Ultrastructure and phylogeny of peridinioid dinoflagellates

Os dinoflagelados são um grupo muito diverso de protistas que possuem um conjunto de características pouco comuns. Os peridinióides são dinoflagelados com teca que é formada por seis séries latitudinais de placas, incluindo a série cingular e um anel incompleto de placas intercalares anteriores, embora as últimas estejam ausentes em algumas espécies de Peridiniopsis. São dinoflagelados com simetria bilateral em relação ao plano apical que contem o eixo dorso-ventral. Na série sulcal há apenas uma placa posterior que contacta com o limite ventral de duas grandes placas antapicais. Entre os peridinióides, a presença ou ausência de um poro apical e o número de placas no cíngulo são geralmente consideradas marcas filogenéticas importantes ao nível de género ou família. Actualmente, a definição de Peridinium Ehrenberg, o dinoflagelado mais comum de água doce, inclui organismos com combinações diferentes destas duas características. Trabalhos anteriores sobre a ultrastrutura e afinidade filogenética das espécies tipo de Peridinium, P. cinctum, e Peridiniopsis Lemmermann, P. borgei também sugerem a necessidade de reexaminar as relações taxonómicas dos peridinióides. Esta tese combina o estudo ultrastrutural de uma selecção de espécies com hipóteses filogenéticas baseadas nas sequências de LSU rDNA, para aumentar o nosso conhecimento das diferenças e afinidades dentro dos peridinióides. Tem como objectivo aumentar o nosso conhecimento das características individuais das células que possam levar a reconhecer sinapomorfias que possam ser usadas como marcadores dos peridinióides como um todo e dos seus subgrupos. As espécies escolhidas para exame pormenorizado foram: Peridinium palatinum Lauterborn, de um grupo com duas placas intercalares anteriores, seis placas cingulares e sem poro apical; Peridinium lomnickii Wo!oszy"ska, de um grupo com poro apical, três placas intercalares e seis cingulares; Peridiniopsis berolinensis (Lemmermann) Bourrelly, uma espécie heterotrófica com poro apical, sem placas intercalares e com seis placas cingulares; e Sphaerodinium cracoviense Wo!oszy"ska, um membro de um género de formas com teca com um tipo de tabulação marginalmente peridinióide, com um suposto poro apical e quatro placas intercalares anteriores. Peridinium palatinum difere de Peridinium e Peridiniopsis típicos, quer em características da teca, quer internas. As diferenças estimadas entre as sequências parciais de LSU rDNA de P. palatinum e a espécie próxima P. pseudolaeve, relativamente a P. cinctum são comparativamente grandes e, juntamente com a topologia da árvore filogenética, apoiam a separação de P. palatinum e formas próximas ao nível de género. Palatinus nov. gen. foi, então, descrito com as novas combinações Palatinus apiculatus nov. comb. (espécie tipo; sin. Peridinium palatinum), P. apiculatus var. laevis nov. comb. e P. pseudolaevis nov. comb.. As características distintivas de Palatinus incluem uma superfície das placas lisa ou um tanto granulosa, mas não areolada, um grande pirenóide central penetrado por canais citoplasmáticos e de onde radiam lobos plastidiais, e a presença de uma fiada microtubular homóloga à de um pedúnculo. As células de Palatinus saem da teca pela zona antapicalpos- cingular. Peridinium lomnickii apresenta tabulação semelhante às formas marinhas, produtoras de quistos calcários, do género Scrippsiella A.R. Loeblich. Para comparação, adicionámos novas observações ultrastruturais de S. trochoidea. Peridinium lomnickii tem uma combinação de características diferente de Peridinium, Peridiniopsis e Scrippsiella. As hipóteses filogenéticas baseadas em DNA colocam P. lomnickii no mesmo ramo que Pfiesteria Steidinger et Burkholder, Tyrannodinium e outras Pfiesteriaceae, com as quais partilha um "microtubular basket" e uma ligação peculiar entre duas placas do sulco. As características distintivas do novo género proposto Chimonodinium gen. ined. incluem, além da tabulação, a ausência de pirenóides, a presença de um "microtubular basket" com quatro ou cinco fiadas sobrepostas de microtúbulos associados a um pequeno pedúnculo, um sistema pusular com tubos pusulares bem definidos ligados aos canais flagelares, e a produção de quistos não calcários. Peridiniopsis berolinensis partilha várias características significativas com Pfiesteria e afins, como um "microtubular basket" com a capacidade de suportar um tubo de alimentação, quimiossensibilidade para encontrar presas apropriadas, o modo de natação junto às presas e a organização geral da célula. Hipóteses filogenéticas com base em LSU rDNA confirmam a afinidade entre P. berolinensis e Pfiesteria bem como a relação mais remota com a espécie tipo de Peridiniopsis, P. borgei. Estas razões justificam a proposta de Tyrannodinium gen. nov., uma nova Pfiesteriaceae que difere de outros membros do grupo por viver em água doce e nos pormenores da tabulação. Sphaerodinium cracoviense revelou a tabulação típica do género Sphaerodinium, que apresenta um número de placas intercalares superiores e pos-cingulares maior que o que é típico em peridinióides: 4 e 6, respectivamente. Observações em SEM mostraram uma estrutura apical diferente da dos peridinióides, e um sulco apical numa das placas fazendo lembrar a área apical de alguns woloszynskióides. Os pormenores do aparelho flagelar e do sistema pusular ligam o Sphaerodinium aos woloszynskióides em geral e ao género Baldinia em particular, mas não aos peridinióides. O volumoso estigma de S. cracoviense revelou ser extraplastidial e de um modelo único, composto por elementos que se encontram em woloszynskióides, mas nunca encontrados anteriormente juntos. A análise filogenética baseada nas sequências parciais de LSU rDNA também sugerem uma maior proximidade de S. cracoviense com os woloszynskióides do que com os peridinióides. Futuras análises pormenorizadas de dinoflagelados peridinióides, em especial entre os do numeroso grupo de espécies com poro apical, serão necessárias para clarificar as suas relações taxonómicas; e a produção de descrições melhoradas das características finas particulares das células serão um requisito para perceber a evolução dos caracteres dos peridinióides por forma a podermos identificar marcadores filogenéticos.

