Methodologies for a sustainable development of estuarine ecosystems

As zonas costeiras, estuarinas e lagunares são consideradas áreas muito produtivas e dotadas de grande biodiversidade sendo, por isso, consideradas de elevado valor ecológico e económico. No entanto, nas últimas décadas tem vindo a verificar-se um aumento da contaminação destes ecossistemas como resultado de diversas actividades antrópicas. As abordagens actualmente disponíveis para avaliação do impacto da poluição em ecossistemas estuarinos e lagunares apresentam diversos tipos de lacunas, pelo que é importante desenvolver metodologias mais eficazes com organismos autóctones. Neste contexto, o objectivo central desta dissertação consistiu em desenvolver e validar métodos ecologicamente relevantes para avaliação da contaminação estuarina e dos seus efeitos, utilizando o góbio-comum (Pomatoschistus microps), quer como organismo-teste quer como espécie sentinela, devido à importante função que desempenha nas cadeias tróficas de diversos estuários da costa Portuguesa. A Ria de Aveiro foi seleccionada como área de estudo principalmente pelo facto de possuir zonas com diferentes tipos de contaminação predominante e de haver conhecimento científico de base abundante e de elevada qualidade sobre este ecosistema. Na primeira fase do estudo, foram investigados os efeitos agudos de dois hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) (benzo[a]pireno e antraceno), de um fuel-óleo e de dois metais (cobre e mercúrio) em P. microps, utilizando ensaios laboratoriais baseados em biomarcadores e em parâmetros comportamentais, os quais foram avaliados utilizando um dispositivo expressamente desenvolvido para o efeito, designado por speed performance device (SPEDE). Como biomarcadores foram utilizados parâmetros envolvidos em funções fisiológicas determinantes para a sobrevivência e desempenho dos animais (neurotransmissão, obtenção de energia, destoxificação e defesas anti-oxidantes), nomeadamente a actividade das enzimas acetilcolinesterase, lactato desidrogenase, CYP1A1, glutationa S-transferases, glutationa reductase, glutationa peroxidase, superóxido dismutase, catalase, tendo ainda sido determinados os níveis de peroxidação lipídica como indicador de danos oxidativos. De forma global, os resultados indicaram que os agentes e a mistura testados têm a capacidade de interferir com a função neurológica, de alterar as vias utilizadas para obtenção de energia celular, induzir as defesas antioxidantes e, no caso do cobre e do mercúrio, de causarem peroxidação lipídica. Foram ainda obtidas relações concentração-resposta a nível dos parâmetros comportamentais testados, nomeadamente a capacidade de nadar contra a corrente e a distância percorrida a nadar contra o fluxo de água, sugerindo que os agentes testados podem, por exemplo, diminuir a capacidade de fuga aos predadores, as probabilidades de captura de presas e o sucesso reprodutivo. Na segunda fase, tendo sido já adaptadas técnicas para determinação de vários biomarcadores em P. microps e estudada a sua resposta a dois grupos de poluentes particularmente relevantes em ecossistemas estuarinos e lagunares (metais e HAPs), foi efectuado um estudo de monitorização utilizando P. microps como bioindicador e que incluiu diversos parâmetros ecológicos e ecotoxicológicos, nomedamente: 20 parâmetros indicativos da qualidade da água e do sedimento, concentração de 9 metais em sedimentos e no corpo de P. microps, 8 biomarcadores e 2 índices de condição na espécie seleccionada. A amostragem foi efectuada em quatro locais da Ria de Aveiro, um considerado como referência (Barra) e três com diferentes tipos predominantes de contaminação (Vagueira, Porto de Aveiro e Cais do Bico), sazonalmente, durante um ano. Os resultados obtidos permitiram uma caracterização ecotoxicológica dos locais, incluindo informação sobre a qualidade da água, concentrações de contaminantes ambientais prioritários nos sedimentos e nos tecidos de P. microps, capacidade desta espécie para bioacumular metais, efeitos exercidos pelas complexas misturas de poluentes presentes em cada uma das zonas de amostragem nesta espécie e possíveis consequências para a população. A análise multivariada permitiu analisar de forma integrada todos os resultados, proporcionando informação que não poderia ser obtida analisando os dados de forma compartimentalizada. Em conclusão, os resultados obtidos no âmbito desta dissertação indicam que P. microps possui características adequadas para ser utilizado como organismoteste em ensaios laboratoriais (e.g. abundância, fácil manutenção, permite a determinação de diferentes tipos de critérios de efeito utilizando um número relativamente reduzido de animais, entre outras) e como organismo sentinela em estudos de monitorização da poluição e da qualidade ambiental, estando portanto de acordo com estudos de menor dimensão previamente efectuados. O trabalho desenvolvido permitiu ainda adaptar a P. microps diversas técnicas bioquímicas vulgarmente utilizadas como biomarcadores em Ecotoxicologia e validá-las quer no laboratório quer em cenários reais; desenvolver um novo bioensaio, utilizando um dispositivo de teste especialmente concebido para peixes epibentónicos baseado na performance natatória de uma espécie autóctone e em biomarcadores; relacionar os efeitos a nível bioquímico com parâmetros comportamentais que ao serem afectados podem reduzir de forma drástica e diversificada (e.g. aumento da mortalidade, diminuição do sucesso reprodutivo, redução do crescimento) a contribuição individual para a população. Finalmente, foi validada uma abordagem multidisciplinar, combinando metodologias ecológicas, ecotoxicológicas e químicas que, quando considerada de forma integrada utilizando análises de estatística multivariada, fornece informação científica da maior relevância susceptível de ser utilizada como suporte a medidas de conservação e gestão em estuários e sistemas lagunares.

Endocrine disruption in the terrestrial isopod porcellio scaber

Nas últimas décadas tem-se assistido a uma preocupação crescente relativamente às possíveis consequências da exposição a compostosxenóbioticos capazes de modular ou causar disrupção do sistema endócrino, os denominados Compostos Disruptores Endócrinos (CDEs). A maioria dos estudos efectuados tem-se centrado principalmente nos efeitos dos CDEs em vertebrados, enquanto que os seus efeitos em invertebrados têmsido negligenciados, embora este grupo represente mais de 95% de todas asespécies animais. Isópodes como o Porcellio scaber, combinam características associadas às mudas e aos processos reprodutivos mediados por mecanismos endócrinosconhecidos com um modo de vida terrestre, tornando-os potenciais espécies sentinela para estudos de disrupção endócrina (DE) em ambientes terrestres. Neste estudo, isópodes machos adultos, machos e fêmeas juvenis e casais foram expostos a concentrações crescentes dedois CDEs, vinclozolina (Vz) e bisfenol A (BPA). Testou-se a hipótese nula que a Vz e o BPA não interferem com o desenvolvimento e reprodução deste isópode terrestre. Foi investigadaa possível ligação entre os efeitos causados pelos compostos propostos e DE assim como a ligação a outros potenciais mecanismos de toxicidade.Parâmetros como concentração de 20-hidroxiecdisona (20E), muda, crescimento, rácios sexuais ediversos parâmetros reprodutivos foram estudados. Adicionalmente, de modo a estudar os alvos moleculares destes tóxicos, analisou-se a expressão proteica do intestino, hepatopâncreas e testículos do isópode após exposição aos químicos. Os resultados demonstram que a Vz e o BPA estimulam o aumento dos níveis de 20E de um modo dependente da dose. Excepção feita para a concentração mais baixa de BPA testada (10 mg/kg solo), para a qual concentrações significativamente mais altas de 20E foram determinadas, sugerindo a ocorrência dos “efeitos de baixas doses típicos de DE” já demonstrados por outros autores. O BPA também distorceu o rácio sexual favorecendo asfêmeas na concentração mais baixa. A mortalidade devido à ecdise incompleta foi relacionada com o hiper-ecdisonismo nas concentrações mais elevadas de Vz. Mais ainda, a Vz tende a atrasar a muda e o BPA a induzi-la. Não obstante, ambos os compostos provocam toxicidade no desenvolvimento,uma vez que foi encontrada uma diminuição generalizada nos parâmetros de crescimento. Os juvenis mostraram ser mais sensíveis à exposição aos tóxicos que os adultos. Estes compostos provocaram ainda toxicidade reprodutiva, com um decréscimo generalizado do “output” reprodutivo. A toxicidadecausada pelos ecdisteróides e o seu papel na síntese de vitelogenina são alguns dos factores chave que poderão influenciar negativamente a reprodução.A Vz e o BPA afectaram a expressão de proteínas envolvidas nometabolismo energético e induziram várias respostas de stress. Interferiram ainda com proteínas intimamente ligadas com o sucesso reprodutivo. Conclui-se assim,que ambos os CDEs propostos provocam toxicidade nodesenvolvimento e na reprodução de P. scaber, tendo sido evidenciada umaligação a DE. Alvos moleculares de natureza não-endócrina foram também revelados, através da expressão diferencial de algumas proteínaspreviamente descritas para invertebrados aquáticos e mesmo alguns vertebrados.

