Asma - perfil de uma patologia crónica multifactorial: processo inflamatório e abordagem farmacoterapêutica

Fundamentado numa pesquisa bibliográfica exaustiva, o presente trabalho pretende identificar os vários fenótipos da asma que afectam a população, assim como os mecanismos celulares e moleculares que conduzem ao processo de inflamação crónica e de remodelação brônquica característicos desta patologia. Hoje a terapêutica farmacológica da asma, encontra-se dirigida à prevenção de exacerbações pelo controlo da inflamação ou à reversibilidade da obstrução brônquica resultante das mesmas. Assim com a ambição de definir um tratamento mais eficiente que eventualmente leve à cura, vários imunomoduladores têm sido desenvolvidos, sobre os quais recairá alguma da atenção neste estudo. Entre Março e Setembro de 2011, foi recolhida informação bibliográfica, recorrendo a livros, artigos e bases de dados online, procurando sempre as fontes com informação mais actual e fidedigna disponível. Depois de investigados os vários intervenientes nos processos de inflamação e remodelação brônquicas e a forma como interagem entre si, avaliaram-se algumas das novas moléculas disponíveis para o tratamento da asma, actualmente em fase de ensaios clínicos. Alguns destes fármacos revelam-se promissores no tratamento de alguns fenótipos específico de asma. Considerada uma doença bastante complexa e heterogénea, é agora perceptível que a asma, não é apenas determinada por uma resposta linfocitária Th2, mas reflecte antes uma constante mudança na resposta imunitária, que compreende uma complexa rede de sinais efectores e regulatórios entre as células estruturais e diversos leucócitos. Assim a contínua busca de novos tratamentos passará pela modulação conjunta de vários mediadores, com o objectivo de alterar alguma

Identification of genes regulated by mir-363*, a regulator of bone marrow endothelial cell properties

As células estaminais hematopoiéticas residem na medula óssea e possuem capacidade para se auto-renovar e dar origem a todos os tipos de células sanguíneas. O endotélio da medula óssea é constituído por células endoteliais de medula óssea (BMEC) e compreende dois nichos com funções distintas: o nicho osteoblástico e o nicho vascular. O nicho osteoblásctico proporciona condições para a quiescência de células estaminais hematopoiéticas, enquanto no nicho vascular ocorre proliferação e diferenciação das mesmas. Quando ocorre um desequilíbrio na expressão de genes que codificam para proteínas envolvidas na mobilização de células do nicho osteoblástico para o nicho vascular – factores angiócrinos – ocorre uma desestabilização do microambiente medular, que se pode traduzir num processo tumoral. Os microRNAs (miRNAs) são uma classe de RNAs não codificantes, de cadeia simples, que regula a expressão génica. Os miRNAs são sequências endógenas de RNA que possuem entre 19 e 25 nucleótidos de tamanho. Os miRNAs são reguladores da expressão genica, induzindo o silenciamento a nível da pós-transcrição, através da sua ligação com uma sequência específica para a qual possuem afinidade, na região 3’ não traduzida (3’ UTR) dos seus mRNA alvo, conduzindo à inibição da tradução ou à sua degradação. Os miRNAs estão envolvidos na regulação de genes de diversas vias afectando processos fundamentais como hematopoiese, apoptose, proliferação celular e tumorigénese. Os níveis de expressão dos miRNAs estão alterados no cancro, podendo actuar directamente como supressores de tumor ou como oncogenes, sendo neste caso denominados de oncomirs. Os perfis dos níveis de expressão de vários miRNAs foram estudados, tendo-se verificado que se alteram durante o processo de carcinogénese, podendo actuar directamente como supressores de tumor ou como oncogenes, sendo neste caso denominados de oncomirs. Apesar do miR-363* estar envolvido na regulação da expressão de genes que regulam propriedades das células endoteliais e medula óssea, os genes sobre os quais exerce a sua função ainda não foram identificados.O objectivo do presente estudo é a identificação dos genes directamente regulados pelo miR-363* (genes alvo) e a sua relevância para a disfunção medular e a sua caracterização nos síndromes mielodisplásicos. A estratégia usada baseou-se na redução ou aumento forçados dos níveis de miR-363* em células endoteliais e subsequente análise da expressão génica através de microarrays de cDNA do genoma humano. A redução do miR-363* vai implicar o aumento da expressão dos seus genes alvo, assim como o aumento dos níveis do miR-363* vai induzir a degradação e consequente redução dos seus genes alvos. A intersecção dos dados gerados através do estudo da expressão com bases de dados que possuem algoritmos para previsão de genes alvo directos dos miRNAs (miRBase e MicroCosm Targets) permitiu restringir os genes a analisar a sete genes, nomeadamente BST1, ESAM, FCER1G, IKBKG, SELE, THBS3 e TIMP1. A interacção directa destes candidatos a alvos directos do miR-363* foi posteriormente validada. Para tal, as 3’UTR dos genes foram clonadas num vector que contém o gene da luciferase. Uma vez as clonagens realizadas, efectuaram-se ensaios funcionais em células endoteliais, nomeadamente HUVEC, nas quais se co-transfectaram os vectores gerados, anti-miRs ou pre-miRs (para diminuir ou aumentar o nível de miRNA) e o plasmídeo controlo da Renilla para normalização dos ensaios de luciferase. A variação da luminescência obtida em presença do aumento ou redução do miR-363* deu uma forte indicação da regulação directa do miR-363* nesses alvos. No entanto, a confirmação desta interacção directa foi efectuada através de ensaios de mutagénese, nos quais de induziram mutações na 3’UTR nos locais de ligação do miRNA, seguidos dos ensaios funcionais como acima descritos. Esta estratégia sugere que o TIMP1, inibidor da metaloprotease-9 (MMP-9), é regulado directamente pelo miR-363*. Adicionalmente, os níveis de expressão dos alvos directos do miR-363* foram estudados em 17 amostras de aspirados de medula óssea de doentes com síndromes mielodisplásicos. Os síndromes mielodisplásicos são caracterizados como um grupo heterogéneo de condições, que apresentam citopenias (produção deficiente de eritrócitos, leucócitos e/ou megacariócitos) e medula óssea displástica e hipercelular. A escalonagem dos doentes foi feita de acordo com o sistema de prognóstico IPSS elaborado pela Organização Mundial de Saúde, e que consiste numa tabela de risco de progressão de síndromes mielodisplásicos para leucemia mielóide aguda (LMA) e que agrupa os doentes em baixo risco – que compreende os níveis baixo e intermédio 1 – e em alto risco – que compreende os níveis intermédio 2 e alto. Dos genes regulados pelo miR-363*, o destacam-se o TIMP1, estando aumentando em doentes com mau prognóstico, e o THBS3 que apresenta um aumento nos doentes com prognóstico intermédio. Em suma, os estudos realizados permitiram a identificação de genes regulados pelo miR-363* e contribuiram para o conhecimento de como o miR-363* contribui para a disfunção medular, particularmente em síndromes mielodisplásicos, pela desregulação das propriedades endoteliais.

