Differential expression in “rogue” paramutation in peas (Pisum sativum L.)

Dissertação de Mestrado, Engenharia Biológica, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2014

Synthesis and evaluation of polymer nanoparticles for delivery in RPE cells

Ocular pathologies are among the most debilitating medical conditions affecting all segments of the population. Traditional treatment options are often ineffective, and gene therapy has the potential to become an alternative approach for the treatment of several pathologies. Methacrylate polymers have been described as highly biocompatible and are successfully used in medical applications. Due to their cationic nature, these polymers can be used to form polyplexes with DNA for its delivery. This work aims to study the potential of PDMAEMA (poly(2-(N,N’-dimethylamino)ethyl methacrylate)) as a non viral gene delivery system to the retina. The first part of this work aimed to study the potential for gene delivery of a previously synthesized PDMAEMA polymer of high molecular weight (354kDa). In the second part, we synthesized by RAFT a PDMAEMA with a lower molecular weight (103.3kDa) and similarly, evaluated its ability to act as a gene delivery vehicle. PDMAEMA/DNA polyplexes were prepared at 5, 7.5, 10, 12.5 and 20 nitrogen/phosphorous (N/P) ratio for the 354kDa PDMAEMA and at 5 and 7.5 for the 103.3kDa PDMAEMA. Dynamic light scattering and zeta potential measurements confirmed the nanosize and positive charge of polyplexes for all ratios and for both polymers. Both high and low Mw PDMAEMA were able to efficiently complex and protect DNA from DNase I degradation. Their cytotoxicity was evaluated using a non-retinal cell line (HEK293) and a retinal pigment epithelium (RPE) cell line (D407). We have found that cytotoxicity of the free polymer is concentration and time dependent, as expected, and negligible for all the concentrations of the PDMAEMA-DNA polyplexes. Furthermore, for the concentrations to be used in vivo, the 354kDa PDMAEMA showed no signs of inflammation upon injection in the intravitreal space of C57BL/6 mice. The transfection efficiency, as evaluated by fluorescence microscopy and flow cytometry, showed that the D407 retinal cells were transfected by polyplexes of both high and low Mw PDMAEMA, but with varied efficiency, which was dependent on the N/P ratio. Althogether, these results suggest that PDMAEMA is a feasible candidate for non-viral gene delivery to the retina, and this work constitutes the basis of further studies to elucidate the bottleneck in transfection and further optimization of the material.

Molecular biology of prolactin and prolactin receptor in a marine teleost: the sea bream(Sparus aurata)

Tese de dout. em Biologia, especialidade de Biologia Molecular, Unidade de Ciências e Tecnologias dos Recursos Aquáticos, Univ. do Algarve

Estudo do efeito de contaminantes na espécie sentinela, a amêijoa Ruditapes decussatus, por intermédio da análise da expressão proteica: aplicação à monitorização do meio marinho

Tese dout., Ciências e Tecnologias do Ambiente, 2009, Universidade do Algarve

A proteomic study of the effects of nutrient restriction in utero on postnatal metabolism

It is widely recognized that protein restriction in utero may cause metabolic and endocrine adaptations, which may be of benefit to the neonate on a short-term basis but may cause adverse long-term conditions such as obesity, Type 2 diabetes, metabolic syndrome, hypertension and cardiovascular diseases. Adequate foetal and early post natal nutrient and energy supply is therefore essential for adult animal health, performance and life span. In this project it was investigated the progressive adaptations of the hepatic proteome in male mink offspring exposed to either a low protein (FL) or an adequate protein (FA) diet in utero fed either on a low protein (LP) or on an adequate (AP) diet from weaning until sexual maturity. Specifically, the aim was to determine the metabolic adaptations at selected phases of the animal’s first annual cycle and establish the metabolic priorities occurring during those phases. The three different morphological stages studied during the first year of development included, end of bone growth at 4 months of age, maximal fat accretion at 6 months of age and sexual maturity at 12 months of age. A reference proteome of mink liver coming from these different animal groups were generated using 2D electrophoresis coupled to MALDI-TOF analysis and the way in which dietary treatment affect their proteome was established. Approximately 330 proteins were detected in the mink liver proteome. A total of 27 comparisons were carried out between all different animal groups which resulted in 20 differentially expressed proteins. An extensive survey was conducted towards the characterization of these proteins including their subcellular localization, the biological processes in which they are involved and their molecular functions. This characterization allowed the identification of proteins in various processes including the glycolysis and fatty acid metabolism. The detailed analysis of the different dietary treatment animal groups was indicative of differences in metabolism and also to changes associated with development in mink.

