, os métodos imersão em solução tampão, imersão em etanol a 96% e secagem ao ar obtiveram a pontuação média de 2,39 (s=1,309), 2,15 (s=1,248) e 1,22 (s=1,250), respetivamente. Verificou-se que existia diferença estatisticamente significativa entre o método secagem ao ar e os métodos imersão em solução tampão e em etanol a 96% (p=,000). O pós-processamento por secagem ao ar demonstrou qualidade da coloração não aceitável, ou seja pontuação média inferior a 2 valores. Pelo contrário, os pós-processamentos por imersão em solução tampão e em etanol a 96% apresentaram qualidade de coloração aceitável, podendo ser utilizados na rotina laboratorial para coloração com MGG de amostras processadas em TP.

Amostras secas ao ar para coloração de Papanicolaou: comparação de três métodos de reidratação

O processamento de líquidos das cavidades serosas por citocentrifugação e a coloração de Papanicolaou são utilizados rotineiramente em citopatologia. A realização desta coloração em amostras secas ao ar pode constituir uma mais-valia quando o local de colheita é distante do laboratório e o processo de fixação não é totalmente padronizado/controlado. Assim, decidiu-se estudar protocolos que implicam a secagem ao ar e posterior reidratação, para realização de coloração de Papanicolaou.

Influência da longevidade da solução de Verhoeff na intensidade/especificidade das fibras elásticas, em material biológico de origem suína

As fibras elásticas são responsáveis pela elasticidade e flexibilidade dos tecidos. A técnica de Verhoeff é o método mais utilizado para demonstrar a presença destas fibras, corando-as de preto. A solução de Verhoeff é exclusivamente utilizada de um modo extemporâneo, no entanto, pela revisão da literatura verificou-se que a mesma poderia ter uma maior durabilidade. O presente estudo tem como principal objectivo determinar a longevidade da solução de Verhoeff. Utilizou-se material biológico de origem suína,fixado em formol neutro tamponado a 10% e incluído em parafina. Foi avaliado um total de 33 lâminas segundo critérios de intensidade e especificidade. Os resultados obtidos provam que o tempo tem influência sobre a referida solução, levando à perda de intensidade de coloração, não se tendo registado alterações significativas a nível de especificidade. Concluiu-se que a solução de Verhoeff pode não ser uma solução descartável, encontrando-se em perfeitas condições de utilização até às 48h de repouso.

Longevidade da solução de Verhöeff

As fibras elásticas representam cerca de 5% do tecido conjuntivo. São constituídas por elastina e microfibrilhas sendo responsáveis pelas propriedades de flexibilidade e retracção elástica dos tecidos. A Técnica de Verhoeff é o método mais comum para demonstrar a presença de fibras elásticas, proporcionando bons resultados. Esta técnica baseia-se num método regressivo, sendo preparada apenas aquando da sua utilização. No entanto, Bancroft e Gamble indicam que resultados satisfatórios têm sido obtidos com a utilização da solução até 48 horas. Estabeleceu-se como objectivo geral comparar a solução de Verhoeff extemporânea e a solução de Verhoeff não extemporânea, verificando a posteriori se ambas permitem obter resultados satisfatórios similares. Definindo-se especificamente: determinar a influência do tempo de repouso da solução de Verhoeff não extemporânea na coloração das fibras elásticas de cortes histológicos de pele, pulmão e artéria de origem suína; analisar e comparar microscopicamente as diferenças entre a solução extemporânea de Verhoeff (lâminas controlo) e o conjunto de diferentes tempos de repouso dessa mesma solução; aferir a longevidade da solução de Verhoeff, indicar o tempo de repouso de solução de Verhoeff até ao qual esta é passível de utilização.

Comparative study of amine solutions used in CO2 absorption/desorption cycles

Trabalho Final de Mestrado para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Química

Comparação da fixação em formalina e em fixador molecular e sua influência em técnicas histoquímicas em tecido hepático

A Formalina 10% Tamponada (FNT 10%) é considerada o fixador de eleição nos Laboratórios de Anatomia Patológica. Contudo, a exposição a esta substância acarreta riscos para a saúde dos técnicos. A International Agency for Research on Cancer (IARC) classificou-a como cancerígeno humano e estudos relevam uma correlação positiva entre a exposição a formaldeído e o desenvolvimento de leucemia e leucemia mielóide. Torna-se relevante alterar o processo de fixação substituindo a FNT 10% por outros fixadores melhorando estas questões. Como tal, desenvolveram-se fixadores à base de outros compostos químicos que não formaldeído, como o Fixador Molecular Universal (UMFIX) que tem como base metanol e polietilenoglicol e que é usualmente utilizado com um processador rápido de micro-ondas. Pretende-se comparar as diferenças entre a fixação por FNT 10% e a fixação por UMFIX, em tecido hepático processado em processador rápido de micro-ondas, para as colorações de Hematoxilina-Eosina (H&E), Tricrómio de Gomori, Reticulina e PAS, através da qualidade final das lâminas testadas. A coloração de H&E foi a única que apresentou diferenças estatisticamente significativas entre os dois fixadores (p=0,032; α<0,05; Mann-Whitney). O UMFIX apresenta-se como um substituto da FNT 10% para o processamento rápido em micro-ondas, pois além de apresentar lâminas com uma qualidade final semelhante ou superior às da FNT 10%, ultrapassa os riscos referidos.