Influence of speciation in the bioavailability of cadmium to an isopod

Devido às actividades antropogénicas várias substâncias químicas têm sido introduzidas no meio ambiente em concentrações que de outro modo não ocorreriam de forma tão elevada naturalmente. Assim, o conhecimento acerca das características de um químico, tais como, o potencial para se acumular em diferentes níveis tróficos, a sua mobilidade dentro do ecossistema, a toxicidade específica e a bioacumulação, é fundamental para compreender os seus efeitos nos ecossistemas. Esta tese investiga a influência de especiação, na biodisponibilidade do cádmio (Cd) para o isópode Porcellio dilatatus, incluindo os efeitos de especiação do metal: (i) na assimilação do Cd, (ii) no modo como o Cd se distribui internamente no organismo, e (iii) como a sobrevivência e a reprodução são afectadas em isópodes terrestres. Num primeiro ensaio laboratorial avaliou-se a importância da transferência trófica na assimilação do Cd em P. dilatatus. Para tal analisou-se a eficiência de assimilação (EA) do Cd em isópodes, adicionado superficialmente ao alimento (alface) na forma de Cd(NO3)2 e contaminando o meio de crescimento da alface. A hipótese era de que a alface contaminada biologicamente através do cultivo em meio hidropónico contaminado teria uma maior proporção de complexos com proteína ou conjugado na forma de Cd (ex. Cd cisteína). A EA de Cd foi maior entre os isópodes que foram alimentados com o sal (71%, SE = 7%), do que entre os isópodes que se alimentaram de alface contaminada biologicamente (52%, SE = 5%), demonstrando-se assim num teste laboratorial que é provável que a especiação do Cd influencie a taxa de assimilação e acumulação do Cd. Na experiência alimentar que se seguiu, estudou-se em detalhe a especiação do metal comparando as EA do Cd conjugado com cisteína (Cd(Cys)2) e na forma de Cd(NO3)2, com os quais se contaminou gelatina com alface. A utilização de Cd-cisteína, proporcionou uma forma experimental para explorar a biodisponibilidade do Cd complexado dentro do tecido biológico. Como esperado, a EA de Cd em isópodes alimentados com nitrato de Cd (64%, SE = 5%) foi maior do que no caso de isópodes alimentados com o conjugado de cisteína (20%, SE = 3%). De seguida estudou-se a distribuição subcelular das espécies de Cd assimilado através de um processo de fraccionamento. Supunha-se que as diferenças de especiação de Cd reflectiria diferentes estratégias de compartimentalização, com consequências ao nível da detoxificação, armazenamento celular e distribuição subcelular do metal. O “sequestro” na forma de metal biologicamente detoxificado (BDM = proteínas estáveis ao calor - HSP e grânulos ricos em metal - RMG) foi maior nos isópodes alimentados com Cd(NO3)2, sugerindo que são mais eficientes na detoxificação de Cd (22%) do que quando alimentados com Cd(Cys)2 (15%). Foi também demonstrado que os isópodes alimentados com Cd(Cys)2 possuíam níveis de armazenamento de Cd superior nas fracções sensíveis ao metal (MSF = organelos e proteínas desnaturadas pelo calor - HDP) consideradas fracções potencialmente vulneráveis e afectando os isópodes em termos de toxicidade. As diferentes distribuições internas que se seguiram à assimilação e detoxificação das diferentes espécies de Cd foram finalmente avaliadas em termos da sobrevivência e reprodução dos isópodes. O tratamento com Cd(Cys)2 teve maior mortalidade, provavelmente devido à maior disponibilidade de Cd ingerido com implicações ao nível dos processos fisiológicos. Os isópodes alimentados com Cd(NO3)2 armazenaram o Cd nos MRG, como estratégia de detoxificação, sendo mais eficientes a detoxificar o Cd ainda que aumentando a concentração total do metal que se tornou menos tóxico para o isópode. Desta forma, o Cd nos grânulos não estava disponível para os processos fisiológicos e deixou de ser tóxico. Isso poderia estar relacionado com a resistência e tolerância aos metais devido à capacidade dos isópodes compartimentalizarem o Cd no hepatopâncreas, que actua como um mecanismo de detoxificação e contribui para a tolerância a altos níveis de cádmio. Em termos de parâmetros reprodutivos, observou-se uma redução de gestações e duração da gestação na presença de ambas as espécies de metal, mas no caso do Cd(Cys)2 as gravidezes não se concluíram. O número de jovens produzido por fêmeas alimentadas com Cd(NO3)2 foi menor do que no controlo, mas os pesos dos juvenis foram superiores. Finalmente sugere-se assim que esta abordagem seja considerada em estudos do movimento trófico de metais nas cadeias alimentares dado que se espera que a especiação de metais implique diferentes fluxos, dentro de uma dada cadeia trófica.

Modified electrodes with Keggin-type polyoxotungstates

O objectivo deste trabalho é a produção de novos eléctrodos modificados com polioxotungstatos (POMs) do tipo Keggin, incluindo POMs lacunares e substituídos por metais de transição. A preparação e caracterização dos polioxotungstatos encontram-se descritas no Capítulo 2. No Capítulo 3 descreve-se a produção de eléctrodos de carbono vítreo funcionalizados com sais híbridos de tetra-n-butilamónio de vários silicotungstatos pelo método de evaporação da gota. As propriedades electroquímicas dos polioxotungstatos imobilizados foram comparadas com as das espécies solúveis correspondentes. A morfologia dos depósitos foi avaliada por microscopia óptica e por microscopia electrónica de varrimento. No capítulo 4 descreve-se a preparação de novos eléctrodos compósitos de carbono e poli(hexilmetacrilato) com fosfotungstatos. Os estudos electroquímicos revelaram que as principais características dos POMs são mantidas e que os processos de redução são controlados por difusão, dependendo da difusão dos protões da solução. O Capítulo 5 descreve a construção de filmes em multicamadas ultrafinos contendo POMs e polietilenimina, preparados pelo método de auto-montagem camada-sobre-camada em eléctrodos de carbono vítreo. Os filmes em multicamada foram caracterizados por voltametria cíclica e por microscopia electrónica de varrimento e foi usada a espectroscopia de absorção de UV-Vis em placas de quartzo para monitorar o crescimento de filme. Os resultados voltamétricos revelaram que os processos de redução dos POM são confinados à superfície. Alguns destes eléctrodos modificados revelaram propriedades electrocatalíticas relativamente à redução dos aniões nitrito, bromato e/ou iodato. A espectroscopia de impedância electroquímica também foi usada na caracterização destes filmes e os resultados revelaram que a resistência à transferência de carga aumenta com o aumento do número de bicamadas para ambas as espécies redox, indicando que a espessura do filme tem um efeito importante sobre a cinética de reacções de transferência de carga. No capítulo 6 descreve-se a síntese de filmes híbridos orgânicos/inorgânicos compostos por poli(3,4-etilenodioxitiofeno) (PEDOT) e por silicotungstatos do tipo Keggin através da polimerização electroquímica, em condições aquosas, na superfície de electrodos de carbono vítreo. A voltametria cíclica revelou que as características principais dos POMs são mantidas nos filmes. Verificou-se que estes filmes são muito estáveis, possivelmente devido a fortes interacções electrostáticas entre os POMs aniónicos e o polímero positivamente carregado. A espectroscopia de impedância electroquímica foi também utilizada e os resultados mostraram que a resistência de transferência de carga aumenta com o aumento do pH e para valores de potenciais mais elevados. O capítulo 7 apresenta as conclusões finais e possíveis trabalhos futuros.

