Ecotoxicological evaluation of pesticide mixtures

Neste trabalho o risco da aplicação de moluscicidas (metaldeído e metiocarbe) para o isópode terrestre Porcellionides pruinosus foi avaliado usando como parâmetros a mortalidade e biomarcadores de exposição. O tempo até à morte dos isópodes (após contacto com os moluscicidas) foi muito curto, especialmente no caso da exposição ao metiocarbe. Os vários biomarcadores revelaram-se úteis para a compreensão do modo de acção dos dois moluscicidas neste isópode, particularmente o efeito do carbamato metiocarbe na inibição da enzima acetilcolinesterase (AChE). Os efeitos de combinações binárias de três produtos de protecção das plantas (PPP) dimetoato, glifosato e espirodiclofeno foram avaliados testando o comportamento de evitamento de P. pruinosus, o sucesso reprodutivo do colêmbolo Folsomia candida e o crescimento das plantas Brassica rapa e Triticum aestivum, usando os dois modelos de referência de concentração de adição (CA) e acção independente (IA). O modelo MIXTOX foi usado para avaliar possíveis desvios (devido a interacções entre os pesticidas) dos dois modelos de referência. Os resultados obtidos permitem constatar que estes PPP quando aplicados segundo a dose recomendada não acarretam efeitos perniciosos para os organismos testados. Foi detectado sinergismo na mistura feita com glifosato e espirodiclofeno no isópode P. pruinosus e na mistura com glifosato e dimetoato na planta T. aestivum. Um ecossistema terrestre em pequena escala (“STEM”) foi desenvolvido, contendo um solo agrícola mediterrânico. Nestes STEM, minhocas (Eisenia andrei), P. pruinosus, B. rapa e “bait-lamina” foram incorporados no sentido de avaliar os efeitos da aplicação de dimetoato com espirodiclofeno e glifosato com dimetoato. A dose recomendada de aplicação dos PPP, quer na exposição individual quer nas misturas binárias não teve quaisquer efeitos nas espécies testadas. As minhocas foram sensíveis à aplicação conjunta de dimetoato com espirodiclofeno (10 vezes a dose recomendada) na sua distribuição vertical ao longo da coluna do STEM, e foi detectado sinergismo (i.e. mais minhocas escaparam do que a predição feita pelo modelo IA). Em todas as misturas binárias feitas com glifosato e dimetoato registou-se um decréscimo no consumo de “bait-lamina”, indicando sinergismo (menos “bait-lamina” consumidos que o esperado). Dos quatro biomarcadores (Catalase, AChE, GST e LPO) avaliados nos isópodes, verificaram-se diferenças significativas na actividade da enzima AChE (quando dimetoato foi aplicado no solo) e LPO (aumento da actividade devido à aplicação de glifosato e dimetoato).

Soil function and biodiversity: regional variations and climate changes

Embora o objetivo principal da proteção internacional dos solos seja proteger tanto as funções quanto a estrutura do solo, a atual abordagem trata principalmente da proteção ao nível estrutural. Há uma carência de estudos que contemplem a ligação das funções do solo com os níveis da comunidade. Além disso, é ainda desconhecido se as variáveis ambientais (ex: tipos de solo, condições climáticas) atuam nas funções do solo da mesma maneira que influenciam sua estrutura biológica. Ademais, as alterações climáticas poderão ter sozinhas ou combinadas com os poluentes, um grande efeito nos ecossistemas terrestres. O presente trabalho propõe estudar as funções e a estrutura biológica do solo quando impactados devido a estresse tóxico (poluição por Cu) e/ou alterações a fatores como a temperatura e abundância de organismos, de maneira a simular possíveis variações regionais ou climáticas. Para alcançar os objetivos principais 3 experiências utilizando diferentes densidades de E. crypticus e 2 gerações foram feitas (Capítulos II e III). Duas experiências com mesocosmos (SMS) decorreram durante 3 meses sob uma gama de diversas temperaturas (10 – 29°C), que representam temperaturas médias para Portugal e Dinamarca (Capítulos IV e V). Duas experiências de campo também foram realizadas com intuito de validar os SMSs (Capítulo VI). Resultados demonstraram que os efeitos do Cu na reprodução dos enquitraídeos dependem da densidade inicial de organismos, especialmente na 2ª geração. Entretanto, nos SMSs expostos a Cu, a densidade inicial é menos importante nos resultados finais. O aumento da temperatura alterou majoritariamente a fase inicial de crescimento populacional. Em períodos mais longos, a abundância estabilizou tornando-se menos influenciada pelas temperaturas. Períodos longos de exposição reforçaram os efeitos da temperatura, como por ex: diversas espécies foram similarmente afetadas a 29 ou 26°C quando expostas durante 28 ou 61 dias respectivamente. De forma geral, o Cu reduziu a abundância da maioria das espécies ao longo do tempo, com poucas exceções. Os resultados da decomposição da matéria orgânica (MO) e atividade alimentar associaram-se com a abundância de organismos em baixas temperaturas (10-23°C). Entretanto, com o aumento das temperaturas (19-29°C), este comportamento não foi claro e a abundância de espécies e atividade alimentar diminuíram enquanto a decomposição da MO aumentou. Além disso, os resultados observados nos SMSs foram confirmados no campo. Mais especificamente, alterações ocorreram na fase de crescimento (correspondente à Primavera) e a exposição ao Cu diminuiu os efeitos da temperatura. Metodologias mais complexas (ex: mais gerações e experiências com múltiplas espécies) apresentam muitos benefícios, mas também proporcionam respostas mais complexas, as quais exigem um maior “peso” de evidências para serem comprovadas.