Differential requirements of aPKC activity within different epithelial tissues

Epithelial tissues are essential during morphogenesis and organogenesis. During development, epithelial tissues undergo several different remodeling processes, from cell intercalation to cell change shape. An epithelial cell has a highly polarized structure, which is important to maintain tissue integrity. The mechanisms that regulate and maintain apicobasal polarity and epithelial integrity are mostly conserved among all species and in different tissues within the same organism. aPKC-PAR complex localizes in the apical domain of polarized cells, and its function is essential for apicobasal polarization and epithelial integrity. In this work we characterized two novel alleles of aPKC: a temperature sensitive allele (aPKCTS), which has a point mutation on a kinase domain, and another allele with a point mutation on a highly conserved amino acid within the PB1 domain of aPKC (aPKCPB1). Analysis of the aPKCTS mutant phenotypes, lead us to propose that during development different epithelial tissues have differential requirements of aPKC activity. More specifically, our work suggests de novo formation of adherens junctions (AJs) is particularly sensitive to sub-optimal levels of apkc activity. Analysis of the aPKCPB1 allele, suggests that aPKC is likely to have an apical structural function mostly independent of its kinase activity. Altogether our work suggests that although loss of aPKC function is associated to similar epithelial phenotypes (e.g., loss of apicobasal polarization and epithelial integrity), the requirements of aPKC activity within these tissues are nevertheless likely to vary.

Effect of polyunsaturated fatty acids (PUFAs) on the proliferation and extracellular matrix mineralization and gene expression of gilthead seabream skeletal cell lines

