Étude sur l’endocytose du récepteur de l’insuline : rôle du noeud de signalisation ATIC / PTPLAD1

La cellule utilise des nœuds d’interactions protéiques relativement stables, conservés et souvent constitués d’adaptateurs moléculaires pour gérer des signaux reçus (synthèse, sécrétion, traffic, métabolisme, division), des problèmes de sécurité et de niveaux d’énergie. Nos résultats montrent que la cellule utilise aussi des nœuds relativement petits et dynamiques où des informations propres concernant des voies métaboliques apparemment indépendantes sont évaluées. Ces informations y sont intégrées localement et une décision y est prise pour action immédiate. Cette idée est supportée par notre étude sur le récepteur de l’insuline (RI). Ce récepteur transmembranaire à activité tyrosine kinase reconnaît un signal externe (insuline circulante) et engage la signalisation de l’insuline, les réponses métaboliques et le contrôle du glucose circulant. Le RI est aussi impliqué dans l’internalisation de l’insuline et sa dégradation dans les endosomes (clairance). Il régule donc indirectement la sécrétion de l’insuline par les cellules du pancréas endocrine. La signification pathophysiologique de l’endocytose du RI ainsi que les bases moléculaires d’une telle coordination sont peu connues. Nous avons construit un réseau d’interactions du RI (IRGEN) à partir d’un protéome de fractions Golgi-endosomales (G/E) hépatiques. Nous démontrons une forte hétérogénéité fonctionnelle autour du RI avec la présence des protéines ATIC, PTPLAD1, AMPKα et ANXA2. ANXA2 est une protéine impliquée dans la biogénèse et le transport endosomal. Nos résultats identifient un site de SUMOylation régulé par l’insuline dans sa région N-terminale. ATIC est une enzyme de la voie de synthèse des purines de novo dont le substrat AICAR est un activateur de l’AMPKα. Des analyses biochimiques in vitro et in vivo nous montrent que ATIC favorise la tyrosine phosphorylation du RI par opposition fonctionnelle à PTPLAD1. Une délétion partielle d’ATIC stimule l’activation de l’AMPK dont la sous-unité AMPKα2 apparaît déterminante pour le trafic du RI. Nous démontrons que ATIC, PTPLAD1, AMPKα, AICAR et ANXA2 contrôlent l’endocytose du RI à travers le cytosquelette d’actine et le réseau de microtubules. Nous ressortons un nœud de signalisation (ATIC, PTPLAD1, AMPKα) capable de détecter les niveaux d’activation du RI, d’énergie cellulaires (rapports AMP/ATP) et aussi d’agir sur la signalisation et l’endocytose du RI. Cette proximité moléculaire expliquerait le débat sur le mécanisme primaire du diabète de type 2 (DT2), notamment entre la sensibilité à l’insuline et sa clairance. Nous avons calculé un enrichissement de 61% de variants communs du DT2 parmi les protéines fonctionnellement proches du RI incluant RI, ATIC, AMPKα, KIF5A et GLUT2. Cet enrichissement suggère que l’hétérogénéité génétique révélée par les consortiums sur études génomiques (GWAS) converge vers des mécanismes peu étudiés de biologie cellulaire.

Role and modulation of maternal transcripts during the first cleavage divisions in bovine embryos