Potential of incorporating ocean currents in fishing vessels

The fishing sector has been suffering a strong setback, with reduction in fishing stocks and more recently with the reduction of the fishing fleet. One of the most important factors for this decrease, is related to the continuous difficulty to find fish with quality and quantity, allowing the sector work constantly all year long. However other factors are affecting negatively the fishing sector, in particular the huge maintenance costs of the ships and the high diary costs that are necessary for daily work of each vessel. One of the main costs associated with daily work, is the fuel consumption. As an example, one boat with 30 meters working around 17 hours every day, consumes 2500 liters of fuel/day. This value is very high taking into account the productivity of the sector. Supporting this premise was developed a project with the aim of reducing fuel consumption in fishing vessels. The project calls “ShipTrack” and aims the use of forecasts of ocean currents in the routes of the ships. The objective involves the use of ocean currents in favor, and avoiding ocean currents against, taking into account the course of the ship, in order to reduce fuel consumption and increase the ship speed. The methodology used underwent the creation of specific Software, in order to optimize routes, taking into account the forecasts of the ocean currents. These forecasts are performed using numerical modelling, methodology that become more and more important in all communities, because through the modeling, it can be analyzed, verified and predicted important phenomena to all the terrestrial ecosystem. The objective was the creation of Software, however its development was not completed, so it was necessary a new approach in order to verify the influence of the ocean currents in the navigation of the fishing ship "Cruz de Malta". In this new approach, and during the various ship routes it was gathering a constant information about the instant speed, instantaneous fuel consumption, the state of the ocean currents along the course of the ship, among other factors. After 4 sea travels and many routes analyzed, it was possible to verify the influence of the ocean currents in the Ship speed and in fuel consumption. For example, in many stages of the sea travels it was possible to verify an increase in speed in zones where the ocean currents are in favor to the ships movements. This incorporation of new data inside the fishing industry, was seen positively by his players, which encourages new developments in this industry.

