Synthesis and functionalization of hydroxyapatite nanoparticles

Graças aos desenvolvimentos na área da síntese de nanomaterais e às potentes técnicas de caracterização à nanoescala conseguimos hoje visualizar uma nanopartícula (NP) como um dispositivo de elevado potencial terapêutico. A melhoria da sua efectividade terapêutica requer no entanto o aprofundamento e sistematização de conhecimentos, ainda muito incipientes, sobre toxicidade, selectividade, efeitos colaterais e sua dependência das próprias características físico-químicas da NP em análise. O presente trabalho, elegendo como alvo de estudo uma substância considerada biocompatível e não tóxica, a hidroxiapatite (Hap), pretende dar um contributo para esta área do conhecimento. Definiram-se como metas orientadoras deste trabalho (i) estudar a síntese de nanoparticulas de Hap (Hap NP), e a modificação das características físico-químicas e morfológicas das mesmas através da manipulação das condições de síntese; (ii) estudar a funcionalização das Hap NP com nanoestruturas de ouro e com ácido fólico, para lhes conferir capacidades acrescidas de imagiologia e terapêuticas, particularmente interessantes em aplicações como o tratamento do cancro (iii) estudar a resposta celular a materiais nanométricos, com propriedades físico-químicas diversificadas. No que se refere à síntese de Hap NP, comparam-se dois métodos de síntese química distintos, a precipitação química a temperatura fisiológica (WCS) e a síntese hidrotérmica (HS), em meios aditivados com ião citrato. A síntese WCS originou partículas de tamanho nanométrico, com uma morfologia de agulha, pouco cristalinas e elevada área superficial especifica. A síntese HS à temperatura de 180ºC permitiu obter partículas de dimensões também nanométricas mas com área específica inferior, com morfologia de bastonete prismático com secção recta hexagonal e elevada cristalinidade. Com o objectivo de aprofundar o papel de algumas variáveis experimentais na definição das características finais das partículas de hidroxiapatite, designadamente o papel do ião citrato (Cit), variou-se a razão molar [Cit/Ca] da solução reagente e o tempo de síntese. Demonstrou-se que o ião citrato e outras espécies químicas resultantes da sua decomposição nas condições térmicas (180ºC) de síntese tem um papel preponderante na velocidade de nucleação e de crescimento dessas mesmas partículas e por conseguinte nas características físico-químicas das mesmas. Elevadas razões [Cit/Ca] originam partículas de dimensão micrométrica cuja morfologia é discutida no contexto do crescimento com agregação. Com o objectivo de avaliar a citotoxicidade in vitro das nanopartículas sintetizadas procedeu-se à esterilização das mesmas. O método de esterilização escolhido foi a autoclavagem a 121º C. Avaliou-se o impacto do processo de esterilização nas características das partículas, verificando-se contrariamente às partículas WCS, que as partículas HS não sofrem alterações significativas de morfologia, o que se coaduna com as condições de síntese das mesmas, que são mais severas do que as de esterilização. As partículas WCS sofrem processos de dissolução e recristalização que se reflectem em alterações significativas de morfologia. Este estudo demonstrou que a etapa de esterilização de nanopartículas para aplicações biomédicas, por autoclavagem, pode alterar substancialmente as propriedades das mesmas, sendo pois criticamente importante caracterizar os materiais após esterilização. Os estudos citotoxicológicos para dois tipos de partículas esterilizadas (HSster e WCSster) revelaram que ambas apresentam baixa toxicidade e possuem potencial para a modelação do comportamento de células osteoblásticas. Tendo em vista a funcionalização da superfície das Hap NP para multifunções de diagnóstico e terapia exploraram-se condições experimentais que viabilizassem o acoplamento de nanopartículas de ouro à superfície das nanopartículas de Hidroxiapatite (Hap-AuNP). Tirando partido da presença de grupos carboxílicos adsorvidos na superfície das nanopartículas de Hap foi possível precipitar partículas nanométricas de ouro (1,5 a 2,5 nm) na superfície das mesmas adaptando o método descrito por Turkevich. No presente trabalho as nanopartículas de Hap funcionaram assim como um template redutor do ouro iónico de solução, propiciando localmente, na superfície das próprias nanopartículas de Hap, a sua redução a ouro metálico. A nucleação do ouro é assim contextualizada pelo papel redutor das espécies químicas adsorvidas, designadamente os grupos carboxílicos derivados de grupos citratos que presidiram à síntese das próprias nanopartículas de Hap. Estudou-se também a funcionalização das Hap NP com ácido fólico (FA), uma molécula biologicamente interessante por ser de fácil reconhecimento pelos receptores existentes em células cancerígenas. Os resultados confirmaram a ligação do ácido fólico à superfície das diferentes partículas produzidas HS e Hap-AuNPs. Graças às propriedades ópticas do ouro nanométrico (efeito plasmão) avaliadas por espectroscopia vis-UV e às potencialidades de hipertermia local por conversão fototérmica, as nanoestruturas Hap-AuNPs produzidas apresentam-se com elevado interesse enquanto nanodispositivos capazes de integrar funções de quimio e terapia térmica do cancro e imagiologia. O estudo da resposta celular aos diversos materiais sintetizados no presente trabalho foi alvo de análise na tentativa de se caracterizar a toxicidade dos mesmos bem como avaliar o seu desempenho em aplicações terapêuticas. Demonstrou-se que as Hap NP não afectam a proliferação das células para concentrações até 500 g/ml, observando-se um aumento na expressão genética da BMP-2 e da fosfatase alcalina. Verificou-se também que as Hap NP são susceptíveis de internalização por células osteoblásticas MG63, apresentando uma velocidade de dissolução intracelular relativamente reduzida. A resposta celular às Hap-AuNP confirmou a não citotoxicidade destas partículas e revelou que a presença do ouro na superfície das Hap NP aumenta a taxa proliferação celular, bem como a expressão de parâmetros osteogénicos. No seu conjunto os resultados sugerem que os vários tipos de partículas sintetizadas no presente estudo apresentam também comportamentos interessantes para aplicações em engenharia de tecido ósseo.