Lichenicidin biosynthesis and search for novel antibacterial peptides

A estirpe Bacillus licheniformis I89 possui a capacidade de produzir alguns compostos com actividade antibacteriana. No presente estudo, a separação desses compostos foi realizada através da aplicação de vários procedimentos, incluindo extracção em fase sólida e cromatografia liquida de alta pressão. Dois destes compostos bioactivos constituem o lantibiótico de classe II lichenicidina e são caracterizados pela massas molecular de 3250 Da (Bliα) e 3020 Da (Bliβ). O cluster responsável pela biossíntese da lichenicidina foi heterologamente expresso em Escherichia coli, constituindo a primeira descrição da produção de um lantibiótico totalmente in vivo num hospedeiro Gram-negativo. Este sistema foi subsequentemente explorado com o objectivo de relacionar cada proteína codificada no cluster genético da lichenicidina na produção dos péptidos Bliα e Bliβ. O desenvolvimento do sistema de trans complementação possibilitou a produção de variantes destes péptidos. A análise das massas moleculares destas variantes assim como a análise dos padrões de fragmentação obtidos por MS/MS permitiu a revisão de algumas das características estruturais previamente proposta para Bliα e Bliβ. A análise dos genes hipoteticamente envolvidos na protecção da estirpe produtora contra a acção antibiótica da lichenicidina revelou, que em E. coli, a sua ausência não resulta no aumento da susceptibilidade a este composto. Verificou-se também que a presença destes genes não é essencial para a produção de lichenicidina em E. coli. Foi também confirmado experimentalmente que a membrana externa da E. coli constitui uma barreira natural para a entrada dos péptidos na célula. De facto, uma das características intrigantes da produção de lichenicidina por uma bactéria de Gram negativo reside no mecanismo de transporte dos dois péptidos através da membrana externa. Neste estudo foi demonstrado que na ausência da proteína de membrana TolC, a massa molecular de Bliα e Bliβ não foi identificada no sobrenadante de E. coli, demonstrando assim que a sua presença no ambiente extra-celular não se devia a um processo de lise bacteriana. Foi ainda avaliada a capacidade da maquinaria biossintética da lichenicidina para produzir o lantibiótico haloduracina, através do processamento de chimeras lichenicidina-haloduracina, contudo, os resultados foram negativos. Verificou-se ainda que em determinadas condições de incubação, a diferenciação da morfologia original da estirpe B. licheniformis I89 pode ocorrer. Esta dissociação implicou a transição da colónia parental e rugosa para uma colónia de aparência mais simples e suave. Desta forma, as diferenças das duas morfologias em termos de taxa de crescimento, esporulação e actividade antibiótica foram investigadas. Considerando especificamente Bliα e Bliβ verificou-se que a abundância destes péptidos nas culturas do fenótipo fino é geralmente inferior aquela identificada nas culturas do fenótipo parental. Por último, a diversidade de elementos genéticos constituintes de péptido sintetases não ribossomais (NRPS) foi investigada em lagoas no centro de Portugal e em solos provenientes de caves do sul de Portugal, revelando a presença de potenciais novas NRPS nestes ambientes.

