Identification of protein complexes in Alzheimer's disease

A Doença de Alzheimer (AD) é a maior doença neurodegenerativa a nível mundial, e a principal causa de demência na população idosa. O processamento da proteína precursora de amilóide (APP) pelas β- e g- secretases origina o peptídeo Aβ, que agrega em oligómeros neurotóxicos e em placas senis. Estes são eventos-chave na patogénese da DA que levam à rutura da neurotransmissão sináptica, morte neuronal e inflamação neuronal do hipocampo e córtex cerebral, causando perda de memória disfunção cognitiva geral. Apesar dos grandes avanços no conhecimento do papel do processamento da APP na DA, a sua função fisiológica ainda não foi totalmente elucidada. Os mapas de interações proteína-proteína (PPI) humanos têm desempenhado um papel importante na investigação biomédica, em particular no estudo de vias de sinalização e de doenças humanas. O método dois-híbrido em levedura (YTH) consiste numa plataforma para a produção rápida de redes de PPI em larga-escala. Neste trabalho foram realizados vários rastreios YTH com o objetivo de identificar proteínas específicas de cérebro humano que interagissem com a APP, ou com o seu domínio intracelular (AICD), tanto o tipo selvagem como com os mutantes Y687F, que mimetizam o estado desfosforilado do resíduo Tyr-687. De facto, a endocitose da APP e a produção de Aβ estão dependentes do estado de fosforilação da Tyr-687. Os rastreios YTH permitiram assim obter de redes proteínas que interagem com a APP, utilizando como “isco” a APP, APPY687F e AICDY687F. Os clones positivos foram isolados e identificados através de sequenciação do cDNA. A maior parte dos clones identificados, 118, correspondia a sequências que codificam para proteínas conhecidas, resultando em 31 proteínas distintas. A análise de proteómica funcional das proteínas identificadas neste estudo e em dois projetos anteriores (AICDY687E, que mimetiza a fosforilação, e AICD tipo selvagem), permitiram avaliar a relevância da fosforilação da Tyr-687. Três clones provenientes do rastreio YTH com a APPY687F foram identificados como um novo transcrito da proteína Fe65, resultante de splicing alternativo, a Fe65E3a (GenBank Accession: EF103274), que codifica para a isoforma p60Fe65. A p60Fe65 está enriquecida no cérebro e os seus níveis aumentam durante a diferenciação neuronal de células PC12, evidenciando o potencial papel que poderá desempenhar na patologia da DA. A RanBP9 é uma proteína nuclear e citoplasmática envolvida em diversas vias de sinalização celulares. Neste trabalho caracterizou-se a nova interação entre a RanBP9 e o AICD, que pode ser regulada pela fosforilação da Tyr-687. Adicionalmente, foi identificada uma nova interação entre a RanBP9 e a acetiltransferase de histonas Tip60. Demonstrou-se ainda que a RanBP9 tem um efeito de regulação inibitório na transcrição mediada por AICD, através da interação com a Tip60, afastando o AICD dos locais de transcrição ativos. O estudo do interactoma da APP/AICD, modelado pela fosforilação da Tyr-687, revela que a APP poderá estar envolvida em novas vias celulares, contribuindo não só para o conhecimento do papel fisiológico da APP, como também auxilia a revelar as vias que levam à agregação de Aβ e neurodegeneração. A potencial relevância deste trabalho relaciona-se com a descoberta de algumas interações proteicas/vias de sinalização que podem que podem ser relevantes para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas na DA.

Beyond the artefact and techno-centricity: towards process-centric understanding of architecture - alternative facilitation strategies and proposals

The artefact and techno-centricity of the research into the architecture process needs to be counterbalanced by other approaches. An increasing amount of information is collected and used in the process, resulting in challenges related to information and knowledge management, as this research evidences through interviews with practicing architects. However, emerging technologies are expected to resolve many of the traditional challenges, opening up new avenues for research. This research suggests that among them novel techniques addressing how architects interact with project information, especially that indirectly related to the artefacts, and tools which better address the social nature of work, notably communication between participants, become a higher priority. In the fields associated with the Human Computer Interaction generic solutions still frequently prevail, whereas it appears that specific alternative approaches would be particularly in demand for the dynamic and context dependent design process. This research identifies an opportunity for a process-centric and integrative approach for architectural practice and proposes an information management and communication software application, developed for the needs discovered in close collaboration with architects. Departing from the architects’ challenges, an information management software application, Mneme, was designed and developed until a working prototype. It proposes the use of visualizations as an interface to provide an overview of the process, facilitate project information retrieval and access, and visualize relationships between the pieces of information. Challenges with communication about visual content, such as images and 3D files, led to a development of a communication feature allowing discussions attached to any file format and searchable from a database. Based on the architects testing the prototype and literature recognizing the subjective side of usability, this thesis argues that visualizations, even 3D visualizations, present potential as an interface for information management in the architecture process. The architects confirmed that Mneme allowed them to have a better project overview, to easier locate heterogeneous content, and provided context for the project information. Communication feature in Mneme was seen to offer a lot of potential in design projects where diverse file formats are typically used. Through empirical understanding of the challenges in the architecture process, and through testing the resulting software proposal, this thesis suggests promising directions for future research into the architecture and design process.