Extracção supercrítica de óleo de grainha de uva combinada com pré-tratamentos enzimáticos

Neste trabalho estudou-se a extracção supercrítica do óleo de grainha de uva, usando dióxido de carbono, e combinou-se este processo com um prétratamento enzimático da semente para aumentar o rendimento global da extracção. A qualidade dos extractos obtidos foi avaliada pelo seu conteúdo em triacilglicerídeos, perfil de ácidos gordos e capacidade antioxidante. Realizaram-se também alguns estudos exploratórios sobre a aplicação de um pré-tratamento de alta pressão (HPP) à grainha da uva. Adicionalmente, efectuou-se o estudo da extracção, fraccionamento e caracterização estrutural das procianidinas da grainha da uva, bem como a avaliação da sua capacidade antioxidante. A extracção de procianidinas da grainha da uva foi efectuada sequencialmente com metanol e acetona/água, tendo sido posteriormente fraccionadas por adição sucessiva de misturas metanol/clorofórmio progressivamente mais concentradas em clorofórmio. A caracterização das procianidinas foi feita por HPLC-UV e LC–MS, antes e depois de sujeitar as amostras a uma tiólise, e também por ESI-MS e ESI-MS/MS. Este estudo permitiu reportar, pela primeira vez, a ocorrência de procianidinas do tipo-A galoiladas na grainha da uva. Os resultados de HPLC-UV permitiram determinar o grau médio de polimerização das procianidinas e a sua composição monomérica em (+)- catequina, (-)-epicatequina e (-)-epicatequina-O-galato. Mostrou-se que a (+)- catequina é o flavan-3-ol terminal mais abundante e a (-)-epicatequina predomina largamente como unidade de extensão. No caso de procianidinas do tipo A, a ligação interflavânica C2-C7 encontra-se essencialmente nas unidades terminais. O grau médio de polimerização das diversas fracções varia entre 1.0 e 10.8. A sua capacidade antioxidante, medida pelo método espectrofotométrico de DPPH•, mostrou-se ser equivalente à de uma amostra comercial de (+)-catequina usada como referência. A partir dos graus médios de polimerização experimentais e das análises de FTIR das fracções correspondentes foi possível obter um modelo preditivo O-PLS com apenas uma variável latente. O pré-tratamento enzimático justificou-se pelo conhecimento existente acerca do uso de enzimas específicas que destroem parcialmente as paredes celulares. Atendendo à composição das paredes celulares da grainha da uva preparou-se uma suspensão contendo protease, xilanase, pectinase e celulase. Para determinar as condições experimentais do pré-tratamento que maximizam o rendimento da extracção, estudou-se o efeito do tempo de reacção, temperatura, pH, diâmetro médio das partículas de grainha moída e a concentração das enzimas. Os incrementos do rendimento da extracção de óleo observados atingiram 163.2%. O estudo da extracção supercrítica (SFE) do óleo da grainha de uva tratada e não-tratada permitiu obter as curvas de extracção correspondentes, bem com analisar a influência das condições operatórias sobre o seu andamento. Montou-se uma instalação laboratorial onde se realizaram experiências com dióxido de carbono a 160, 180, 200 e 220 bar e temperaturas de 313.15 e 323.15 K. Os rendimentos obtidos por SFE foram semelhantes aos de Soxhlet com n-hexano. As curvas de extracção medidas compreendem um primeiro período de extracção, onde se remove cerca de 92-97% do óleo disponível, e um segundo período, essencialmente difusional, com pouco impacto no rendimento final. Os vários extractos recolhidos e o óleo global obtido foram caracterizados para avaliar a sua qualidade e relacioná-la com as condições operatórias de SFE. Determinaram-se o conteúdo total em triacilglicerídeos, o seu perfil de ácidos gordos e a capacidade antioxidante (AOC). Os resultados mostraram que a AOC aumenta com a elevação da pressão e, acentuadamente, com o acréscimo da temperatura. Ao longo da curva de extracção, a AOC é mais pronunciada nos extractos iniciais, nomeadamente nos primeiros 30 a 40% da extracção. A modelação efectuada considerou que o óleo extractável se reparte entre células rompidas, predominantes na periferia da semente, e células intactas, mais interiores. Admitiu-se que o transporte de massa ocorre em série, i.e. das células intactas para as rompidas e destas para o solvente; mostrou-se que a dispersão axial era desprezável. Os balanços materiais à fase fluida e aos volumes de células rompidas e intactas, combinados com os fluxos interno, externo e a relação de equilíbrio foram resolvidos numericamente pelo método das linhas combinado com diferenças finitas atrasadas. O modelo reproduziu bem as curvas experimentais e permitiu simular curvas de eluição e os três perfis de concentração no leito.