Ce travail porte sur l’identification, la fonction et la régulation des molécules maternelles d’ARNm qui dirigent la compétence développementale juste après la fécondation chez les bovins. Tout d’abord, en utilisant le modèle du temps écoulé jusqu’au premier clivage zygotique et à travers l’évaluation du transcriptome des embryons à 2-cellules, il fut possible de déterminer la signature moléculaire des niveaux extrêmes de compétence au développement et sélectionner des molécules candidates pour des études postérieures. Les résultats ont montré que les embryons de capacité développementale variable diffèrent dans certaines fonctions comme la réparation de l’ADN, le traitement de l’ARN, la synthèse de protéines et l’expression génique définies par des ARNm synthétisés par l’ovocyte. Pour obtenir une confirmation fonctionnelle, une paire de transcrits maternels (l’un détecté dans notre sondage précédent et l’autre étant une molécule reliée) ont été inhibés par « knock-down » dans des ovocytes. Les effets du knock-down de ces facteurs de transcription sont apparus avant la formation des blastocystes dû à une diminution de la capacité au clivage et celle à progresser après le stage de 8-cellules. L’analyse moléculaire des embryons knock-down survivants suggère qu’un de ces facteurs de transcription est un contrôleur crucial de l’activation du génome embryonnaire, qui représente une fenêtre développementale dans l’embryogenèse précoce. Dans la dernièr étude, nous avons testé si les facteurs de transcription d’intérêt sont modulés au niveau traductionnel. Des ARNm rapporteurs couplés à la GFP (Protéine fluorescente) contenant soit la version courte ou la version longue de la séquence 3’-UTR des deux molécules furent injectées dans des zygotes pour évaluer leur dynamique traductionnelle. Les résultats ont montré que les éléments cis-régulateurs localisés dans les 3’-UTRs contrôlent leur synchronisation traductionnelle et suggèrent une association entre la compétence développementale et la capacité de synthèse de ces protéines. Ceci conduit à l’idée que ces facteurs de transcription cruciaux sont aussi contrôlés au niveau traductionnel chez les embryons précoces. Les connaissances acquises ont joué un rôle essentiel pour définir le contrôle potentiel des molécules maternelles sur les embryons au début de leur développement. Cette étude nous montre aussi une utilisation potentielle de cette information ainsi que les nouveaux défis présents dans le secteur des technologies reproductives.

Analyse de la valeur pronostique du contexte immunologique du cancer superficiel de la vessie

Le cancer de la vessie est le 5e plus répandu au Canada. Les tumeurs vésicales non-infiltrant le muscle (TVNIM) représentent 70-75% des tumeurs au premier diagnostic. Après une résection transurétrale de tumeur de vessie (RTUTV), 60-70 % des patients souffriront de récidive et 10-20 % de progression vers l’infiltration du muscle (TVIM). Présentement, l’évaluation du risque de récidive ou de progression pour sélectionner le traitement approprié est basée sur les caractéristiques cliniques et pathologiques. La gestion des TVNIM à haut risque est l’un des aspects les plus difficiles à gérer pour un uro-oncologue et il est bien connu que l’issue clinique peut varier significativement entre des patients ayant une tumeur de même stade. Il serait donc important de détecter les tumeurs les plus susceptibles de récidiver et de progresser pour ajuster le traitement en conséquence. L’objectif de mon projet était d’analyser la valeur pronostique du contexte immunologique des TVNIM pour prédire leurs probabilités de récidive ou de progression vers l’infiltration du muscle. Mon premier volet consistait à évaluer la valeur pronostique de l’infiltration des cellules immunes, telles que les cellules dendritiques infiltrant les tumeurs (TIDC), les cellules T infiltrant les tumeurs (TIL) et les macrophages associés aux tumeurs (TAM) dans une cohorte de 106 TVNIM initiales. Les données d’infiltration des TIDC et des TIL dans les TVNIM démontrent leur importance dans l’évolution des patients atteints du cancer de la vessie et pourraient aider à identifier les TVNIM à haut risque. Mon deuxième volet consistait à caractériser un profil d’expression génique associé aux immunités innée et adaptative dans une série de 22 TVNIM. Cependant, le faible nombre de tumeurs disponibles a empêché d’obtenir une conclusion. Notre étude a permis de confirmer que la composition et le phénotype des cellules immunes infiltrant les TVNIM ont un impact sur l’évolution de ces tumeurs.