Novel furan polymer materials based on the reversible Diels-Alder reaction

A futura e inevitável escassez dos recursos fósseis, juntamente com o aumento imprevisível dos seus preços, levou, nas últimas décadas, a um aumento impressionante de iniciativas dedicadas não só à procura de fontes alternativas de fornecedores de energia, mas também de produtos químicos e polímeros a partir de fontes renováveis, em particular da biomassa vegetal. Entre estes, os polímeros derivados de monómeros furânicos constituem uma classe única de materiais cujas estruturas podem, em princípio, simular virtualmente os seus homólogos actualmente derivados de recursos fósseis. O anel furânico é uma estrutura heterocíclica com um carácter diénico pronunciado, o que torna-o um dieno particularmente apropriado para a reacção de Diels-Alder (DA) com dienófilos como a maleimida. Um dos aspectos mais relevantes da reacção de DA é a sua reversibilidade em função da temperatura, a qual permite que os aductos sejam facilmente revertidos nos seus precursores por aumento da temperatura (reacção de retro-DA). No caso específico da combinação furano-maleimida, a formação do aducto predomina até cerca de 60ºC, enquanto a reacção inversa é dominante acima de 100ºC. A combinação desta característica da reacção de DA com a química de compostos furânicos pode abrir um novo caminho para a preparação de materiais macromoleculares funcionais com base em fontes renováveis e com aplicações promissoras como auto-reparação e reciclabilidade. O principal objectivo desta Tese, é a síntese e caracterização de novos materiais poliméricos termo-reversíveis, aplicando a reacção de DA a monómeros complementares com estruturas dos tipos furânico (o dieno, designado por A) e de maleimida (o dienófilo, designado por B). A primeira etapa neste trabalho envolveu a síntese, purificação e caracterização de novos monómeros furânicos e de maleimida do tipo AA, A3, BB, B3, AB, AB2, cada um com diferentes grupos separadores das funções reactivas. Posteriormente, estes monómeros foram polimerizados e despolimerizados por ciclos de DA/retro-DA utilizando diferentes combinações. A formação e dissociação de todos os aductos de DA foram seguidas por ambas espectroscopias de UV e RMN de 1H. O primeiro sistema de DA estudado foi uma combinação modelo entre reagentes mono-funcionais (-A+-B), nomeadamente o acetato furfurílico (FA) e a N-metilmaleimida (MM), ambos comercialmente disponíveis. O objectivo desta abordagem foi estudar a cinética e o equilíbrio da formação/dissociação dos aductos de DA e obter indicações sobre as condições mais adequadas a serem usadas na preparação dos correspondentes novos materiais macromoleculares. Além disso, pretendia-se verificar a presença ou ausência de reacções secundárias que poderiam intervir em ambas as vias directa e inversa das reacções, mesmo após vários ciclos. A espectroscopia de UV forneceu informação quantitativa sobre a cinética de formação do aducto através da diminuição progressiva da absorvência máxima a 293 nm correspondente ao grupo maleimida, a diferentes temperaturas (35, 50, 65 ºC) Reciprocamente, a correspondente reacção de retro-DA foi seguida a 90 ºC através do aumento do mesmo pico. A reversibilidade destes sistemas foi verificada com sucesso após uma sequência de ciclos de DA/retro-DA. Adicionalmente, verificou-se que os espectros originaram um ponto isosbéstico, provando que estes sistemas não envolvem quaisquer reacções secundárias. Uma vez que foi usado um excesso de FA, as reacções de DA modelo apresentaram um comportamento cinético de pseudo-primeira ordem, com a constante de velocidade k mais alta (2.1x10-5 dm3mol-1s-1) para T=65 ºC. A correspondente energia de activação foi de 39.0 kJ.mol-1. A reacção de retro-DA seguiu um comportamento de primeira ordem, com constante de velocidade de 1.6x10-6 s-1. A evolução deste sistema por RMN de 1H a 65ºC deu-nos informações mais detalhadas sobre a sua evolução estrutural, ou seja, à medida que a intensidade dos picos atribuídos à formação do aducto aumentaram progressivamente ao longo do tempo, os pertencentes aos reagentes iniciais diminuiram proporcionalmente. O “rendimento final”, calculado após 20 dias à temperatura ambiente, foi de aproximadamente 70%. A reacção de retro-DA foi depois seguida a 90ºC, observando-se tal como na espectroscopia de UV, o deslocamento da reacção no sentido da regeneração dos reagentes de partida. A viabilidade de múltiplos ciclos de DA/retro-DA estabelecidos pela espectroscopia de UV foi igualmente confirmada por RMN de 1H. O passo seguinte envolveu o estudo de um sistema de policondensação linear baseado no crescimento gradual por reacção de DA entre um monómero bisfurânico A-A e um do tipo bismaleimida B-B, seguindo a mesma abordagem que no sistema modelo. O poliaducto linear foi obtido a partir de soluções equimolares dos monómeros, por reacção de DA a 65ºC. O progresso desta polimerização foi seguido por espectroscopia de UV e RMN de 1H e, mais qualitativamente, pelo aumento da viscosidade do meio. A reacção seguiu um comportamento de segunda ordem, com uma constante de velocidade de 9.4x10-6 dm3mol-1s-1, e observou-se novamente um ponto isosbéstico nos dados de UV. Os espectros de RMN apresentaram o padrão esperado, nomeadamente o aumento progressivo dos sinais associados ao aducto e a correspondente diminuição dos grupos furano e maleimida livres. A despolimerização do poliaducto através da reacção de retro-DA foi seguida a 110ºC usando as mesmas técnicas. Os dados de UV mostraram o retorno progressivo da absorção dos grupos de maleimida, seguindo um comportamento cinético de primeira ordem, com constante de velocidade de 2.5x10-6 s-1, até à completa regeneração de ambos os monómeros. Os espectros de RMN providenciaram mais uma vez informação estrutural sobre o progresso da despolimerização, a qual foi acompanhada por uma diminuição progressiva da viscosidade. Adicionalmente, para seguir a retro- DA, adicionou-se um excesso de composto furânico monofuncional, nomeadamente o 2,5-dimetilfurano (DMFu), ao sistema de modo a bloquear as funções maleimida complementares, evitando assim a repolimerização após arrefecimento. Os productos isolados foram então o monómero bisfurânico AA, DMFu que não reagiu e o bisaducto não-polimerizável de BB com DMFu. Este resultado indicou claramente que o polímero foi de facto revertido nos seus monómeros durante a reacção de retro-DA. O terceiro sistema estudado foi outra polimerização linear, seguindo as mesmas condições experimentais que os anteriores, mas com uma estratégia diferente de modo a contornar o problema clássico de assegurar a estequiometria exacta dos monómeros. As estruturas dos monómeros utilizados incorporam ambos os grupos reactivos, i.e, moléculas do tipo A-B. A polimerização prematura destes monómeros intrinsecamente reactivos foi evitada com a protecção do grupo maleimida na forma de um aducto de DA com furano, até a incorporação do substituinte furânico na outra extremidade. Portanto, a policondensação destes monómeros foi iniciada após a desprotecção in situ deste composto mediante aquecimento, seguido de arrefecimento até à temperatura adequada para polimerizar. Os resultados obtidos por UV e RMN sugerem que de facto o uso de monómeros do tipo A-B oferece um melhor sistema linear. Em seguida, foram estudados sistemas de policondensação não-linear por reacção de DA, entre monómeros (um ou ambos) com funcionalidade superior a dois, nomeadamente sistemas do tipo A3+B-B ou A-A+B3, seguindo mais uma vez as mesmas condições experimentais. Uma vez que utilizam monómeros complementares contendo, em média, mais de duas funcionalidades, estes sistemas conduzem a materiais reticulados. Nestes estudos, foram usadas três razões molares de [maleimida]/[furano], nomeadamente 1.0, 0.75 e 0.5, de modo a estudar ambas as situações de não-gelificação e reticulação. Ambos sistemas apresentaram um comportamento regular e boa reciclabilidade quer para gerar situações que possam conduzir à formação de redes a diferentes graus de conversão, ou que possam parar antes da sua obtenção, conforme previsto pela equação de Flory-Stockmayer. Como esperado, a utilização de grupos complementares em quantidades estequiométricas produziu o espessamento mais rápido e a reticulação quase completa; à medida que a quantidade relativa de monómero trifuncional decresceu, as reacções pararam antes da reticulação, ou seja, originaram meios altamente viscosos contendo polímeros solúveis altamente ramificados. As reacções de retro-DA a 110 ºC conduziram à gradual dissolução das partículas de gel (quando presentes), tendo sido comprovado pelos espectros de UV e de RMN de 1H, evidenciado a regeneração dos monómeros. Tal como no sistema do tipo A-A+B-B, a reacção de retro-DA foi seguida adicionando um excesso de DMFu ao sistema reaccional. Como esperado, os produtos finais foram os monómeros furânicos, o DMFu em excesso e o trisaducto ou o bisaducto maleimida-DMFu, o que confirma a eficiência da despolimerização com regeneração dos monómeros iniciais. O último sistema de policondensação por reacção de DA envolveu um monómero assimetricamente substituído do tipo AB2, capaz de originar estruturas macromoleculares hiper-ramificadas que não reticulam. Este estudo preliminar deste sistema foi seguido nas mesmas condições experimentais que os anteriores, apresentando um comportamento com as características esperadas.

Petrologic and geochemical characterization of São Jorge island volcanism, Azores

The island of São Jorge (38º 45’ 24’’ N - 28º 20’ 44’’W and 38º 33’ 00’’ N - 27º 44’ 32’’ W) is one of the nine islands of the Azores Archipelago that is rooted in the Azores Plateau, a wide and complex region which encompasses the triple junction between the American, Eurasia and Nubia plates. São Jorge Island has grown by fissural volcanic activity along fractures with the regional WNW-ESE trend, unveiling the importance of the regional tectonics during volcanic activity. The combination of the volcanostratigraphy (Forjaz & Fernandes, 1975; and Madeira, 1998) with geochronological data evidences that the island developed during two main volcanic phases. The first subaerial phase that occurred between 1.32 and 1.21 Ma ago (Hildenbrand et al. 2008) is recorded on the lava sequence forming the cliff at Fajã de São João, while the second phase started at 757 ka ago, is still active, and edified the rest of the island. This second phase edified the east side of the island that corresponds to Topo Volcanic Complex, in the period between 757 and 543 ka ago, while the west side named Rosais Volcanic Complex, started at 368 ka ago (Hildenbrand et al. 2008) and was still active at 117 ka ago. After the onset of Rosais, volcanic activity migrates to the center of São Jorge edifying Manadas Volcanic Complex. The volcanism on São Jorge is dominantly alkaline, with a narrow lithological composition ranging between the basanites/tefrites through the basaltic trachyandesites, in spite of this the two volcanic phases show distinct mineralogical, petrographic and geochemical characteristics that should be related with different petrogenetic conditions and growth rates of the island. Abstract viii During the first volcanic phase, growth rates are faster (≈3.4 m/ka), the lavas are slightly less alkaline and plagioclase-richer, pointing to the existence of a relative shallow and dynamic magma chamber where fractional crystallization associated with gravitational segregation and accumulation processes, produced the lavas of Fajã de São João sequence. The average growth rates during the second volcanic phase are lower (≈1.9 m/ka) and the lavas are mainly alkaline sodic, with a mineralogy composed by olivine, pyroxene, plagioclase and oxide phenocrysts, in a crystalline groundmass. The lavas are characterized by enrichment in incompatible trace element and light REE, but show differences for close-spaced lavas that unveil, in some cases, slight different degrees of fertilization of the mantle source along the island. These differences might also result from higher degrees of partial melting, as observed in the early stages of Topo and Rosais volcanic complexes, of a mantle source with residual garnet and amphibole, and/or from changing melting conditions of the mantle source as pressure. The subtle geochemical differences of the lavas contrast with the isotopic signatures, obtained from Sr-Nd-Pb-Hf isotopes, that São Jorge Island volcanism exhibit along its volcanic complexes. The lavas from Topo Volcanic Complex and from the submarine flank, i.e. the lavas located east of Ribeira Seca Fault, sample a mantle source with similar isotopic signature that, in terms of lead, overlaps Terceira Island. The lavas from Rosais and Manadas volcanic complexes, the western lavas, sample a mantle source that becomes progressively more distinct towards the west end of the island and that, in terms of lead isotopes, trends towards the isotopic composition of Faial Island. The two isotopic signatures of São Jorge, observed from the combination of lead isotopes with the other three systems, seem to result from the mixing of three distinct end-members. These end-members are (1) the common component related with the Azores Plateau and the MAR, (2) the eastern component with a FOZO signature and possibly related with the Azores plume located beneath Terceira, and (3) the western component, similar to Faial, where the lithosphere could have been entrained by an ancient magmatic liquid, isolated for a period longer than 2Ga. The two trends observed in the island reinforce the idea of small-scale mantle heterogeneities beneath the Azores region, as it has been proposed to explain the isotopic diversity observed in the Archipelago.