The aquaculture industry aims at replacing significant amounts of marine fish oil by vegetable oils in fish diet. Dietary lipids have been shown to alter the fatty acid composition of bone compartments, which would impact the local production of factors controlling bone formation. Knowledge on the mechanisms underlying the nutritional regulation of bone metabolism is however scarce in fish. Two in vitro bone-derived cell systems developed from seabream (an important species for aquaculture in the Mediterranean region) vertebra, capable of in vitro mineralization and exhibiting prechondrocyte (VSa13) and pre-osteoblast (VSa16) phenotype, were used to assess the effect of certain polyunsaturated fatty acids (PUFAs; arachidonic (AA), eicosapentaenoic (EPA) and docosahexaenoic (DHA) acids) on cell proliferation, extracellular matrix (ECM) mineralization and gene expression. While all PUFAs promoted morphological changes in both cell lines, VSa16 cell proliferation appeared to be stimulated by PUFAs in a dose dependent manner until 100M, whereas proliferation of VSa13 cells was impaired at concentrations above 10M. AA, EPA and DHA inhibited VSa13 ECM mineralization, alone and in combination, while VSa16 ECM mineralization was only inhibited by AA and EPA. DHA had the opposite effect, increasing mineralization almost by 2 fold. When EFAs were combined, DHA apparently compensated for the inhibitory effect of AA and EPA. Expression of marker genes for bone and lipid metabolisms has been investigated by qPCR and shown to be regulated in pre-osteoblasts exposed to individual PUFAs. Our results show that PUFAs are effectors of fish bone cell lines, altering cell morphology, proliferation and mineralization when added to culture medium. This work also demonstrates the suitability of our in vitro cell systems to get insights into mineralization-related effects of PUFAs in vivo and to evaluate the replacement of fish oils by vegetable oil sources in fish feeds.

Controlo da amónia no transporte de peixe: utilização de AmQuel em ensaios laboratoriais

O controlo da amónia durante o transporte de peixe vivo, é uma das problemáticas mais exigentes ao nível de controladores químicos. Até então, o AmQuel® apresenta-se como uma alternativa e possível solução para esta problemática. Este produto foi testado em diversas situações, manipulando-se concentrações iniciais e taxas de excreção de amónia. Na primeira parte (I), através do acompanhamento de um transporte efectivo de corvinas (Argyrosomus regius Asso, 1801) e duas simulações de transporte, de corvinas e de cavalas (Argyrosomus regius e Scomber japonicus Houttuyn, 1782). Na parte laboratorial (II), foram testadas diversas simulações de taxas de excreção de amónia e o efeito quelante do AmQuel® sobre estas. Pelos resultados obtidos verificou-se uma relação linear entre AmQuel® e amónia e uma possível inferência na concentração de cortisol libertada para a água. Os resultados obtidos laboratorialmente demonstraram que pequenas diferenças nas concentrações de cada cocktail escolhido poderão ter resultados distintos no controlo de amónia. O Cocktail B (15/15/7.5 ppm) demonstrou ser eficaz no controlo de amónia, para taxas de excreção inferiores a 5mg/h, mesmo com concentração inicial (0.25mg/L) de amónia no tanque. Cocktails inferiores a 15/15/7.5 ppm revelaram-se ineficazes no controlo de amónia, para taxas de excreção superiores a 1mg/h. Estes resultados irão facilitar a escolha do cocktail de AmQuel® mais adequado, consoante o tempo e características de cada transporte.

The effect of sucrose on protein stability and fibrillation of prion and S6 protein

Aggregation and fibrillation of proteins have a great importance in medicine and industry. Misfolding and aggregation are the basis of many neurodegenerative diseases like Alzheimer and Parkinson. Osmolytes are molecules that can accumulate within cells and act as protective agents and they can inclusively act as protein stabilizers when cells are exposed to stress conditions. Osmolytes can also act as protein stabilizers in vitro. In this work, two different proteins were studied, the ribosomal protein from Thermus thermophilus and the mouse prion protein. The existence of an unstructured N-terminal on the prion protein does not affect its stability. The effect of the osmolyte sucrose on the fibrillation and stabilization of these two proteins was studied through kinectic and equilibrium measurements. It was shown that sucrose is able to compact the native structure of S6 protein in fibrillization conditions. Sucrose affects also folding and unfolding kinetic of S6 protein, delaying unfolding and increasing folding rate constants. The mechanism of stabilization by sucrose is non-specific because it is distributed for all protein structure, as it was demonstrated by a protein engineering approach. Sucrose delays the process of formation and elongation of S6 and prion protein from mouse. This delay is the result of the compaction of the native structure refered above. However, cellular toxicity studies have shown that fibrils formed in the presence of sucrose are more toxic to neuronal cells.