Étude de variations génétiques et épigénétiques de gènes candidats des complications métaboliques de l'obésité

L’obésité est de nos jours un problème croissant à travers le monde. La morbidité qui y est associée est surtout reliée au développement des différentes composantes du syndrome métabolique (SMet), une constellation de facteurs de risque regroupant l’hypertension, la dyslipidémie (concentration faible de cholestérol des lipoprotéines à haute densité (C-HDL) et élevée de triglycérides (TG)), l’hyperglycémie et l’obésité. Cependant, certains sujets obèses demeurent métaboliquement sains. Les facteurs génétiques joueraient donc un rôle important dans le développement de l’obésité et de ses complications. Les facteurs épigénétiques semblent également y avoir des effets. L’analyse de tissu adipeux viscéral (TAV) a donc été réalisée pour mener à la découverte de plusieurs gènes différentiellement exprimés et méthylés entre les obèses atteints et non atteints par le SMet. Les deux gènes candidats NMT1 et DGKZ font partie de ce groupe et leurs associations avec les composantes du SMet ont été testées. Leurs niveaux de méthylation et d’expression génique ont aussi été analysés.

Étude de la guérison des plaies cornéennes grâce à la cornée reconstruite par génie tissulaire

La cornée est la couche la plus antérieure de l’oeil et sa transparence permet de laisser passer les ondes lumineuses vers la rétine. Cependant, la localisation de la cornée la prédispose à des blessures chimiques et mécaniques. La guérison des blessures cornéennes est un mécanisme complexe faisant intervenir la mort cellulaire, la migration, la prolifération, la différenciation et le remodelage de la matrice extracellulaire (MEC). Dans cette étude, nous avons utilisé la cornée humaine reconstruite par génie tissulaire composée d’un épithélium et d’un stroma afin d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de la guérison des plaies, en particulier le remodelage de la MEC exercé par les métalloprotéinases matricielles (MMPs). Les analyses en profilage génique sur biopuces à ADN nous ont permis de démontrer que l’expression de plusieurs gènes était dérégulée lors de la guérison des plaies dans notre modèle. L’expression des gènes codant pour les MMPs, tel que confirmée en qPCR, est augmentée dans l’épithélium migrant afin de recouvrir la plaie. Les analyses en zymographie sur gel ont démontré que les MMPs étaient converties en leur forme enzymatiquement active au fur et à mesure que la lésion se referme. Par ailleurs, nous avons démontré que l’expression des MMPs par les cellules épithéliales est influencée par la présence des fibroblastes dans le stroma ainsi que par leur sécrétion d’une MEC enrichie en collagènes. De plus, les analyses en spectrométrie de masse ont confirmé que la présence d’un épithélium stratifié est requise pour la synthèse et l’organisation adéquate de la MEC. Enfin, les résultats de ces travaux améliorent nos connaissances des mécanismes cellulaires et moléculaires qui modulent la guérison des plaies cornéennes et pourront certainement mener à des progrès en clinique, notamment au niveau du développement de thérapies visant à traiter les troubles de la cornée.

Étude des gènes de fusion MLL dans les leucémies aigues humaines

Les leucémies aigues sont la conséquence d’une prolifération clonale et maligne des cellules hématopoïétiques. Elles surviennent suite à un évènement oncogénique qui se produit dans une cellule souche hématopoïétique (CSH) ou progénitrice. Cela lui confère une certaine instabilité qui engendre l’accumulation d’autres évènements génétiques et/ou épigénétiques responsables du développement clinique de la maladie. Les leucémies MLL représentent environ 10% des leucémies aigues et aujourd’hui, plus de 70 gènes de fusion ont été caractérisés. Les sangs de cordon sont une source importante de CSH et progénitrices. La purification de ces cellules et leur transformation en cellules leucémiques à l’aide de gènes de fusion MLL nous permettent de générer des leucémies aigues humaines dans des souris immunodéficientes NSG et ainsi étudier le potentiel leucémique de différents gènes de fusion MLL. Dans un premier temps, 4 gènes de fusion MLL ont été étudiés : MLL-AF9, MLL-AF4, MLL-ENL et MLL-ELL. In vitro, nous sommes capables de transformer des CSH en cellules leucémiques capables de proliférer rapidement. Les résultats in vivo nous montrent qu’il est possible de générer des leucémies avec les oncogènes MLL-AF9 et MLL-ENL. Pour les fusions MLL-ELL et MLL-AF4, bien que quelques leucémies ont pu être obtenues, plusieurs problèmes techniques nous empêchent aujourd’hui de disposer d’un modèle adéquat permettant l’étude complète de ces oncogènes. Dans un second temps, les leucémies aigues MLL-AF9 ont été étudiées dans un modèle contrôlé où les cellules souches proviennent d’un donneur unique. Grâce à ce modèle, nous avons pu démontrer que l’oncogène MLL-AF9 est suffisant pour induire le développement de la maladie. En effet aucune nouvelle mutation n’a pu être identifiée au cours du développement de la leucémie. Parmi les leucémies myéloïdes aigues (LMA) MLL-AF9 issues de ce modèle, certains gènes non mutés, dont RET, ont été identifiés comme étant de potentiels biomarqueurs de ce sous-groupe de leucémie.