Estudo da contribuição dos smart polymers na eficácia e segurança do tratamento antineoplásico

O cancro é uma das mais conhecidas e temidas doenças existentes e, como tal, existe um grande interesse no desenvolvimento de métodos de tratamento das afeções tumorais. Os grandes avanços da quimioterapia têm dado ótimos resultados no tratamento do cancro. Contudo, a administração de fármacos antineoplásicos não garante uma elevada eficácia pois os tecidos tumorais apresentam propriedades estruturais que dificultam o transporte de agentes terapêuticos, como a disposição heterogénea dos vasos sanguíneos, a ausência de sistema linfático funcional, as inúmeras barreiras de transporte que o fármaco enfrenta até chegar às células alvo ou a disparidade da expressão de antigénios e recetores nas próprias células. Para além disso, os agentes quimioterapêuticos exibem elevada toxicidade não específica, afetando tanto as células tumorais como as células saudáveis, o que resulta frequentemente em severos efeitos secundários. Se a dose for reduzida para diminuir estes efeitos, a eficácia do tratamento diminuirá também; por outro lado, o aumento da dose, apesar de permitir um melhor controlo do crescimento do tumor, leva também a uma maior toxicidade nos tecidos saudáveis. Para contornar este efeito têm-se desenvolvido diferentes tipos de sistemas de libertação de fármacos com o objetivo de maximizar o direcionamento para os tumores e minimizar a toxicidade sistémica. Entre estas alternativas figuram os chamados smart polymers, que são macromoléculas que sofrem rápidas e reversíveis mudanças na sua estrutura em resposta a estímulos, os quais correspondem geralmente a pequenas alterações no meio, como pH, temperatura, incidência de radiação ou presença de determinadas substâncias químicas. Assim, associando um fármaco a um destes polímeros, em geral recorrendo a técnicas de encapsulação, é possível fazer com que a libertação do fármaco ocorra apenas nas células tumorais, seja por estas apresentarem as características necessárias para alterar a estrutura dos polímeros (acidez ou temperatura diferente das células saudáveis, por exemplo) ou por se conferir externamente à zona do tumor essas mesmas características (por exemplo, incidindo radiação na zona afetada). Os smart polymers têm outras vantagens. Os fármacos conjugados com estes polímeros têm tendência para se acumularem nos tecidos tumorais devido aos altos efeitos de permeabilidade e retenção nestas células e também demonstram menor toxicidade sistémica comparativamente com o fármaco livre. Além disso, os sistemas de libertação poliméricos podem permitir o aumento do tempo de semivida plasmático e da solubilidade dos fármacos de baixo peso molecular, assim como a sua libertação controlada. Com este trabalho pretende-se estudar mais profundamente de que forma é que a utilização dos smart polymers pode aumentar a eficácia e diminuir a toxicidade sistémica das terapias anticancerígenas no tratamento de afeções tumorais.

Extração e estudo das proteínas da goma da alfarroba com vista à sua clarificação