Exploring an uncommon host-parasite interaction to unveil the uniqueness of Perkinsus sp as a model organism

We report the exploration of some unique metabolic pathways in Perkinsus olseni a marine protist parasite, responsible to significant mortalities in mollusks, especially in bivalves all around the world. In Algarve, south of Portugal carpet shell clam Ruditapes decussatus mortalities can reach up to 70%, causing social and economic losses. The objective of studying those unique pathways, is finding new therapeutic strategies capable of controlling/eliminating P. olseni proliferation in clams. In that sense metabolic pathways, were explored, and drugs affecting these cycles were tested for activity. The first step involved the identification of the genes behind those pathways, the reconstitution of the main steps, and molecular characterization of those genes and later on, the identification of possible targets within the genes studied. Metabolic cycles were screened due to the fact of not being present in host or differ in a critical way, such as the following pathways: shikimate, MEP-­‐ isoprenoids, Leloir cycle for chitin production, purine biosynthesis (unique among protists), the de novo synthesis of folates (absent in metazoa) and some unique genes like, the alternative oxidase (a branch of respiratory chain) and the hypoxia sensor HPH. All those pathways were covered and possible chemical inhibition using therapeutic drugs was tested with positive results. The relation between the common host Ruditapes decussatus and P. olseni was also explored in a dimension not possible some years ago. With the accessibility to second generation sequencers and microarray analysis platforms, genes involved in host defense or parasite virulence and resistance to the host were deciphered, allowing aiming to new targets (mechanisms and pathways), offering new possibilities for the control of Perkinsus in close environments. The thousands of genes, generated by this work, sequenced and analyzed from this commercial valuable clam and for Perkinsus olseni will be an important and value tool for the scientific community, allowing a better understanding of host-­‐parasite interactions, promoting the usage of P. olseni as an emerging model for alveolata parasites.

Instrumentação e controlo para regulação de pH em sistemas de cultivo de organismos aquáticos

A Ria Formosa é um tesouro ambiental sem paralelo, preservando uma fauna e flora únicas no mundo. A riqueza deste habitat é de enorme importância para a região, e extremamente apetecível para cientistas oriundos de todas as partes do globo, que aqui frequentemente se deslocam para conduzirem estudos científicos e experiências. O Centro de Ciências do Mar (CCMAR) da Universidade do Algarve (que inclui o Centro Experimental do Ramalhete) conduz estudos e experiências neste palco, estudos que são de inquestionável valor para o conhecimento e desenvolvimento científico. Um assunto que está a merecer a atenção da comunidade científica mundial nos últimos anos é a questão da acidificação dos oceanos. A diminuição gradual do pH das águas pode vir a ter graves repercussões nos ecossistemas marinhos, e o Centro Experimental do Ramalhete tem vindo a conduzir experiências com fauna e flora provenientes da Ria Formosa em águas com níveis de pH mais reduzido, condições que se prevê que os oceanos venham a ter no futuro. Os equipamentos de instrumentação e controlo a que o Centro tem acesso condicionam as experiências que ali são levadas a cabo pelos investigadores, pelo que o desenvolvimento de equipamentos adequados incorporando tecnologias apropriadas permitiria a realização de novas e melhores experiências no campo da biologia marinha. Ao nível do controlo existe uma lacuna no mercado, entre controladores para aquariofilia demasiado simples e controladores industriais demasiado dispendiosos e complexos. Esta dissertação pretende colmatar essa lacuna através do desenvolvimento de um protótipo de um sistema distribuído microcontrolado para aquisição de dados e controlo de pH que vá ao encontro das necessidades dos investigadores do Centro e que se pretende simples, modular, flexível, económico e expansível no futuro. O foco centra-se no desenvolvimento da instrumentação necessária para as medições de temperatura e pH, e depois no estudo de uma malha de controlo PID utilizando como base um modelo do sistema obtido através de resultados experimentais, para o controlo automático do pH.

O papel do regulador transcricional CITED2 na leucemia linfoblástica aguda de linfócitos T