Caractérisation des effets de l’hyperglycémie chronique dans la choroïde d’yeux diabétiques

But: Le diabète est un problème important de santé publique et la complication oculaire la plus commune est la rétinopathie diabétique (RD). Certaines études indiquent que la choroïde des patients diabétiques est affectée sans signe apparent de RD. Notre hypothèse est que l’élévation du stress oxydant liée à l’hyperglycémie chronique affecte la fonction choroïdienne à un stade précoce de la RD. Nous proposons d’étudier la glycolyse, le métabolisme mitochondrial, le stress nitrosatif et la méthylation de l’ADN ainsi que de caractériser les modifications histologiques dans la choroïde diabétique. Méthodes: L’expression des gènes/protéines associés à la glycolyse, au métabolisme mitochondrial et à la production de l’oxyde nitrique a été comparée par profilage génique et immunobuvardage Western entre les choroïdes saines et diabétiques. Les niveaux globaux de méthylation et d’hydroxyméthylation de l’ADN ont été quantifiés par immunoslot blot et HPLC-MS/MS dans ces tissus. Enfin, des coupes tissulaires d’yeux de donneurs sains ou diabétiques avec RD non proliférante (RDNP) ou proliférante (RDP) ont été colorées au trichrome de Masson et au Weigert. L’épaisseur de la choroïde et de la membrane de Bruch, ainsi que la densité et le diamètre des vaisseaux sanguins choroïdiens ont été analysés. Résultats: Nos résultats montrent une dérégulation de l’expression de certains transcrits de la choroïde diabétique, mais peu de différences au niveau de l’expression protéique des cibles validées. Le niveau global de méthylation de l’ADN est similaire entre les donneurs sains et diabétiques. Nos analyses histologiques démontrent une diminution de l’épaisseur de la choroïde et une dégénérescence des choriocapillaires et des veines/veinules chez les donneurs diabétiques atteints de RDP. Conclusions: L’étude de la choroïde est importante, car l’atteinte de ce tissu a de graves répercussions sur la fonction rétinienne. L’identification de cibles dans la choroïde ouvre de nouvelles perspectives pour un traitement préventif de la RD.

Effets du stress oxydatif induit par les rayons UVA et endogène sur la cornée humaine : étude des délétions de l’ADN mitochondrial, des modifications dans la matrice extracellulaire cornéenne et de la dystrophie cornéenne endothéliale de Fuchs