Endocrine disruption in the terrestrial isopod porcellio scaber

Nas últimas décadas tem-se assistido a uma preocupação crescente relativamente às possíveis consequências da exposição a compostosxenóbioticos capazes de modular ou causar disrupção do sistema endócrino, os denominados Compostos Disruptores Endócrinos (CDEs). A maioria dos estudos efectuados tem-se centrado principalmente nos efeitos dos CDEs em vertebrados, enquanto que os seus efeitos em invertebrados têmsido negligenciados, embora este grupo represente mais de 95% de todas asespécies animais. Isópodes como o Porcellio scaber, combinam características associadas às mudas e aos processos reprodutivos mediados por mecanismos endócrinosconhecidos com um modo de vida terrestre, tornando-os potenciais espécies sentinela para estudos de disrupção endócrina (DE) em ambientes terrestres. Neste estudo, isópodes machos adultos, machos e fêmeas juvenis e casais foram expostos a concentrações crescentes dedois CDEs, vinclozolina (Vz) e bisfenol A (BPA). Testou-se a hipótese nula que a Vz e o BPA não interferem com o desenvolvimento e reprodução deste isópode terrestre. Foi investigadaa possível ligação entre os efeitos causados pelos compostos propostos e DE assim como a ligação a outros potenciais mecanismos de toxicidade.Parâmetros como concentração de 20-hidroxiecdisona (20E), muda, crescimento, rácios sexuais ediversos parâmetros reprodutivos foram estudados. Adicionalmente, de modo a estudar os alvos moleculares destes tóxicos, analisou-se a expressão proteica do intestino, hepatopâncreas e testículos do isópode após exposição aos químicos. Os resultados demonstram que a Vz e o BPA estimulam o aumento dos níveis de 20E de um modo dependente da dose. Excepção feita para a concentração mais baixa de BPA testada (10 mg/kg solo), para a qual concentrações significativamente mais altas de 20E foram determinadas, sugerindo a ocorrência dos “efeitos de baixas doses típicos de DE” já demonstrados por outros autores. O BPA também distorceu o rácio sexual favorecendo asfêmeas na concentração mais baixa. A mortalidade devido à ecdise incompleta foi relacionada com o hiper-ecdisonismo nas concentrações mais elevadas de Vz. Mais ainda, a Vz tende a atrasar a muda e o BPA a induzi-la. Não obstante, ambos os compostos provocam toxicidade no desenvolvimento,uma vez que foi encontrada uma diminuição generalizada nos parâmetros de crescimento. Os juvenis mostraram ser mais sensíveis à exposição aos tóxicos que os adultos. Estes compostos provocaram ainda toxicidade reprodutiva, com um decréscimo generalizado do “output” reprodutivo. A toxicidadecausada pelos ecdisteróides e o seu papel na síntese de vitelogenina são alguns dos factores chave que poderão influenciar negativamente a reprodução.A Vz e o BPA afectaram a expressão de proteínas envolvidas nometabolismo energético e induziram várias respostas de stress. Interferiram ainda com proteínas intimamente ligadas com o sucesso reprodutivo. Conclui-se assim,que ambos os CDEs propostos provocam toxicidade nodesenvolvimento e na reprodução de P. scaber, tendo sido evidenciada umaligação a DE. Alvos moleculares de natureza não-endócrina foram também revelados, através da expressão diferencial de algumas proteínaspreviamente descritas para invertebrados aquáticos e mesmo alguns vertebrados.

Influence of speciation in the bioavailability of cadmium to an isopod

Devido às actividades antropogénicas várias substâncias químicas têm sido introduzidas no meio ambiente em concentrações que de outro modo não ocorreriam de forma tão elevada naturalmente. Assim, o conhecimento acerca das características de um químico, tais como, o potencial para se acumular em diferentes níveis tróficos, a sua mobilidade dentro do ecossistema, a toxicidade específica e a bioacumulação, é fundamental para compreender os seus efeitos nos ecossistemas. Esta tese investiga a influência de especiação, na biodisponibilidade do cádmio (Cd) para o isópode Porcellio dilatatus, incluindo os efeitos de especiação do metal: (i) na assimilação do Cd, (ii) no modo como o Cd se distribui internamente no organismo, e (iii) como a sobrevivência e a reprodução são afectadas em isópodes terrestres. Num primeiro ensaio laboratorial avaliou-se a importância da transferência trófica na assimilação do Cd em P. dilatatus. Para tal analisou-se a eficiência de assimilação (EA) do Cd em isópodes, adicionado superficialmente ao alimento (alface) na forma de Cd(NO3)2 e contaminando o meio de crescimento da alface. A hipótese era de que a alface contaminada biologicamente através do cultivo em meio hidropónico contaminado teria uma maior proporção de complexos com proteína ou conjugado na forma de Cd (ex. Cd cisteína). A EA de Cd foi maior entre os isópodes que foram alimentados com o sal (71%, SE = 7%), do que entre os isópodes que se alimentaram de alface contaminada biologicamente (52%, SE = 5%), demonstrando-se assim num teste laboratorial que é provável que a especiação do Cd influencie a taxa de assimilação e acumulação do Cd. Na experiência alimentar que se seguiu, estudou-se em detalhe a especiação do metal comparando as EA do Cd conjugado com cisteína (Cd(Cys)2) e na forma de Cd(NO3)2, com os quais se contaminou gelatina com alface. A utilização de Cd-cisteína, proporcionou uma forma experimental para explorar a biodisponibilidade do Cd complexado dentro do tecido biológico. Como esperado, a EA de Cd em isópodes alimentados com nitrato de Cd (64%, SE = 5%) foi maior do que no caso de isópodes alimentados com o conjugado de cisteína (20%, SE = 3%). De seguida estudou-se a distribuição subcelular das espécies de Cd assimilado através de um processo de fraccionamento. Supunha-se que as diferenças de especiação de Cd reflectiria diferentes estratégias de compartimentalização, com consequências ao nível da detoxificação, armazenamento celular e distribuição subcelular do metal. O “sequestro” na forma de metal biologicamente detoxificado (BDM = proteínas estáveis ao calor - HSP e grânulos ricos em metal - RMG) foi maior nos isópodes alimentados com Cd(NO3)2, sugerindo que são mais eficientes na detoxificação de Cd (22%) do que quando alimentados com Cd(Cys)2 (15%). Foi também demonstrado que os isópodes alimentados com Cd(Cys)2 possuíam níveis de armazenamento de Cd superior nas fracções sensíveis ao metal (MSF = organelos e proteínas desnaturadas pelo calor - HDP) consideradas fracções potencialmente vulneráveis e afectando os isópodes em termos de toxicidade. As diferentes distribuições internas que se seguiram à assimilação e detoxificação das diferentes espécies de Cd foram finalmente avaliadas em termos da sobrevivência e reprodução dos isópodes. O tratamento com Cd(Cys)2 teve maior mortalidade, provavelmente devido à maior disponibilidade de Cd ingerido com implicações ao nível dos processos fisiológicos. Os isópodes alimentados com Cd(NO3)2 armazenaram o Cd nos MRG, como estratégia de detoxificação, sendo mais eficientes a detoxificar o Cd ainda que aumentando a concentração total do metal que se tornou menos tóxico para o isópode. Desta forma, o Cd nos grânulos não estava disponível para os processos fisiológicos e deixou de ser tóxico. Isso poderia estar relacionado com a resistência e tolerância aos metais devido à capacidade dos isópodes compartimentalizarem o Cd no hepatopâncreas, que actua como um mecanismo de detoxificação e contribui para a tolerância a altos níveis de cádmio. Em termos de parâmetros reprodutivos, observou-se uma redução de gestações e duração da gestação na presença de ambas as espécies de metal, mas no caso do Cd(Cys)2 as gravidezes não se concluíram. O número de jovens produzido por fêmeas alimentadas com Cd(NO3)2 foi menor do que no controlo, mas os pesos dos juvenis foram superiores. Finalmente sugere-se assim que esta abordagem seja considerada em estudos do movimento trófico de metais nas cadeias alimentares dado que se espera que a especiação de metais implique diferentes fluxos, dentro de uma dada cadeia trófica.