A leucemia linfoblástica aguda de Linfócitos T (LLA-T) é uma neoplasia agressiva de precursores de células T do timo, que afeta principalmente crianças e adolescentes. A identificação de fatores moleculares que controlam a iniciação e progressão da LLA-T é fundamental para desenvolvimento de terapêuticas mais específicas e eficientes. Devido a atividade de fatores de transcrição estar muitas vezes desregulada na LLA-T e o regulador transcricional CITED2 controla diversos processos no desenvolvimento e oncogénese, levando assim ao objetivo principal, verificar se o CITED2 está envolvido na iniciação e/ou progressão da LLA-T, para se cumprir este iremos verificar se o CITED2está expresso nas linhas celulares leucémicas, quais os seus efeitos e por último verificar se o seu promotor é influenciada por três vias de sinalização: JAK-STAT, NFkB e NOTCH1. Analisou-se a expressão de CITED2 em linhas celulares de leucemia linfoblástica das células T e de células T normais, realizando o PCR quantitativo. Verificou-se que todas as células expressavam o CITED2, algumas com elevada expressão, por exemplo a linha celular EL4.2 expressa sete vezes mais Cited2 que os timócitos normais. Selecionou-se duas linhas celulares, EL4.2 e as DND41, para efetuar a subexpressão de CITED2, utilizando um plasmídeo lentiviral que expressa um RNA de interferência contra o CITED2. Conseguimos obter transdução estável deste plasmídeo para a linha celular DND41, tendo então efetuado análises de proliferação celular em meio de cultura normal ou meio com redução de soro fetal bovino. Verificou-se que a linha celular DND41/shCITED2 apresentava um maior crescimento celular comparando com a linha DND41/pLKO.1, sendo significativo, a partir das 48 horas, mas análise das fases do ciclo celular não demonstrou qualquer diferença. Analisou-se a resistência destas linhas celulares à apoptose, tratando as células com dexametasona, um agente quimioterápico para leucemias LLA-T. Observou-se que existe uma ligeira tendência para a linha celular DND41/shCITED2 ser mais resistente à apoptose. Mas nas linhas celulares sem tratamento, verificou-se diferenças na fase G0/G1 e G2/M, sendo que a linha celular DND41 sh CITED2 apresenta mais células com ciclo celuar ativo. Analisou-se no presente trabalho, se o promotor do CITED2 seria influenciando pela ativação das vias de sinalização JAK-STAT, NF-kB e NOTCH1. Os nossos resultados indicam que a ativação destas vias regulam negativamente o promotor do CITED2. Tendo em conta o conjunto dos nossos resultados, podemos concluir que a inativação do regulador transcricional CITED2 pode contribuir para o desenvolvimento da LLA-T. No entanto, será necessário desenvolver mais estudos para compreender os mecanismos subjacentes.

Synthesis and evaluation of polymer nanoparticles for delivery in RPE cells

Ocular pathologies are among the most debilitating medical conditions affecting all segments of the population. Traditional treatment options are often ineffective, and gene therapy has the potential to become an alternative approach for the treatment of several pathologies. Methacrylate polymers have been described as highly biocompatible and are successfully used in medical applications. Due to their cationic nature, these polymers can be used to form polyplexes with DNA for its delivery. This work aims to study the potential of PDMAEMA (poly(2-(N,N’-dimethylamino)ethyl methacrylate)) as a non viral gene delivery system to the retina. The first part of this work aimed to study the potential for gene delivery of a previously synthesized PDMAEMA polymer of high molecular weight (354kDa). In the second part, we synthesized by RAFT a PDMAEMA with a lower molecular weight (103.3kDa) and similarly, evaluated its ability to act as a gene delivery vehicle. PDMAEMA/DNA polyplexes were prepared at 5, 7.5, 10, 12.5 and 20 nitrogen/phosphorous (N/P) ratio for the 354kDa PDMAEMA and at 5 and 7.5 for the 103.3kDa PDMAEMA. Dynamic light scattering and zeta potential measurements confirmed the nanosize and positive charge of polyplexes for all ratios and for both polymers. Both high and low Mw PDMAEMA were able to efficiently complex and protect DNA from DNase I degradation. Their cytotoxicity was evaluated using a non-retinal cell line (HEK293) and a retinal pigment epithelium (RPE) cell line (D407). We have found that cytotoxicity of the free polymer is concentration and time dependent, as expected, and negligible for all the concentrations of the PDMAEMA-DNA polyplexes. Furthermore, for the concentrations to be used in vivo, the 354kDa PDMAEMA showed no signs of inflammation upon injection in the intravitreal space of C57BL/6 mice. The transfection efficiency, as evaluated by fluorescence microscopy and flow cytometry, showed that the D407 retinal cells were transfected by polyplexes of both high and low Mw PDMAEMA, but with varied efficiency, which was dependent on the N/P ratio. Althogether, these results suggest that PDMAEMA is a feasible candidate for non-viral gene delivery to the retina, and this work constitutes the basis of further studies to elucidate the bottleneck in transfection and further optimization of the material.

Isolamento e produção de agentes de controlo biológico das principais doenças de pós-colheita, em citrinos e pomóideas