Le stress oxydatif peut provenir de sources exogènes comme les UVA ou de sources endogènes comme la chaîne respiratoire (OXPHOS). L’oxydation des composants cellulaires a été associée avec la dégénération, des phénotypes de vieillissement et des pertes de fonctionnalités des tissus. Les UVA sont les plus efficaces des rayons UV à induire de l’oxydation, tel que démontré par la formation de dommages oxydatifs à l’ADN et par l’apparition de délétions mitochondriales qui en résultent. La délétion mitochondriale de 4977 pb (ADNmtCD4977), la plus commune, et celle de 3895 pb (ADNmt3895) sont deux délétions reliées au photovieillissement cutané et à l’exposition au stress oxydant. Le phénomène de vieillissement dans la peau est bien documenté et se traduit par une dégradation de la matrice extracellulaire, une perte d’élasticité et la formation de rides. Toutefois, peu d’études portent sur la cornée humaine alors qu’elle est un tissu exposé directement aux rayonnements UV au même titre que la peau. Nous avons donc tenté mieux comprendre l’effet de l’oxydation exogène et endogène sur cette structure. L’analyse de la localisation des délétions ADNmtCD4977 et ADNmtCD4977 dans l’oeil humain a permis de révéler qu’elles se concentrent principalement dans le stroma cornéen et s’accumule avec l’âge. Le stroma cornéen est la couche cellulaire qui confère la transparence et la rigidité à la cornée humaine. Ces résultats nous ont suggéré une implication des UVA dans le photovieillissement de la cornée. Nous avons donc entrepris de vérifier les changements liés à l’exposition aux UVA dans le stroma cornéen puisque les UVA sont connus pour causer des altérations à la matrice extracellulaire (ECM) au niveau cutané. Nous avons donc créé un modèle de photovieillisement par une exposition chronique aux UVA sur des kératocytes avec lesquels nous avons fait sécréter une ECM. Nos résultats nous ont démontré qu’une exposition chronique aux UVA cause des altérations à l’ECM cornéen semblable à des phénotypes de photvieillissement. En effet, nous avons dénoté des changements transcriptomiques et protéomiques pour certains collagènes et protéoglycans. Une atteinte aux collagènes par le vieillissement cornéen se traduit entre autres par une rigidification, une opacification et un changement dans son pouvoir réfractif qui mène à une perte de la vision. Par ailleurs, notre avons également investigué l’implication du stress oxydatif dans la dystrophie cornéenne endothéliale de Fuchs (FECD), une maladie dégénérative de l’endothélium cornéen, qui mène à une perte de vision et est une cause principale de greffe cornéenne. L’étiologie de la maladie est encore inconnue, mais le stress oxydatif est soupçonné de jouer un rôle important dans la pathogenèse. Nos résultats ont amené de nouvelles évidences de l’implication de l’oxydation dans la maladie par l’augmentation de la quantité d’ADN mitochondrial et un raccourcissement des télomères dans des explants de cornées pathologiques. Nos résultats nous ont également démontré que la mise en culture de cellules FECD permettait la sélection de cellules fonctionnelles et comparables à des cellules saines en termes de quantité d’ADN mitochondrial et de son intégrité, de sensibilité à l’oxydation et de longueur télomérique. Les résultats obtenus soutiennent ainsi la possibilité d’employer les cellules FECD fonctionnelles sélectionnées pour utilisation en génie tissulaire afin de créer des cornées autologues pour pallier aux manques de greffes cornéennes. Enfin, nos résultats apportent de nouvelles évidences quant à l’implication du stress oxydatif dans le photovieillissement cornéen et dans l’étiologie de la FECD.

Regulation of mitotic BubR1 phosphorylation by the BubR1 pseudokinase domain

BubR1 est une protéine importante dans le point de contrôle de la mitose pour la stabilisation des interactions entre kinétochores et microtubules (KT-MT). Ces fonctions protègent de la ségrégation anormale des chromosomes et de l’instabilité du génome. BubR1 possède des sites de phosphorylation mitotique hautement conservés dans le domaine régulant l’attachement des kinétochores (KARD), où S676 et S670 sont phosphorylées respectivement par la kinase polo-like 1 (Plk1) et par la kinase cycline-dépendante 1 (Cdk1). Ces sites de phosphorylation sont essentiels pour le recrutement de la phosphatase PP2A-B56, qui stabilise les interactions KT-MT. Nos résultats montrent que la délétion entière ou des mutations qui déstabilisent le domaine pseudokinase de BubR1, causent la perte de phosphorylation des résidus S676 et S670 en mitose. Notre hypothèse est que le domaine pseudokinase de BubR1 peut jouer un rôle essentiel dans la régulation de la phosphorylation du KARD et donc dans la stabilisation des interactions KT-MT.