Effect assessment of nanoparticles toxicity in the terrestrial compartment

Over 11 million tons of nanomaterials (NMs) have been produced in 2012 and predictions point the increase in production. Despite predictions and extended usage via consumer products and industry, the understanding of the potential impact of these materials on the environment is virtually absent. The main aim of this thesis is to understand how a selected group of nanomaterials (metal based particles) may impact soil invertebrates, with special focus on the mechanisms of response. Since a case-by-case Environmental Risk Assessment (ERA) of all the emerging contaminants (particularly NMs) is impossible, among others due to time and cost reasons, to gain understanding on the mechanism of action and response is very important to reach a common paradigm. Understanding the modes of action provides predictive characters in cross particle extrapolation. Besides, it also provides insight for the production of new and sustainable materials. Overall, the effects of the selected NMs (Copper and Silver, Titanium and Zirconium oxides) and the respective salt forms, were investigated at the gene expression (using high-throughput tools, microarray and qPCR technology), biochemical (using enzymatic assays for analysis of oxidative stress markers) and organism (survival and reproduction as in OECD test guidelines) levels, this using standard soil species (Enchytraeus albidus, Enchytraeus crypticus, Eisenia fetida). Gene expression analysis provided valuable information on the mechanisms affected by each of the NMs. The gene expression profile highlighted a (nano)material signature and the effect of the duration of exposure. The functional analyses integrated with the biochemical and organism data, revealed a good understanding power. The biochemical parameters (oxidative stress related) were distinct across the materials and also influenced by duration of exposure and concentration. The standardized organismal responses differed the least between the various materials. The overall outcome is that, in this context of NMs effect assessment, gene expression and enzymatic assays introduced a very important knowledge gap, which could not had been achieved by the standard organismal effects alone. A reoccurring issue with some metal based NMs is the possible dissolution and subsequent release of ions that then causes toxicity e.g. Cu-NPs or Ag-NPs release Cu2+ or Ag+. The oxidation state of the particles was investigated, although this was not the focus of the thesis. The study of fate, e.g. dissolution of NPs, is also only in its beginning and the appropriate techniques are currently being developed. The results showed a specific nanoparticle effect. The UV exposure with titanium dioxide nanoparticles increased its effect.