Thanks to the last developments in the field of nanomaterials synthesis and to the powerful characterization techniques at the nanoscale, a nanoparticle (NP) can now be viewed as a device of high therapeutic potential. The improvement of its therapeutic effectiveness however still requires the deepening and systematization of important knowledge, still very incipient, on critical related issues including toxicity, selectivity, side effects and their own dependence on the physicochemical characteristics of the NP under analysis. The awareness of this need has framed the present work whose material target is a substance currently considered as biocompatible and nontoxic, hydroxyapatite (Hap), aiming to contribute to the referred pool of knowledge. The guiding goals of this work are here stated as: (i) to study the synthesis of nanoparticles Hap (Hap NP) for understanding the control of particle physico-chemical characteristics through the manipulation of its synthesis conditions, (ii) to study the functionalization of Hap NP with gold and with folic acid in order to impart both imaging and therapy abilities to the synthesized NP thus addressing their usefulness for particular applications related to the treatment of cancer, (iii) to examine the cellular response to nanosized materials having diverse physicochemical properties. For the study of Hap synthesis a hydrothermal synthesis (HS) technique assisted by citric acid additive was followed. The potential of citrate ion (Cit) for tailoring the synthesized particle morphology was exploited by varying the molar ratio [Cit:Ca] of the starting precursor solution. It was demonstrated that the citrate ion and/or other chemical species resulting from citrate decomposition at the used synthesis temperature (180°C) has a major role on nucleation and growth processes of the resulting Hap particles and on their final physico-chemical characteristics. Prismatic Hap particles with hexagonal cross section but with nanometric dimensions were obtained for a low [Cit:Ca] ratio while increasing ratios originated micrometer-sized particles composed by assembled fiber-like or sheet-like particles whose morphology may be discussed in the framework of an aggregation assisted growth. The evaluation of the biological performance of the produced nanometric Hap particles was the natural step in the present study. However, for the goal of comparing the impact of Hap NP morphology variations on cell response, a second chemical precipitation method (WCS) at physiological temperature and using the same additive was also adopted to produce thinner Hap NP. The physico-chemical characteristics of the two precipitated particles, i.e. HS and WCS Hap NP, were comparatively discussed, being found that thin needle-like particles of very high specific surface area (170 m2/g) are obtained from WCS as compared to the prismatic HS particles of lower specific surface area (55 m2/g) but of higher crystallinity. Moreover, as in vitro studies require sterilized materials, the particles were autoclaved at 121º C and the sterilization impact on the particles properties was evaluated as well. Contrarily to WCS particles no significant changes are observed on HS morphology, consistently with the high synthesis temperature conditions for HS NP that exceed largely autoclaving condition. WCS particles undergo dissolution and recrystallization processes which are reflected on significant changes of WCS NP morphology. These results demonstrate that autoclaving sterilization may substantially alter the properties of NP intended for biomedical applications being thus critically important to characterize the materials after sterilization. The in vitro cytotoxicity studies on both type of sterilised particles (HSster and WCSster) revealed that they present low toxicity and have potential for the modulation of the osteoblastic cell behaviour. The possibility of functionalizing Hap NP surface for multifunction purposes (diagnosis and therapy, for instance) was also exploited in the present work. Taking advantage from the presence of adsorbed carboxylic groups left by the synthesis process, HS NP surfaces could be used as a kind of template for gold precipitation, thus providing a new approach to Turkevich method for gold precipitation. Gold nanoparticles with an average diameter of 1.5 to 2.5 nm were effectively precipitated on HS nanoparticles facets as revealed by transmission electron microscopy (TEM). The reducing ability of the species adsorbed on HS surface including carboxylate compounds derived from citrate was thus confirmed as gold ions supplied by the neighbouring gold solution underwent a local reduction giving place to metallic gold spots and hence to nanostructured hydroxyapatite-gold nanoparticles (Hap-AuNPs). The functionalization of Hap NP with folic acid (FA), a molecule with high biological interest due to its easy recognition by the receptors on tumor cells, was also studied. The results confirmed the conjugation of FA to the surface of HS and Hap-AuNPs nanoparticles. Thanks to the optical properties of Hap-AuNPs imparted by the nanometric gold (plasmon effect) as confirmed by UV-vis spectroscopy and to the hyperthermia effect reported for metallic nanometric gold, the Hap-AuNPs here produced show a great potential as nanodevices able to integrate functions of chemical and thermal therapy for cancer and imaging. The cellular response to the various nanomaterials synthesized in this work was also analysed in an attempt to characterize their toxicity and to assess their biological performance aiming to identify potential therapeutic applications. It was demonstrated that Hap NP do not affect MG63 cell proliferation until concentrations up to 500 g/ml, as indicated by BMP-2 and alkaline phosphatase expression. It was also found that Hap NP undergo internalization by MG63 osteoblast cells, suffering a relatively low intracellular dissolution rate. The cellular response to Hap AuNPs confirmed their non-cytotoxicity while showing that the presence of gold at the surface of Hap NP increases the cell proliferation rate and the expression of osteogenic parameters. Altogether the in vitro results suggest that the behavior of the various types of particles synthesized in this study addresses a potential interest for applications in hard tissue engineering.

Doutoramento em Ciência e Engenharia de Materiais