Rôle du gène de fusion MLL-ENL dans le développement et le maintien du phénotype leucémique

Les translocations chromosomiques du gène MLL sont connues pour mener au développement de leucémies aiguës. La translocation avec un de ses partenaires de fusion les plus communs, ENL, peut engendrer des leucémies aiguës de plusieurs types différents pour cette même translocation. Une fois la leucémogenèse initiée par la fusion MLL-ENL, son rôle quant au maintien du phénotype leucémique n’est pas encore bien connu à ce jour. Pour mieux comprendre l’importance de MLL-ENL après la leucémogenèse, des cellules souches/progénitrices de sang de cordon ombilical humain purifiées ont ainsi été transduites par un virus exprimant le gène de fusion MLL-ENL bordé par des sites LoxP ainsi que le marqueur eGFP. Ces cellules infectées ont ensuite été injectées dans notre modèle de souris immunodéficientes irradiées et placées sous observation pendant 24 semaines pour voir le développement de leucémies aiguës. Elles ont alors été sacrifiées et les cellules la moelle osseuse et de la rate ont ensuite été analysées par cytométrie en flux pour déterminer si la xénogreffe a engendré une leucémie dans notre modèle ainsi que le phénotype de celle-ci. Les souris injectées par les cellules infectées par le MLL-ENL ont généré uniquement des leucémies lymphoïdes aiguës de type B. Les cellules de ces leucémies primaires isolées ont été par la suite infectées par un lentivirus exprimant la cre-recombinase et le marqueur BFP afin d’exciser le gène MLL-ENL des cellules leucémiques grâce aux sites LoxP. Les cellules ont ensuite été triées pour le marqueur BFP et injectées dans des souris secondaires pour de voir si les cellules leucémiques souches pouvaient toujours régénérer la leucémie. Les conséquences de l’absence de MLL-ENL dans le maintien du phénotype leucémique n’ont cependant pas pu être vérifiées à cause d’une erreur dans la séquence de la cre-recombinase, mais nous avons observé la régénération des leucémies secondaires.

La régulation de la transcription dans les cellules cancéreuses

La chromatine eucaryote, contenant l’ADN et de nombreuses protéines de liaison, subit une compaction dynamique et fonctionnelle à de multiples échelles, nécessaire pour la régulation de nombreux processus biologiques comme l’expression génique. Afin de définir et maintenir les fonctions cellulaires, les protéines de la régulation transcriptionnelle et de la régulation de la structure chromatinienne agissent de concert pour orchestrer les programmes d’expression génique des cellules. Les facteurs de transcription opèrent de manière combinée et hiérarchique au niveau de nombreux éléments régulateurs, dont le fonctionnement est complexe et intégré, capables de générer de larges boucles topologiques pour réguler spécifiquement un promoteur cible à un moment précis. Le co-activateur transcriptionnel Mediator sert de centre d’interprétation, en connectant physiquement les régulateurs de la transcription à la machinerie transcriptionnelle, pour générer une réponse calibrée. Le complexe de maintenance de la structure des chromosomes, Cohesin, est impliqué dans la formation et la stabilisation des connexions génomiques à l’échelle de nombreuses structures chromatiniennes tri-dimensionnelles dont la caractérisation fonctionnelle commence à être explorée. Ensemble, les facteurs de transcription, Mediator et Cohesin contrôlent l’expression des programmes responsables du maintien de l’identité cellulaire. Les cellules cancéreuses présentent de nombreuses dérégulations au niveau transcriptionnel, et donc un programme d’expression aberrant. Nous avons démontré que les mécanismes de régulation qui contrôlent les cellules cancéreuses sont conservés, et proposons une stratégie qui permette de révéler les facteurs clefs dans la progression tumorale. Nous avons appliqué cette stratégie à la problématique de la résistance endocrinienne dans la progression du cancer du sein hormono-dépendant. Les résultats obtenus suggèrent que le complexe transcriptionnel AP-1 pourrait être impliqué dans l’acquisition et/ou le maintien de la résistance, en réponse aux pressions de sélection induites par les traitements hormonaux. Nous proposons une adaptation progressive et agressive des cellules cancéreuses par re-hiérarchisation des facteurs clefs qui contrôlent sa croissance.