O objectivo primordial deste trabalho foi efectuar a extracao e o estudo das proteinas da Goma da Alfarroba ou Locust Bean Gum (LBG) com vista a sua clarificacao e purificacao. Para atingir este objectivo em primeiro lugar estudou-se o teor de etanol que se deveria utilizar numa suspensao aquosa de LBG, uma vez que a LBG e um polissacarido que hidrata facilmente com agua e consequentemente origina solucoes altamente viscosas que impossibilitam a realizacao de tecnicas de extracao de proteinas. Para isso estudou-se o comportamento da LBG em suspensoes aquosas com 10% (p/v) de LBG e diferentes concentracoes de etanol, designadamente 10% (v/v), 20% (v/v), 30% (v/v) e 40% (v/v). Com este estudo concluiu-se que seria necessario utilizar uma concentracao de 40% (v/v) de etanol a 96% em cada suspensao de LBG a 10% (p/v) para conseguir evitar a sua hidratacao excessiva. Assim, todas as extracoes neste trabalho foram realizadas de acordo com estas condicoes. Posteriormente com vista a extracao das proteinas da LBG testaram-se diferentes tratamentos, designadamente tratamentos alcalinos, acidos e com detergentes. Segundo a bibliografia consultada para os tratamentos alcalinos, realizaram-se estas extracoes com hidroxido de sodio (NaOH) com concentracoes de 0,025 M, 0,05M, 0,1M e 0,2M. Estes tratamentos foram iniciados com uma concentracao de NaOH a 0,2M, contudo apos analise dos resultados verificou-se que esta originou uma LBG com uma coloracao mais amarela do que a LBG bruta (inicial) apresentava. Sendo a ideia final a clarificacao da goma este nao foi um resultado desejavel e como tal testaram-se concentracoes inferiores de NaOH, acima referidas. No final concluiu-se que todas estas extracoes efetuadas com NaOH originavam uma LBG mais amarela do que a LBG bruta e que assim este nao seria o tratamento mais adequado para o objectivo pretendido. Como tal prosseguiram-se os estudos com um tratamento acido, que atraves de consulta bibliografica se iniciou com acido sulfurico (H2SO4). O tratamento acido iniciou-se com uma concentracao de H2SO4 de 0,1M, testando-se posteriormente tambem uma extracao com H2SO4 com concentracao de 0,05M. No final destas extracoes verificou-se que a LBG obtida em ambas apresentava uma coloracao mais clara do que a LBG bruta, o que representava, numa primeira analise, um bom resultado. Por fim efectuaram-se extracoes solido-liquido com diferentes detergentes, designadamente com Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 65, Tween 80, Tween 85, Triton X-100, Triton X-114 e SDS todos a uma concentracao de 0,1% (v/v) a excepcao do Tween 65 em que foi utilizada uma concentracao de 0,1% (p/v), porque a temperatura ambiente este detergente e solido. No final destas extracoes concluiu-se que na maioria dos casos a LBG apresentava uma coloracao mais clara do que a LBG bruta. Para quantificar as proteinas extraidas atraves de cada um dos tratamentos acima mencionados utilizaram-se dois metodos, o metodo de Bradford para quantificar as proteinas presentes nos sobrenadantes das extracoes e o metodo de Kjeldahl para quantificar as proteinas ainda presentes na LBG apos as extracoes. Analisando os resultados obtidos por estes metodos concluiu-se que a extracao efetuada com Tween 80, em que se efectuou uma lavagem adicional a LBG durante a filtracao com uma solucao de agua destilada e etanol a 40% (v/v), foi a que apresentou melhores resultados. Assim, foi com esta amostra proteica que se prosseguiram os estudos as proteinas. Para realizar os estudos as proteinas extraidas efectuou-se uma eletroforese em SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) com o intuito de verificar o estado da amostra. Analisando os geles obtidos constatou-se que a amostra se encontrava em boas condicoes. Deste modo realizou-se uma eletroforese bidimensional (2 – D) das proteinas extraidas da LBG. Nesta tecnica, como se desconheciam que tipo de proteinas se encontravam presentes na amostra utilizou-se uma banda de pH para a Focagem Isoelectrica (1a Dimensao) entre 3 e 10 e a separacao por Peso Molecular (2a Dimensao) foi efetuada em SDS-PAGE. Analisando os geles obtidos concluiu-se que a maioria das proteinas presentes nesta amostra apresentam pontos isoelectricos na gama de pH entre 5 e 6 e tem pesos moleculares entre 40 e 60 kDa. Pode-se entao concluir que o objectivo deste trabalho foi apenas parcialmente atingido uma vez que se conseguiu extrair e estudar algumas das caracteristicas das proteinas presentes na LBG, mas nao se alcancou a sua clarificacao.

Development of non-viral vectors for gene therapy for pathologies of the retina

Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2015

Drug repurposing in the treatment of Melanoma Brain Metastasis

Dissertação de Mestrado, Biologia Molecular e Microbiana, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2015

Structural characterization and comparative analysis of human and piscine cartilage acidic protein (CRTAC1/CRTAC2)

Dissertação de mestrado, Biotecnologia, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2014

Purification, biochemical characterization and localization at single cell resolution of Matrix Gla Protein (MGP) and Bone Gla Protein (BGP) in the teleost fish Argyrosomus regius

Tese de dout. em Química, Faculdade de Ciências do Mar e do Ambiente, Univ. do Algarve, 2002

Multibiomarker assessment of cadmium-based quantum dots effects in the marine mussel Mytilus galloprovincialis

Tese de Doutoramento, Ciências do Mar, da Terra e do Ambiente, Ramo: Ciências e Tecnologias do Ambiente, Especialização em Ecotoxicologia, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2016