Treatment of natural gas streams with ionic liquids

Being of high relevance for many technological applications, the solubility of sour gases in solvents of low volatility is still poorly described and understood. Aiming at purifying natural gas streams, the present work contributes for a more detailed knowledge and better understanding of the solubility of sour gases in these fluids, in particularly on ionic liquids. A new apparatus, developed and validated specially for phase equilibria studies of this type of systems, allowed the study of the solvent basicity, molecular weight and polarity influence on the absorption of carbon dioxide and methane. The non ideality of carbon dioxide solutions in ionic liquids and other low volatile solvents, with which carbon dioxide is known to form electron donor-acceptor complexes, is discussed, allowing the development of a correlation able to describe the carbon dioxide solubility in low volatile solvents. Furthermore, the non ideality of solutions of light compounds, such as SO2, NH3 and H2S, in ionic liquids is also investigated and shown to present negative deviations to the ideality in the liquid phase, that can be predicted by the Flory-Huggins model. For last, the effect of the ionic liquid polarity, described through the Kamlet-Taft parameters, on the CO2/CH4 and H2S/CH4 selectivities is also evaluated and shown to stand as a viable tool for the selection of ionic liquids with enhanced selectivities.

Mitochondrial plasticity in pathophysiological conditions

Both skeletal and cardiac muscles daily burn tremendous amounts of ATP to meet the energy requirements for contraction. So, it is not surprising that the maintenance of mitochondrial morphology, number, distribution and functionality in striated muscle are important for muscle homeostasis. In these tissues mitochondria present the added dimension of two populations, the intermyofibrillar (IMF) and the subsarcolemmal (SS) mitochondria, being IMF the most abundant one. In the present thesis, the molecular mechanisms harboured in mitochondria of striated muscles were studied using animal models, to better comprehend the role of mitochondrial plasticity in several pathophysiological conditions such as aging, diabetes mellitus and bladder cancer. The comparative analysis of IMF and SS populations isolated from heart evidenced a higher respiratory chain activity of mitochondria interspersed in the contractile apparatus. The higher susceptible of SS respiratory chain complexes subunits to carbonylation, but not to nitration, seems to justify the lower respiratory chain activity observed in this mitochondrial population. Our results showed that in heart from aged mice there is an accumulation of dysfunctional mitochondria. The age-related decrease of oxidative phosphorylation activity seems to be justified, at least partially, by the increased proneness of mitochondrial proteins as OXPHOS subunits and MnSOD to oxidative modifications. Moreover, a sedentary lifestyle seems to worsen the functional consequences of aging in heart by increasing mitochondrial proteins susceptibility to nitration. In skeletal muscle from rats with type 1 diabetes mellitus induced by streptozotocin administration, we verified the accumulation of dysfunctional mitochondria due, at least in part, to the impairment of PQC system. Indeed, the decreased activity of AAA proteases was accompanied by the accumulation of oxidatively modified mitochondrial proteins with impact in respiratory chain activity. The diminishing of mitochondria activity also underlies cancer-induced muscle wasting. Indeed, using a rat model of chemically induced urothelial carcinoma we verified that the loss of gastrocnemius mass was related to mitochondrial dysfunction due to, at least partially, the down-regulation of PQC system involving the mitochondrial proteases paraplegin and Lon. PQC impairment resulted in the accumulation of oxidatively modified mitochondrial proteins. In overall, regardless the pathophysiological stimuli that promote mitochondrial alterations, there are similarities in the pattern of disease-related mitochondrial plasticity. The diminished capacity for ATP production in striated muscle seems to be due to increased oxidative damage of mitochondrial proteins, namely subunits of respiratory chain complexes, metabolic proteins and MnSOD. Our data highlighted, for the first time, the impact of mitochondrial PQC system impairment in the accumulation of oxidized proteins, exacerbating the dysfunction of this organelle in striated muscle in several pathophysiological conditions.