Contribution of biomass combustion to air pollutant emissions

In Portugal, it was estimated that around 1.95 Mton/year of wood is used in residential wood burning for heating and cooking. Additionally, in the last decades, burnt forest area has also been increasing. These combustions result in high levels of toxic air pollutants and a large perturbation of atmospheric chemistry, interfere with climate and have adverse effects on health. Accurate quantification of the amounts of trace gases and particulate matter emitted from residential wood burning, agriculture and garden waste burning and forest fires on a regional and global basis is essential for various purposes, including: the investigation of several atmospheric processes, the reporting of greenhouse gas emissions, and quantification of the air pollution sources that affect human health at regional scales. In Southern Europe, data on detailed emission factors from biomass burning are rather inexistent. Emission inventories and source apportionment, photochemical and climate change models use default values obtained for US and Northern Europe biofuels. Thus, it is desirable to use more specific locally available data. The objective of this study is to characterise and quantify the contribution of biomass combustion sources to atmospheric trace gases and aerosol concentrations more representative of the national reality. Laboratory (residential wood combustion) and field (agriculture/garden waste burning and experimental wildland fires) sampling experiments were carried out. In the laboratory, after the selection of the most representative wood species and combustion equipment in Portugal, a sampling program to determine gaseous and particulate matter emission rates was set up, including organic and inorganic aerosol composition. In the field, the smoke plumes from agriculture/garden waste and experimental wildland fires were sampled. The results of this study show that the combustion equipment and biofuel type used have an important role in the emission levels and composition. Significant differences between the use of traditional combustion equipment versus modern equipments were also observed. These differences are due to higher combustion efficiency of modern equipment, reflecting the smallest amount of particulate matter, organic carbon and carbon monoxide released. With regard to experimental wildland fires in shrub dominated areas, it was observed that the largest organic fraction in the samples studied was mainly composed by vegetation pyrolysis products. The major organic components in the smoke samples were pyrolysates of vegetation cuticles, mainly comprising steradienes and sterol derivatives, carbohydrates from the breakdown of cellulose, aliphatic lipids from vegetation waxes and methoxyphenols from the lignin thermal degradation. Despite being a banned practice in our country, agriculture/garden waste burning is actually quite common. To assess the particulate matter composition, the smoke from three different agriculture/garden residues have been sampled into 3 different size fractions (PM2.5, PM2.5-10 and PM>10). Despite distribution patterns of organic compounds in particulate matter varied among residues, the amounts of phenolics (polyphenol and guaiacyl derivatives) and organic acids were always predominant over other organic compounds in the organosoluble fraction of smoke. Among biomarkers, levoglucosan, β-sitosterol and phytol were detected in appreciable amounts in the smoke of all agriculture/garden residues. In addition, inositol may be considered as an eventual tracer for the smoke from potato haulm burning. It was shown that the prevailing ambient conditions (such as high humidity in the atmosphere) likely contributed to atmospheric processes (e.g. coagulation and hygroscopic growth), which influenced the particle size characteristics of the smoke tracers, shifting their distribution to larger diameters. An assessment of household biomass consumption was also made through a national scale survey. The information obtained with the survey combined with the databases on emission factors from the laboratory and field tests allowed us to estimate the pollutant amounts emitted in each Portuguese district. In addition to a likely contribution to the improvement of emission inventories, emission factors obtained for tracer compounds in this study can be applied in receptor models to assess the contribution of biomass burning to the levels of atmospheric aerosols and their constituents obtained in monitoring campaigns in Mediterranean Europe.

Electrospun fibrous mats for skin and abdominal wall repair

Esta tese centra-se no desenvolvimento de materiais biodegradáveis e nãodegradáveis produzidos por eletrofiação com aplicação na área biomédica. O poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) (PHBV), um poliéster biodegradável, foi selecionado como base dos materiais biodegradáveis, enquanto o poli(tereftalato de etileno) (PET), um polímero sintético, estável e biocompatível, foi selecionado para a produção das matrizes não degradáveis. Adicionou-se quitosana aos sistemas com o objetivo de melhorar o processo de eletrofiação e as propriedades morfológicas, físico-químicas e biológicas dos materiais resultantes. A composição química, bem como as características morfológicas e físicoquímicas dos materiais em estudo, foram manipuladas de modo a otimizar a sua performance como suportes celulares para engenharia de tecidos. Foram realizados estudos in vitro com cultura de fibroblastos L929 para avaliar o comportamento das células, i.e. viabilidade, adesão, proliferação e morte, quando cultivadas nas matrizes produzidas por eletrofiação. Adicionalmente foram realizados ensaios in vivo para investigar o potencial dos materiais em estudo na regeneração cutânea e como tela abdominal. Os principais resultados encontrados incluem: o desenvolvimento de novas matrizes híbridas (PHBV/quitosana) adequadas ao crescimento de fibroblastos e ao tratamento de lesões de pele; o desenvolvimento de um sistema de eletrofiação com duas seringas para a incorporação de compostos bioativos; diversas estratégias para manipulação das características morfológicas dos materiais de PHBV/quitosana e PET/quitosana produzidos por eletrofiação; uma melhoria do conhecimento das interações fibroblastos-suporte polimérico; a verificação de uma resposta inflamatória desencadeada pelos materiais nãodegradáveis quando utilizados no tratamento de defeitos da parede abdominal, o que sugere a necessidade de novos estudos para avaliar a segurança do uso de biomateriais produzidos por eletrofiação.