Environmental factors, clipping and fire: effects on cerrado (Brazilian savanna) native and invasive grasses

The Brazilian Cerrado houses a hugely diverse biota and is considered a conservation hotspot. One of the greatest threats to the integrity of this ecosystem is introduced African grasses, which can competitively exclude native grasses and cause changes in the microclimate and other disturbances. The Cerrado is a mosaic vegetation that provides different combinations, both spatially and temporally, of conditions that can become natural stressors to the herbaceous vegetation (water, nutrient and light availability). These mosaics are reflected in differences in relationships among native and invasive species, affecting competition and creating situations (place/season) that are more, or less, susceptible to invasion. The present study aimed to identify the different biological responses of native (Aristida recurvata, Aristida setifolia, Axonopus barbigerus, Echinolaena inflexa, Gymnopogon spicatus, Paspalum gardnerianum, Paspalum stellatum, Schizachyrium microstachyum, Schizachyrium sanguineum) and invasive (Melinis minutiflora and Andropogon gayanus) grasses to variations in natural stressors and to disturbance (fire and clipping), in order to understand changes in ecosystem functioning and competition processes between the grasses, and to understand invasion dynamics in this ecosystem. The presence of invasive species proved to affect the ecosystem functioning by increasing soil feeding activity. These differences were no longer observed in the dry season or when fires were frequent, showing that water availability and fire are more detrimental to soil feeding activity than is the vegetation. Laboratory experiments showed that both drought and flood simulated scenarios damaged both species, although the invasive species performed better under all watering conditions and responded better to fertilization. Underlying mechanisms such as the efficiency of photosynthesis and antioxidant mechanisms helped to explain this behavior. The invasive species grew faster and showed less cellular damage and a healthier photosystem, reflected in higher assimilation rates under stress. These differences between the native and invasive species were reduced with clipping, especially in dry soil with no fertilization, where the native species recovered better in relation to the pre-clipping levels. Flooding was as stressful as drought, but the invasive species can bypass this issue by growing an extensive root system, especially in the better-drained soils. Fire is more detrimental than clipping, with a slower recovery, while post-fire temperatures affect the germination of both invasive and native seeds and may be an important factor influencing the persistence of a diverse biota. This approach will finally contribute to the choice of the appropriate management techniques to preserve the Cerrado’s biodiversity.

Single and joint effects of natural and chemical stressors to the terrestrial isopod Porcellionides pruinosus

Environmental contamination and climate changes constitute two of the most serious problems affecting soil ecosystems in agricultural fields. Agriculture is nowadays a highly optimized process that strongly relies on the application of multiple pesticides to reduce losses and increase yield production. Although constituting, per se, a serious problem to soil biota, pesticide mixtures can assume an even higher relevance in a context of unfavourable environmental conditions. Surprisingly, frameworks currently established for environmental risk assessments keep not considering environmental stressors, such as temperature, soil moisture or UV radiation, as factors liable to influence the susceptibility of organisms to pesticides, or pesticide mixtures, which is raising increasing apprehension regarding their adequacy to actually estimate the risks posed by these compounds to the environment. Albeit the higher attention received on the last few years, the influence of environmental stressors on the behaviour and toxicity of chemical mixtures remains still poorly understood. Aiming to contribute for this discussion, the main goal of the present thesis was to evaluate the single and joint effects of natural stressors and pesticides to the terrestrial isopod Porcellionides pruinosus. The first approach consisted on evaluating the effects of several abiotic factors (temperature, soil moisture and UV radiation) on the performance of P. pruinosus using several endpoints: survival, feeding parameters, locomotor activity and avoidance behaviour. Results showed that these stressors might indeed affect P. pruinosus at relevant environmental conditions, thus suggesting the relevance of their consideration in ecotoxicological assays. At next, a multiple biomarker approach was used to have a closer insight into the pathways of damage of UV radiation and a broad spectrum of processes showed to be involved (i.e. oxidative stress, neurotoxicity, energy). Furthermore, UV effects showed to vary with the environment medium and growth-stage. A similar biomarker approach was employed to assess the single and joint effects of the pesticides chlorpyrifos and mancozeb to P. pruinosus. Energy-related biomarkers showed to be the most differentiating parameters since age-classes seemed to respond differently to contamination stress and to have different metabolic costs associated. Finally, the influence of temperature and soil moisture on the toxicity of pesticide mixtures was evaluated using survival and feeding parameters as endpoints. Pesticide-induced mortality was found to be oppositely affected by temperature, either in single or mixture treatments. Whereas chlorpyrifos acute toxicity was raised under higher temperatures the toxicity of mancozeb was more prominent at lower temperatures. By the opposite, soil moisture showed no effects on the pesticide-induced mortality of isopods. Contrary to survival, both temperature and soil moisture showed to interact with pesticides to influence isopods’ feeding parameters. Nonetheless, was however the most common pattern. In brief, findings reported on this thesis demonstrated why the negligence of natural stressors, or multiple stressors in general, is not a good solution for risk assessment frameworks.