Descalcificação em microondas com ácido nítrico a 5% e RDO

A descalcificação é um processo longo que requer dias ou mesmo meses, no entanto, com o recurso a microondas (MW), este processo pode ser dimínuido. O principal objectivo desta investigação foi diminuir a duração do processo de descalcificação recorrendo à utilização de MW, mantendo a qualidade morfológica do tecido. Efectuou-se a comparação do método convencional com o protocolo com recurso a MW. Foram testadas duas soluções descalcificadoras, RDO e ácido nítrico a 5%. Testou-se a acção destes descalcificadores em osso compacto e osso esponjoso de suíno, uma vez que estes se assemelham na sua constituição histológica às amostras humanas. As amostras foram fixadas em formalina tamponada a 10%, descalcificadas, processadas e incluídas em parafina. Foram efectuados cortes em micrótomo de corrediça e corados com Hematoxilina-Eosina. As lâminas histológicas obtidas foram avaliadas por 4 observadores independentes com recurso a uma grelha de avaliação de acordo com os seguintes parâmetros: preservação tecidular, intensidade de coloração e contraste. Os resultados obtidos demonstraram não haver diferenças significativas entre os protocolos em estudo, e que a utilização de MW acelera o processo de descalcificação. Verificou-se que a descalcificação em MW de osso esponjoso com RDO (30,167) possui o score mais elevado e que o menor score foi obtido na descalcificação de rotina de osso compacto com RDO (6,750). A descalcificação em MW permite a obtenção de lâminas histológicas de qualidade comparável às obtidas com o método convencional e permite reduzir a duração do processo de descalcificação, podendo ser aplicado à rotina do laboratório de anatomia patológica.

Azul de toluidina, giemsa e violeta de cresil na evidenciação de mastócitos

Os mastócitos são células do sistema imunitário responsáveis pela defesa do organismo contra diferentes agentes agressores externos. Para além da participação em inúmeros processos fisiológicos e patológicos, os mastócitos podem ser eles próprios sede de patologias designadas de mastocitoses. Percebendo a sua importância em diversos processos e dada a necessidade da sua identificação específica para a confirmação de um diagnóstico, foram sendo apresentadas diferentes propostas para a evidenciação destas células através da coloração metacromática dos seus gânulos citoplasmáticos. Com este trabalho pretendeu-se comparar a qualidade final das lâminas histológicas coradas com azul de toluidina, giemsa e violeta de cresil na evidenciação de mastócitos, em tecidos humanos fixados em formol 10% e incluídos em parafina, determinando qual das colorações histoquímicas permite obter melhores resultados. Foram selecionados 20 blocos contendo fragmentos de tecido de diferentes órgãos humanos. De cada bloco efetuaram-se 3 cortes, um para cada coloração, num total de 60 lâminas. A avaliação da qualidade das lâminas foi realizada por 2 avaliadores independentes, através da aplicação de uma grelha de avaliação. Os dados recolhidos foram submetidos a procedimentos estatísticos para comparação da qualidade final de cada coloração. A coloração de giemsa registou o score médio mais elevado (67,3±16,2), seguida da coloração de violeta de cresil (63,9±13,2) e da coloração de azul de toluidina (63,4±17,7). No entanto, estas diferenças não foram estatisticamente significativas. Embora as diferenças registadas não fossem estatisticamente significativas, a proximidade existente entre os valores médios obtidos para cada uma das colorações permite concluir que as técnicas têm eficácia semelhante na evidenciação de mastócitos.

Detecção de H. pylori em anatomia patológica: comparação de várias técnicas histoquímicas e Imunocitoquímica

A elevada incidência e prevalência do Helicobacter pylori na população mundial representa uma preocupação emergente. É alarmante saber que esta bactéria, para além de promover estes padrões epidemiológicos, é igualmente um microorganismo altamente patogénico para os seres humanos. Este facto justifica a pertinência de estudos que visam a identificação de técnicas, no âmbito da anatomia patológica, capazes de detectarem o H. pylori de forma perceptível e fiável. Foi objectivo deste trabalho identificar qual das técnicas de detecção do H. pylori em biópsias gástricas em estudo promove o melhor qualidade de coloração/imunomarcação, permitindo a melhor identificação do microorganismo.

Optimização da técnica do tricrómio de Masson

A crescente valorização de diagnósticos diferenciais em anatomia patológica conduziu à procura recorrente das colorações especiais que podem ser uma ferramenta de baixo custo e de fácil execução. Dentro das colorações especiais, o tricrómio de Masson tem como objectivo especial evidenciar as fibras de colagénio e recorre às soluções corantes. O presente estudo pretende estudar a qualidade da coloração do tricrómio de Masson, comparando seis variações à técnica original, tendo como objectivo a identificação da variante que permite a melhor qualidade de coloração.

Examination timetabling automation using hybrid meta-heuristics

Trabalho de projeto realizado para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Informática e de Computadores

Desenvolvimento de métodos de análise físico-química em águas usando um analisador multiparamétrico AQUAKEM

Trabalho Final de mestrado para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Química e Biológica