Tributyltin (TBT) resistance in Aeromonas molluscorum Av27

O tributilestanho (TBT) é considerado um dos xenobióticos mais tóxicos, produzidos e deliberadamente introduzidos no meio ambiente pelo Homem. Tem sido usado numa variedade de processos industriais e subsequentemente descarregado no meio ambiente. O tempo de meia-vida do TBT em águas marinhas é de várias semanas, mas em condições de anóxia nos sedimentos, pode ser de vários anos, devido à sua degradação mais lenta. Embora o TBT tenha sido descrito como sendo tóxico para eucariotas e procariotas, muitas bactérias podem ser resistentes a este composto. O presente trabalho teve como objetivo principal elucidar o mecanismo de resistência ao TBT em bactérias. Para além disso, pretendeu-se desenvolver um biorepórter para detectar TBT no ambiente. Para atingir estes objetivos foram delineadas várias tarefas cujos principais resultados obtidos se apresentam a seguir. Várias bactérias resistentes ao TBT foram isoladas de sedimento e água do Porto de Pesca Longínqua (PPL) na Ria de Aveiro, Portugal. Entre estas, Aeromonas molluscorum Av27 foi selecionada devido à sua elevada resistência a este composto (concentrações até 3 mM), à sua capacidade de degradar o TBT em compostos menos tóxicos (dibutilestanho, DBT e monobutilestanho, MBT) e também por usar o TBT como fonte de carbono. A. molluscorum Av27 foi caracterizada genotipica e fenotipicamente. Os fatores de virulência estudados mostraram que esta estirpe i) possui atividade lipolítica; ii) não é citotóxica para células de mamíferos, nomeadamente para células Vero; iii) não possui integrões de classe I e II e iv) possui cinco plasmídeos com aproximadamente 4 kb, 7 kb, 10 kb, 100 kb e mais de 100 kb. Estes resultados mostraram que a estirpe Av27 não é tóxica, aumentando assim o interesse nesta bactéria para futuras aplicações, nomeadamente na bioremediação. Os testes de toxicidade ao TBT mostraram que este composto tem um impacto negativo no crescimento desta estirpe, bem como, na densidade, no tamanho e na atividade metabólica das células e é responsável pela formação de agregados celulares. Assim, o TBT mostrou ser bastante tóxico para as bactérias interferindo com a atividade celular geral. O gene Av27-sugE, que codifica a proteína SugE pertencente à família das “small multidrug resistance proteins” (SMR), foi identificado como estando envolvido na resistência ao TBT nesta estirpe. Este gene mostrou ser sobreexpresso quando as células crescem na presença de TBT. O promotor do gene Av27-sugE foi utilizado para construir um bioreporter para detetar TBT, contendo o gene da luciferase do pirilampo como gene repórter. O biorepórter obtido reúne as características mais importantes de um bom biorepórter: sensibilidade (intervalo de limite de detecção de 1-1000 nM), rapidez (3 h são suficientes para a deteção de sinal) e, possivelmente, não é invasivo (pois foi construído numa bactéria ambiental). Usando sedimento recolhido no Porto de Pesca Longínqua da Ria de Aveiro, foi preparada uma experiência de microcosmos com o intuito de avaliar a capacidade de Av27 para bioremediar o TBT, isoladamente ou em associação com a comunidade bacteriana indígena. A análise das amostras de microcosmos por PCR-DGGE e de bibliotecas de 16S rDNA revelaram que a comunidade bacteriana é relativamente estável ao longo do tempo, mesmo quando Av27 é inoculada no sedimento. Para além disso, o sedimento estuarino demonstrou ser dominado por bactérias pertencentes ao filo Proteobacteria (sendo mais abundante as Delta e Gammaproteobacteria) e Bacteroidetes. Ainda, cerca de 13% dos clones bacterianos não revelaram nenhuma semelhança com qualquer dos filos já definidos e quase 100% afiliou com bactérias não cultiváveis do sedimento. No momento da conclusão desta tese, os resultados da análise química de compostos organoestânicos não estavam disponíveis, e por essa razão não foi possível tirar quaisquer conclusões sobre a capacidade desta bactéria remediar o TBT em sedimentos. Esses resultados irão ajudar a esclarecer o papel de A. molluscorum Av27 na remediação de TBT. Recentemente, a capacidade da estirpe Av27 remediar solo contaminado com TBT foi confirmada em bioensaios realizados com plantas, Brassica rapa e Triticum aestivum (Silva 2011a), e também com invertebrados Porcellionides pruinosus (Silva 2011B). Assim, poder-se-á esperar que a bioremediação do sedimento na experiência de microcosmos também tenha ocorrido. No entanto, só a análise química dos compostos organostânicos deverá ser conclusiva. Devido à dificuldade em realizar a análise analítica de organoestânicos, um método de bioensaio fácil, rápido e barato foi adaptado para avaliar a toxicidade do TBT em laboratório, antes de se proceder à análise química das amostras. O método provou a sua utilidade, embora tenha mostrado pouca sensibilidade quando se usam concentrações de TBT baixas. Em geral, os resultados obtidos contribuíram para um melhor entendimento do mecanismo de resistência ao TBT em bactérias e mostraram o potencial biotecnológico de A. molluscorum Av27, nomeadamente, no que refere à sua possível aplicação na descontaminação de TBT no ambiente e também no desenvolvimento de biorepórteres.

Compósitos de polímeros naturais e nanopartículas metálicas

Esta tese descreve diversas estratégias de preparação assim como a caracterização de nanocompósitos com base em distintos biopolímeros. Em particular foi estudada a incorporação de nanopartículas (NPs) metálicas, nomeadamente de Ag, Cu e Au. Estes nanomateriais apresentam um potencial prático enorme em diversas áreas, no entanto foi investigada especificamente a sua aplicação como materiais antimicrobianos. No primeiro capítulo apresenta-se uma revisão bibliográfica, onde são realçados os principais tópicos discutidos ao longo da tese. Inicialmente apresenta-se uma contextualização deste trabalho sendo seguidamente apresentadas algumas considerações sobre nanocompósitos e o seu impacto tecnológico atual. Em seguida, descrevem-se as vantagens do uso de NPs como cargas nos materiais compósitos especificamente no caso de bionanocompósitos. Foi focado o uso da celulose como matriz uma vez que foi o composto “base” usado neste trabalho. Fez-se a descrição exaustiva das metodologias existentes na literatura para a preparação dos nanocompósitos celulósicos com diferentes NPs metálicas assim como das respetivas aplicações. Dentro das aplicações, foi dado especial destaque às propriedades antimicrobianas dos materiais preparados seja a nível da sua atividade antibacteriana ou antifúngica. Esta introdução privilegia o trabalho relacionado diretamente com os sistemas descritos nos capítulos subsequentes. No segundo capítulo apresentam-se os resultados obtidos para nanocompósitos de prata em matriz celulósica. Através do uso de metodologias, tais como a síntese in situ e a pós-deposição, foram preparados diversos materiais usando dois substratos celulósicos distintos nomeadamente a celulose vegetal e bacteriana. Estes nanocompósitos foram caracterizados em termos da sua morfologia e composição química, verificando-se a importância destas características na sua atividade antibacteriana. Foi verificado que nanocompósitos com teores de Ag de 5 x 10-4 (% m/m) são suficientes para obter atividade antibacteriana. A libertação de Ag(I) foi estudada em alguns destes materiais de modo a tentar perceber o mecanismo subjacente a este tipo de nanocompósitos. No terceiro capítulo é apresentado o estudo de NPs coloidais de Ag e Au como cargas para a preparação de nanocompósitos à base de quitosano nãomodificado e modificado quimicamente (derivado solúvel em água e derivado anfifílico). Foram preparados filmes finos de espessura de 9-14 μm, caracterizando-se as suas propriedades óticas e antibacterianas. As propriedades óticas foram ajustadas, quer pela variação do teor de NPs de Ag (0,3-3,9% m/m) ou pela utilização de amostras de NPs com distribuição de tamanho de partícula distinta. Foi investigada a atividade antibacteriana tanto para bactérias Gram-negativas (Klebsiella pneumoniae e Escherichia coli) como para Gram-positivas (Staphylococcus aureus). Para nanocompósitos preparados com o quitosano não modificado verificou-se uma dependência em função do teor de Ag. No caso do uso de derivados modificados, os materiais preparados mostraram uma eficiência superior, mesmo sem NPs de Ag. No quarto capítulo é apresentada a síntese e caracterização de nanocompósitos de pululano e NPs de Ag. Neste estudo é avaliada a atividade antifúngica dos filmes compósitos preparados contra o Aspergillus niger usando protocolos padrão. Estes materiais foram preparados na forma de filmes (66-74 μm de espessura) por evaporação de solvente da mistura de pululano e coloides de Ag. Foi observado o aumento da inibição do fungo na presença dos nanocompósitos, tendo sido pela primeira vez mostrado o efeito disruptivo destes materiais sobre os esporos do A. niger através da análise das imagens de SEM. Este efeito ocorre na presença dos filmes devido à presença das cargas de NPs de Ag dispersas no pululano. O desenvolvimento de materiais de papel com NPs de Cu é um desafio devido à propensão destas espécies em oxidar sob condições ambiente. No quinto capítulo é descrita pela primeira vez o estudo comparativo do crescimento e estabilidade de NPs de Cu em celulose vegetal e bacteriana. Para além disso foi avaliado o uso de nanoestruturas com diferentes dimensionalidades como cargas, nomeadamente nanoesferas e nanofios. Foi observado que o uso de nanofios aumenta a resistência à oxidação destes nanocompósitos para tempos de exposição ao ar mais prolongados. As matrizes celulósicas apresentam comportamento distinto no crescimento e/ou adsorção das NPs de Cu. A celulose bacteriana foi o substrato mais eficiente para retardar a oxidação das NPs. A atividade antibacteriana destes nanocompósitos foi avaliada. Ao longo desta dissertação são apresentados métodos distintos para a obtenção de nanocompósitos com base em biopolímeros e NPs metálicas. Estes estudos permitiram não só a preparação de novos nanocompósitos mas também compreender e otimizar os mecanismos subjacentes à sua preparação. Ao mesmo tempo, este trabalho contribuiu para a transferência de tecnologia e conhecimento entre a área da Nanotecnologia e a área dos materiais derivados de fontes renováveis. As propriedades apresentadas por estes nanomateriais mostraram a sua possível aplicação como novos materiais antimicrobianos, no entanto é possível antecipar futuras aplicações em outras áreas tecnológicas.