Potenciais agentes de biocontrolo foram isolados a partir da microbiota epifítica de folhas e frutos, de citrinos e pomóideas, de diferentes pomares, durante diferentes campanhas e de distintas condições de armazenamento. A atividade antagonista de 1465 microrganismos isolados foi testada em ensaios in vivo em pomóideas face a Penicillium expansum (104 esporos/ml) e em citrinos face a P. digitatum (105 esporos/ml) em frutos feridos e inoculados artificialmente. Aproximadamente 7,6% dos isolados reduziu a severidade (diâmetro da podridão) e a incidência (% podres) em mais de 25%, menos de 3% reduziu ambos os parâmetros em mais de 50%, mas apenas 4 microrganismos preencheram os critérios de seleção, redução da incidência e severidade em mais de 75%. Dos 4 e pelos resultados obtidos em ensaios de seleção secundária e de determinação da concentração mínima eficaz, destacaram-se e selecionaram-se 2 microrganismos, uma bactéria isolada de laranjas „Valencia late‟ e identificada como pertencente ao grupo das Enterobactérias, Pantoea agglomerans PCB-1 e uma levedura isolada a partir da superfície de maças 'Bravo de Esmolfe' identificada como Metschnikowia andauensis PBC-2, com o objetivo de usar dois modelos distintos de agentes de biocontrol, uma bactéria e uma levedura. P. agglomerans é um agente de biocontrolo já conhecido. A estirpe PBC-1 isolada neste trabalho mostrou ter elevada eficácia face aos principais agentes patogénicos na póscolheita de citrinos e pomóideas. M. andauensis é uma levedura recentemente descoberta e a estirpe PBC-2 diz respeito à primeira referência desta espécie como agente de biocontrolo, a qual foi recentemente objeto de concessão de Patente de Invenção Nacional nº 105210, como uma nova estirpe desta espécie para uso como agente de biocontrolo das doenças de póscolheita de frutos. A concentração mínima eficaz dos antagonistas revelou estar dentro dos limites para o seu desenvolvimento comercial. M. andauensis PBC-2 quando aplicada à concentração de 5×106 ufc/ml, permitiu uma redução da incidência e da severidade de 62 e 70%, respetivamente, e quando aplicada a 1×107 ufc/ml, uma redução de 90% de incidência e de 95% de severidade. P. agglomerans PBC-1 aplicada a 1 × 108 ufc/ml em maçãs e em citrinos no controlo de P. expansum e P. digitatum, respetivamente, propiciaram uma redução significativa de cerca de 86% de cada um dos agentes patogénicos. O espectro de ação de M. andauensis PBC-2 foi avaliado, verificando-se o controlo efetivo face a Rhizopus stolonifer, P. expansum e Botritys cinerea, em pera 'Rocha' e em diferentes cultivares de maçã e contra P. digitatum e Penicillium italicum em clementinas e laranjas de diferentes cultivares. Durante 4 épocas, a eficácia de M. andauensis PBC-2, foi avaliada e comparada com o fungicida sintético mais usado comercialmente, Imazalil, em ensaios semicomerciais. Os resultados assemelharam-se aos obtidos com o fungicida, a redução da incidência do bolor azul foi de 90% em maças armazenadas durante 3 meses a 1±0.5 ºC, seguido de 7 dias à temperatura ambiente, para simular o tempo de prateleira. Em ensaios do estudo da dinâmica populacional, verificou-se que o agente de biocontrolo M. andauensis PBC-2 tem uma excelente capacidade colonizadora e que consegue crescer e sobreviver nas feridas, mas também na superfície dos frutos, armazenados à temperatura ambiente e em condições de frio. Pelo contrário, M. andauensis PBC- não apresentou capacidade de sobrevivência no suco gástrico simulado, começando a população a diminuir imediatamente após exposição e passadas 48 h não restava população viável. Diferentes meios de cultura usualmente descritos na produção de leveduras foram testados na produção de M. andauensis PBC-2. Aquele que apresentou a maior população viável ao fim de 40 h de incubação foi o meio YPD, entretanto escolhido para estudos posteriores. O pH mais favorável ao crescimento foi de 6,5, não se observando diferenças significativas entre os crescimentos a 25 e 30 ºC. Estudou-se ainda o efeito da concentração das duas fontes de azoto do meio YPD e elegeu-se a combinação de 10 g/l de extrato de levedura e 20 g/l de peptona. Nos estudos de produção de biomassa dos dois potenciais agentes de biocontrolo, analisou-se o efeito da sacarose, frutose e glucose, como fontes de carbono e otimizou-se a concentração destes açúcares no crescimento em Erlenmeyer. Após 20 h de incubação a população viável de P. agglomerans PBC-1 atingiu 3.9×109, 1.5×109, 3.9×109 ufc/ml, respetivamente. No caso de M. andauensis PBC-2, foi obtida a população de 1.2×108, 5.3×108 e 1,3×108 ufc/ml, com glucose, sacarose e frutose, após 40 h. Os resultados permitem concluir que os dois agentes têm capacidade de metabolizar os açúcares testados, contudo e atendendo à produtividade de biomassa, rendimento, disponibilidade