Synthesis and biological activities of polyphenolic hybrids - evaluation of anti-cancer, anti-inflammatory and antioxidant activities

Os compostos polifenólicos constituem uma classe de metabolitos secundários de plantas, mas existe também uma enorme quantidade de derivados sintéticos ou semi-sintéticos contendo múltiplas unidades fenólicas. Estes compostos apresentam importantes características biológicas, que dependem das suas estruturas básicas. Certos derivados desta família de compostos, tais como flavonoides, cromonas e cumarinas contribuem para os benefícios da dieta humana, e partilham o núcleo de benzopiran-(2 e 4)-ona ou benzofuran-3-ona. A presente dissertação inclui uma introdução geral e três capítulos que descrevem as novas rotas sintéticas estabelecidas para a preparação de novos híbridos de diversos compostos polifenólicos, assim como a sua elucidação estrutural e termina com a presentação dos resultados da avaliação biológica desses mesmos compostos. No segundo capítulo discute-se a preparação de híbridos de pirimidina- e imidazolidina-polifenóis, especialmente a síntese diastereoseletiva de novos híbridos benzofuran-3-ona-hidantoína e derivados de uracilo. A rota sintética envolve a ação de carbodiimidas sobre os ácidos cromona-(2- e 3)-carboxílicos num só passo ou em dois passos sequenciais, catalisada por uma base orgânica ou inorgânica. O terceiro capítulo descreve reações do tipo adições conjugadas 1,4 - hetero-ciclisações em cascata de compostos 1,3-dicarbonílicos em ácido cromona-3-carboxílico catalisadas por uma base orgânica, que originaram novas cromonas, cromanonas e flavonas polissubstituídas. As bispiranonas [bispiran-2 e 4)-onas] foram elaboradas numa reacção de acoplamento da 4-hidroxicumarina ou da lactona do ácido triacético com o ácido cromona-3-carboxílico ou precursores formil-funcionalizados (ω-formil-2’-hydroxy acetofenonas e cromona-3-carbaldeídos) utilizando organocatálise básica. Finalmente, alargou-se o estudo das adições conjugadas 1,4 para uma variedade de 4-hidroxipiran-2-onas e cetonas α,β-insaturadas para originar novos análogos de warfarina. Obteve-se uma variedade de estruturas complexas por hibridação das unidades de 4-hidroxicumarina ou da lactona do ácido triacético com os novos derivados de cromonas polissubstituídas. Todos as reações foram executadas em condições suaves e ambientalmente favoráveis, utilizando a 4-pirrolidinopiridina como organocatalisador básico. As estruturas dos novos híbridos polifenólicos foram caracterizados por técnicas espectroscópicas de alta resolução, incluindo espectroscopia de ressonância magnética nuclear (1D e 2D) e por difractometria de raios-X, que nos permitiram resolver o complexidade estrutural dos compostos sintetizados. O quarto capítulo apresenta os resultados da avaliação biológica obtidos com os híbridos polifenólicos sintetizados neste trabalho, mostrando a possibilidade de seu envolvimento na terapia do cancro. A maioria dos compostos foram avaliados quanto ao seu efeito sobre a citotoxicidade e proliferação de células leucémicas e ao seu envolvimento na regulação de via pró-inflamatória NF-kB, na qual, os híbridos de biscumarinas exibiram actividades elevadas (IC50 = 6-19 μM para inibição de NF-kB depois de 8 horas de incubação e IC50 = 15-39 μM para efeitos citotóxicos em células cancerosas, após 24 horas de incubação). Uma inibição moderada das enzimas HDAC e Cdc25 foi induzida pelos derivados de benzofuran-3-ona-hidantoína. Catorze dos novos derivados polifenólicos polissubstituídos, tendo como estrutura básica a benzopiran-4-ona, foram avaliados pela sua actividade quimiopreventiva do cancro mediada pela indução de sinalização citoprotectora Nrf2 (fator 2 relacionado com o fator nuclear da proteína E2) e capacidade para inibir a proliferação das células de cancro da mama. Os derivados da classe das cromanonas foram identificados como os indutores mais potentes da actividade Nrf2. As concentrações necessárias para aumentar a actividade de luciferase em 10 vezes (C10) foram de 2,8-21,3 μM. Todos os novos híbridos polifenólicos que apresentam atividade citotóxica e anti-proliferativa não afectam o crescimento de células saudáveis periféricas do sangue (PBMC) (IC50 > 50 μM), indicando a sua seletividade para as células cancerosas e sugerindo que alguns deles são estruturalmente interessantes para posteriores análises. A avaliação da atividade antioxidante utilizando os testes do radical livre DPPH e o poder redutor do ião férrico FRAP foram realizados em algumas estruturas híbridas polifenólicas.

Características e especificidades de jovens agressores sexuais

Nos últimos anos o estudo da violência sexual juvenil tem vindo a atrair a atenção dos serviços de saúde mental, de justiça juvenil e de políticas públicas, bem como de vários investigadores. Teoricamente existem duas perspetivas explicativas da ocorrência das agressões sexuais cometidas por adolescentes. A perspetiva generalista sugere que os crimes sexuais cometidos por jovens são mais uma manifestação de tendências delinquenciais genéricas, em que as agressões sexuais constituem apenas uma parte do comportamento antissocial do adolescente. A segunda abordagem, denominada de perspetiva especialista, entende que os jovens agressores sexuais se distinguem dos outros adolescentes agressores, argumentando que existem diferentes fatores explicativos das agressões sexuais de outras agressões delinquentes. A presente investigação, composta por cinco estudos, teve como objetivo obter resultados que pudessem contribuir para a discussão internacional sobre qual das perspetivas parece explicar de modo mais apropriado o comportamento sexualmente agressivo de jovens menores de idade. Para o efeito recorreu-se a uma amostra total de 118 adolescentes agressores sexuais (61 violadores e 57 abusadores sexuais de crianças), tendo sido efetuadas análises comparativas com 112 jovens agressores não sexuais e 98 não agressores num conjunto de dimensões (características demográficas, tipológicas, criminais, problemas de comportamento, tendências antissociais, características familiares, sociais e comunitárias e interesses sexuais). Os resultados permitiram observar algumas características diferenciadoras de jovens agressores sexuais por violação de jovens agressores sexuais de crianças. Possibilitaram, igualmente, a observação de características semelhantes entre jovens agressores sexuais e jovens agressores não sexuais, sugerindo que em algumas dimensões são, genericamente, análogas. A exceção parece centrar-se em torno das variáveis relacionadas com a sexualidade (conhecimentos e interesses sexuais atípicos). As implicações destes resultados são discutidas em torno da avaliação psicológica e da avaliação do risco de reincidência, bem como na intervenção e prevenção de comportamentos de agressão sexual juvenil.