e custo, optou-se por usar a sacarose como fonte de carbono nos restantes ensaios, nomeadamente na transição de Erlenmeyer para reator biológico. Na produção de P. agglomerans PBC-1 escolheu-se o meio SAC (5 g/l sacarose e 5 g/l extrato de levedura). O meio YPS (12.5g/l sacarose, 10 g/l extrato de levedura, 20 g/l peptona) foi usado no aumento de escala de M. andauensis PBC-2. A otimização da produção em reator biológico de P. agglomerans PCB-1 foi realizada submetendo o microrganismo a diferentes condições hidrodinâmicas, testando-se arejamentos, dois tipos de turbina (hélice; rusthon) e dispersores (poroso, em L). Foram igualmente estudados, o efeito da concentração inicial do inoculo e a adição programada da fonte de carbono. Embora tenham sido testadas diferentes variações, o perfil dos diferentes parâmetros analisados foi idêntico, a população máxima viável foi de 3-5×109 ufc/ml. A diferença mais notória foi observada na fermentação com concentração inicial de 107 cfu/ml, que permitiu encurtar em cinco horas a fase lag, o que pode significar uma redução de tempo de fermentação, e consequentemente uma redução de custos. Visando a produção de biomassa a baixo custo, fator importante na implementação de um sistema de controlo biológico, estudou-se a possibilidade de utilizar subprodutos e resíduos da indústria alimentar no crescimento dos agentes de biocontrolo. Subprodutos da indústria de alfarroba e subprodutos e resíduos da indústria de sumos de citrinos foram utilizados na produção de P. agglomerans PBC-1 e de M. andauensis PBC-2, respetivamente. Desta forma, para além de uma redução dos custos de produção, pretendeu-se a valorização de um subproduto (no caso de alfarroba e do bagaço de citrinos) e mitigar os efeitos nefastos de um resíduo (licor), com elevada carga poluente, que gera graves problemas ambientais e que pode ditar o encerramento desta unidade industrial, com efeitos devastadores para a economia local. Realizaram-se extrações de subprodutos da indústria de alfarroba, a diferentes razões sólido/líquido, tempos e temperaturas, de forma a maximizar a extração de açúcares. A potencialidade de utilizar o extrato de açúcares obtido, na produção de P. agglomerans PBC-1 foi avaliada, em ensaios de crescimento em Erlenmeyer, com consequente transição para reator mecanicamente agitado. Os perfis de crescimento da cultura crescida com subprodutos da indústria de alfarroba assemelharam-se aos observados com sacarose como fonte de carbono. A biomassa viável produzida com subprodutos da indústria de alfarroba, foi de 4- 7×109 ufc/ml, o que permite concluir que é uma alternativa viável à produção deste microrganismo. A produção de M. andauensis PBC-2 com subprodutos da indústria de sumos de citrinos, foi estudada em Erlenmeyer tendo como objetivo conhecer os perfis de crescimento do microrganismo, bem como, estudar a melhor combinação desta fonte de carbono e sua concentração. O bagaço de citrinos e um resíduo líquido, que se denominou de licor, foram testados com resultados comparáveis à produção obtida com meio usado como standard, (YPS), sem comprometer a atividade antagonista do agente de biocontrolo. Posteriormente, foi realizada a produção em reator mecanicamente agitado, escolhendo-se para tal o meio YL (10 g/l extrato de levedura e licor à concentração de açúcares de 12.5 g/l). Os parâmetros de crescimento da cultura foram semelhantes aos obtidos com a fonte de carbono comercial. Após aproximadamente 40 h de incubação, a população viável de M. andauensis PCB-2 atingiu 3.1×108 ufc/ml. A produtividade de biomassa e rendimento foi de 0.435 g/l.h e 1.502 g/g, respetivamente, comparável a produtividade de biomassa (0.432 g/l.h) e rendimento (1.4416 g/g) observado no meio YPS. Os resultados obtidos, são uma base sólida para o aumento de escala a um nível laboratorial e semi-industrial, permitiram concluir que é exequível produzir M. andauensis a baixo custo e representam uma possível alternativa para um resíduo. Em estudos dos possíveis modos de ação, de M. andauensis PBC-2, conclui-se que, este agente de biocontrolo, não tem como modos de ação a produção de antibióticos ou de voláteis, uma vez que, não se verificou inibição do crescimento dos agentes patogénicos. A competição por ferro e a produção de enzimas líticas por M. andauensis PBC-2 foi estudada em meios com diferentes concentrações de ferro e em um meio de cultura, com paredes celulares de fungos, como única fonte de carbono. Os resultados obtidos neste estudo sugerem que a produção e secreção de enzimas líticas não é o principal ou o mais importante modo de ação do agente de controlo biológico PBC-2, uma vez que a produção de quitinase observada ao 5 e 7º dia de incubação foi muito baixa, e não foi observada a produção de β-1,3- glucanases e proteases.

Effect of high CO2 and ocean acidification on photosynthesis and response to oxidative stress in seagrasses

Climate change scenarios comprise significant modifications of the marine realm, notably ocean acidification and temperature increase, both direct consequences of the rising atmospheric CO2 concentration. These changes are likely to impact marine organisms and ecosystems, namely the valuable seagrass-dominated coastal habitats. The main objective of this thesis was to evaluate the photosynthetic and antioxidant responses of seagrasses to climate change, considering CO2, temperature and light as key drivers of these processes. The methodologies used to determine global antioxidant capacity and antioxidant enzymatic activity in seagrasses were optimized for the species Cymodocea nodosa and Posidonia oceanica, revealing identical defence mechanisms to those found in terrestrial plants. The detailed analysis and identification of photosynthetic pigments in Halophila ovalis, H.stipulacea, Zostera noltii, Z marina, Z. capricorni, Cymodocea nodosa and Posidonia oceanica, sampled across different climatic zones and depths, also revealed a similarity with terrestrial plants, both in carotenoid composition and in the pigment-based photoprotection mechanisms. Cymodocea nodosa plants from Ria Formosa were submitted to the combined effect of potentially stressful light and temperature ranges and showed considerable physiological tolerance, due to the combination of changes in the antioxidant system, activation of the VAZ cycle and accumulation of leaf soluble sugars, thus preventing the onset of oxidative stress. Cymodocea nodosa plants living in a naturally acidified environment near submarine volcanic vents in Vulcano Island (Italy) showed to be under oxidative stress despite the enhancement of the antioxidant capacity, phenolics concentration and carotenoids. Posidonia oceanica leaves loaded with epiphytes showed a significant increase in oxidative stress, despite the increase of antioxidant responses and the allocation of energetic resources to these protection mechanisms. Globally, the results show that seagrasses are physiologically able to deal with potentially stressful conditions from different origins, being plastic enough to avoid stress in many situations and to actively promote ulterior defence and repair mechanisms when under effective oxidative stress.

Perceção de controlo na velhice: uma relação entre autoeficácia, autoestima e bem-estar psicológico

Dissertação de mestrado, Psicologia Clínica e da Saúde, Faculdade de Ciências Humanas e Sociais, Universidade do Algarve, 2015

Memórias não atendidas e supressão: uma adaptação do Paradigma Think/No-Think para a população portuguesa

Dissertação de mestrado, Neurociências Cognitivas e Neuropsicologia, Faculdade de Ciências Humanas e Sociais, Universidade do Algarve, 2015

Identification of novel molecular determinants of tissue mineralization in fish

The identification of genes involved in signaling and regulatory pathways, and matrix formation is paramount to the better understanding of the complex mechanisms of bone formation and mineralization, and critical to the successful development of therapies for human skeletal disorders. To achieve this objective, in vitro cell systems derived from skeletal tissues and able to mineralize their extracellular matrix have been used to identify genes differentially expressed during mineralization and possibly new markers of bone and cartilage homeostasis. Using cell systems of fish origin and techniques such as suppression subtractive hybridization and microarray hybridization, three genes never associated with mechanisms of calcification were identified: the calcium binding protein S100-like, the short-chain dehydrogenase/reductase sdr-like and the betaine homocysteine S-methyltransferase bhmt3. Analysis of the spatial-temporal expression of these 3 genes by qPCR and in situ hybridization revealed: (1) the up-regulation of sdr-like transcript during in vitro mineralization of gilthead seabream cell lines and its specificity for calcified tissues and differentiating osteoblasts; (2) the up-regulation of S100-like and the down-regulation of bhmt3 during in vitro mineralization and the central role of both genes in cartilaginous tissues undergoing endo/perichondral mineralization in juvenile fish. While expression of S100-like and bhmt3 was restricted to calcified tissues, sdr-like transcript was also detected in soft tissues, in particular in tissues of the gastrointestinal tract. Functional analysis of gene promoters revealed the transcriptional regulation of the 3 genes by known regulators of osteoblast and chondrocyte differentiation/mineralization: RUNX2 and RAR (sdr-like), ETS1 (s100-like; bhmt3), SP1 and MEF2c (bhmt3). The evolutionary relationship of the different orthologs and paralogs identified within the scope of this work was also inferred from taxonomic and phylogenetic analyses and revealed novel protein subfamilies (S100-like and Sdr-like) and the explosive diversity of Bhmt family in particular fish groups (Neoteleostei). Altogether our results contribute with new data on SDR, S100 and BHMT proteins, evidencing for the first time the role for these three proteins in mechanisms of mineralization in fish and emphasized their potential as markers of mineralizing cartilage and bone in developing fish.