Synthesis and functionalization of hydroxyapatite nanoparticles

Graças aos desenvolvimentos na área da síntese de nanomaterais e às potentes técnicas de caracterização à nanoescala conseguimos hoje visualizar uma nanopartícula (NP) como um dispositivo de elevado potencial terapêutico. A melhoria da sua efectividade terapêutica requer no entanto o aprofundamento e sistematização de conhecimentos, ainda muito incipientes, sobre toxicidade, selectividade, efeitos colaterais e sua dependência das próprias características físico-químicas da NP em análise. O presente trabalho, elegendo como alvo de estudo uma substância considerada biocompatível e não tóxica, a hidroxiapatite (Hap), pretende dar um contributo para esta área do conhecimento. Definiram-se como metas orientadoras deste trabalho (i) estudar a síntese de nanoparticulas de Hap (Hap NP), e a modificação das características físico-químicas e morfológicas das mesmas através da manipulação das condições de síntese; (ii) estudar a funcionalização das Hap NP com nanoestruturas de ouro e com ácido fólico, para lhes conferir capacidades acrescidas de imagiologia e terapêuticas, particularmente interessantes em aplicações como o tratamento do cancro (iii) estudar a resposta celular a materiais nanométricos, com propriedades físico-químicas diversificadas. No que se refere à síntese de Hap NP, comparam-se dois métodos de síntese química distintos, a precipitação química a temperatura fisiológica (WCS) e a síntese hidrotérmica (HS), em meios aditivados com ião citrato. A síntese WCS originou partículas de tamanho nanométrico, com uma morfologia de agulha, pouco cristalinas e elevada área superficial especifica. A síntese HS à temperatura de 180ºC permitiu obter partículas de dimensões também nanométricas mas com área específica inferior, com morfologia de bastonete prismático com secção recta hexagonal e elevada cristalinidade. Com o objectivo de aprofundar o papel de algumas variáveis experimentais na definição das características finais das partículas de hidroxiapatite, designadamente o papel do ião citrato (Cit), variou-se a razão molar [Cit/Ca] da solução reagente e o tempo de síntese. Demonstrou-se que o ião citrato e outras espécies químicas resultantes da sua decomposição nas condições térmicas (180ºC) de síntese tem um papel preponderante na velocidade de nucleação e de crescimento dessas mesmas partículas e por conseguinte nas características físico-químicas das mesmas. Elevadas razões [Cit/Ca] originam partículas de dimensão micrométrica cuja morfologia é discutida no contexto do crescimento com agregação. Com o objectivo de avaliar a citotoxicidade in vitro das nanopartículas sintetizadas procedeu-se à esterilização das mesmas. O método de esterilização escolhido foi a autoclavagem a 121º C. Avaliou-se o impacto do processo de esterilização nas características das partículas, verificando-se contrariamente às partículas WCS, que as partículas HS não sofrem alterações significativas de morfologia, o que se coaduna com as condições de síntese das mesmas, que são mais severas do que as de esterilização. As partículas WCS sofrem processos de dissolução e recristalização que se reflectem em alterações significativas de morfologia. Este estudo demonstrou que a etapa de esterilização de nanopartículas para aplicações biomédicas, por autoclavagem, pode alterar substancialmente as propriedades das mesmas, sendo pois criticamente importante caracterizar os materiais após esterilização. Os estudos citotoxicológicos para dois tipos de partículas esterilizadas (HSster e WCSster) revelaram que ambas apresentam baixa toxicidade e possuem potencial para a modelação do comportamento de células osteoblásticas. Tendo em vista a funcionalização da superfície das Hap NP para multifunções de diagnóstico e terapia exploraram-se condições experimentais que viabilizassem o acoplamento de nanopartículas de ouro à superfície das nanopartículas de Hidroxiapatite (Hap-AuNP). Tirando partido da presença de grupos carboxílicos adsorvidos na superfície das nanopartículas de Hap foi possível precipitar partículas nanométricas de ouro (1,5 a 2,5 nm) na superfície das mesmas adaptando o método descrito por Turkevich. No presente trabalho as nanopartículas de Hap funcionaram assim como um template redutor do ouro iónico de solução, propiciando localmente, na superfície das próprias nanopartículas de Hap, a sua redução a ouro metálico. A nucleação do ouro é assim contextualizada pelo papel redutor das espécies químicas adsorvidas, designadamente os grupos carboxílicos derivados de grupos citratos que presidiram à síntese das próprias nanopartículas de Hap. Estudou-se também a funcionalização das Hap NP com ácido fólico (FA), uma molécula biologicamente interessante por ser de fácil reconhecimento pelos receptores existentes em células cancerígenas. Os resultados confirmaram a ligação do ácido fólico à superfície das diferentes partículas produzidas HS e Hap-AuNPs. Graças às propriedades ópticas do ouro nanométrico (efeito plasmão) avaliadas por espectroscopia vis-UV e às potencialidades de hipertermia local por conversão fototérmica, as nanoestruturas Hap-AuNPs produzidas apresentam-se com elevado interesse enquanto nanodispositivos capazes de integrar funções de quimio e terapia térmica do cancro e imagiologia. O estudo da resposta celular aos diversos materiais sintetizados no presente trabalho foi alvo de análise na tentativa de se caracterizar a toxicidade dos mesmos bem como avaliar o seu desempenho em aplicações terapêuticas. Demonstrou-se que as Hap NP não afectam a proliferação das células para concentrações até 500 g/ml, observando-se um aumento na expressão genética da BMP-2 e da fosfatase alcalina. Verificou-se também que as Hap NP são susceptíveis de internalização por células osteoblásticas MG63, apresentando uma velocidade de dissolução intracelular relativamente reduzida. A resposta celular às Hap-AuNP confirmou a não citotoxicidade destas partículas e revelou que a presença do ouro na superfície das Hap NP aumenta a taxa proliferação celular, bem como a expressão de parâmetros osteogénicos. No seu conjunto os resultados sugerem que os vários tipos de partículas sintetizadas no presente estudo apresentam também comportamentos interessantes para aplicações em engenharia de tecido ósseo.

Mining biomedical information from scientific literature

The rapid evolution and proliferation of a world-wide computerized network, the Internet, resulted in an overwhelming and constantly growing amount of publicly available data and information, a fact that was also verified in biomedicine. However, the lack of structure of textual data inhibits its direct processing by computational solutions. Information extraction is the task of text mining that intends to automatically collect information from unstructured text data sources. The goal of the work described in this thesis was to build innovative solutions for biomedical information extraction from scientific literature, through the development of simple software artifacts for developers and biocurators, delivering more accurate, usable and faster results. We started by tackling named entity recognition - a crucial initial task - with the development of Gimli, a machine-learning-based solution that follows an incremental approach to optimize extracted linguistic characteristics for each concept type. Afterwards, Totum was built to harmonize concept names provided by heterogeneous systems, delivering a robust solution with improved performance results. Such approach takes advantage of heterogenous corpora to deliver cross-corpus harmonization that is not constrained to specific characteristics. Since previous solutions do not provide links to knowledge bases, Neji was built to streamline the development of complex and custom solutions for biomedical concept name recognition and normalization. This was achieved through a modular and flexible framework focused on speed and performance, integrating a large amount of processing modules optimized for the biomedical domain. To offer on-demand heterogenous biomedical concept identification, we developed BeCAS, a web application, service and widget. We also tackled relation mining by developing TrigNER, a machine-learning-based solution for biomedical event trigger recognition, which applies an automatic algorithm to obtain the best linguistic features and model parameters for each event type. Finally, in order to assist biocurators, Egas was developed to support rapid, interactive and real-time collaborative curation of biomedical documents, through manual and automatic in-line annotation of concepts and relations. Overall, the research work presented in this thesis contributed to a more accurate update of current biomedical knowledge bases, towards improved hypothesis generation and knowledge discovery.