Aluminium toxicity in wheat and rye

Com o presente trabalho pretendeu-se determinar e compreender melhor quais os alvos do Alumínio (Al) nas plantas, e contribuir para um melhor entendimento dos mecanismos de tolerância presentes em genótipos com elevado grau de tolerância ao Al. O Al é um dos maiores constituintes do solo e torna-se biodisponível em solos com baixo pH. Nesses casos, a exposição ao Al afecta negativamente o crescimento das plantas conduzindo a uma diminuição da produção. Estes factos são especialmente visíveis nos cereais, sendo a exposição ao Al uma das principais causas das quebras de produção nestas espécies. O Capítulo I consiste numa revisão geral sobre a toxicidade do Al nas plantas, apontando os seus principais alvos. Apresenta também os mecanismos de resistência, que inclui Al-destoxificação externa e interna, em diferentes espécies. O Capítulo II aborda os estudos sobre a exposição de curto prazo ao Al em duas espécies de cereais: Triticum aestivum L. e Secale cereale L., tendo-se sempre utilizado um genótipo Al-tolerante e um Al-sensível para cada espécie. Este capítulo está dividido em três estudos: no Capítulo II.1 realça-se o efeito da exposição a 185 μM de Al no equilíbrio nutricional em trigo. Verificou-se que em ambos os genótipos (sensível e tolerante) o perfil de macro e micro nutrientes se alterou, tendo uma interferência negativa, sobretudo no nível de P, Mg e K. Além disso, registaram-se diferenças na diferenciação da endoderme consoante o grau de tolerância/sensibilidade do genótipo. No Capítulo II.2 apresenta-se uma visão mais abrangente dos efeitos da exposição a 185 μM de Al em trigo, incluindo parâmetros fisiológicos, estruturais, citológicos e genotóxicos. Demonstra-se, pela primeira vez, que a progressão do ciclo celular é diferentemente regulada, dependendo da tolerância/sensibilidade do genótipo e que, mesmo em zonas já diferenciadas da raiz a exposição ao Al leva à deposição de calose. O Capítulo II.3 aborda os efeitos da exposição de 1.1 mM de Al em centeio, numa perspectiva bastante alargada. Apresenta-se o desequilíbrio nutricional, sobretudo no genótipo sensível, assim como a translocação de Al para a parte aérea nesse mesmo genótipo. Analisa-se também o comportamento de ambos os genótipos no que se refere ao ciclo celular, diferenciação da endoderme, crescimento radicular, reservas de hidratos de carbono, entre outros. Os resultados apontam para estratégias bem definidas adoptadas pelo genótipo tolerante de forma a minimizar a acção do Al no sistema radicular. O Capítulo III compreende a exposição longa ao Al. Dois genótipos de centeio com diferentes graus de tolerância ao Al foram expostos a 1.11 mM e 1.85 mM de Al durante 21 dias, tendo sido usados dois pontos de amostragem (15 e 21 dias). Este capítulo está dividido em dois estudos: No Capítulo III. 1 analisamse os mecanismos antioxidantes (folhas e raízes) como resposta à exposição ao Al, dando-se especial atenção ao ciclo do ascorbato-glutationas. A exposição ao Al levou a stress oxidativo e a alterações na actividade de enzimas antioxidantes e no conteúdo de antioxidantes não-enzimáticos. Demonstra-se que os dois órgãos apresentam respostas diferentes à exposição ao Al e que a capacidade de sobreviver em ambientes ricos em Al depende da eficácia da resposta antioxidante. Para além disso, a resposta do ciclo ascorbato-glutationas parece estar dependente do tipo de órgão, grau de tolerância e do tempo de exposição ao Al. No Capítulo III. 2 analisam-se os efeitos da exposição ao Al na fotossíntese. Verificou-se que o Al afecta negativamente a taxa fotossintética em ambos os genótipos, embora as alterações que o Al provoca nas trocas gasosas e no Ciclo de Calvin sejam dependentes do genótipo. Verificou-se também que os danos no genótipo sensível surgem mais cedo do que no genótipo tolerante, mas que ambos apresentam susceptibilidade ao Al após exposição de longo termo. Por fim, no Capítulo IV são apresentadas as conclusões da Tese de Doutoramento.

Gene expression in understanding mechanisms of toxicity in amphibians

De uma forma geral os anfíbios são conhecidos como organismos que apresentam uma grande sensibilidade a vários tipos de contaminantes. Contudo existem casos, como o de Pelophylax perezi (rã-verde), em que estes organismos habitam áreas extremamente contaminadas. Este facto verifica-se na mina de urânio desactivada, da Cunha Baixa (Viseu, centro de Portugal), em que uma população destas rãs habita na lagoa de efluente ácido mineiro (M). Estudos ecotoxicológicos anteriores com estes organismos revelaram apenas efeitos de toxicidade ténues levantando algumas questões. Com o objectivo de elucidar quais os mecanismos que permitem a P. perezi permanecer neste local, sem sofrer aparentemente efeitos perniciosos, encetamos este trabalho. Numa primeira abordagem, avaliámos o sistema de defesa antioxidante de rãs adultas, bem como o conteúdo em metais de alguns órgãos. Desta forma verificámos alterações enzimáticas, principalmente no pulmão e acumulação de metais nos vários órgãos. Posteriormente foi realizado um estudo de expressão genética diferencial, também em organismos adultos e desta feita foram sugeridos alguns mecanismos de protecção basal que estarão por detrás da capacidade de suportar este ambiente extremamente contaminado. Numa etapa seguinte abordámos os efeitos em fases larvares, fazendo inicialmente uma exposição in situ, a vários efluentes, caracteristicamente diferentes, do complexo mineiro. Avaliámos o crescimento, a acumulação de metais e a actividade de alguns biomarcadores de stress oxidativo. Como resultado pudemos constatar que nas fases larvares para além de alguma mortalidade existe acumulação de metais bem como algumas alterações a nível de biomarcadores de stress oxidativo. Numa última abordagem realizamos uma exposição crónica dos girinos a efluente da mina com diversos níveis de pH para distinguir os efeitos da toxicidade do pH, dos efeitos da toxicidade pelo conteúdo de metais. Para tal avaliámos novamente biomarcadores de stress oxidativo, crescimento, acumulação de metais e efectuamos ainda um estudo de expressão genética diferencial. Esta última aproximação permitiu verificar que a toxicidade do efluente resulta primariamente do pH ácido, assumindo a contaminação por metais um papel secundário. Contudo o crescimento dos girinos de P. perezi apresenta-se estimulado por pHs mais baixos. São apontados ainda alguns mecanismos, em girinos, para lidar com o stress causado pela contaminação por metais.De uma forma geral pôde-se constatar que quer anfíbios adultos quer girinos expostos ao efluente apresentam valores altos de metais acumulados. Os biomarcadores de stress oxidativo na sua maioria não apresentaram respostas coerentes mediante as várias exposições. Este trabalho apresentase como um contributo importante para a ecotoxicologia de anfíbios, aumentando os níveis actuais de conhecimento sobre o efeito de contaminação proveniente de efluentes mineiros, sugerindo ainda mecanismos de resistência quer em larvas, quer para adultos.

Volatile terpenoids and C13 norisoprenoids in wines: development of rapid methods of analysis and evaluation of the sesquiterpenoids biological potential

Vitis vinifera L., the most widely cultivated fruit crop in the world, was the starting point for the development of this PhD thesis. This subject was exploited following on two actual trends: i) the development of rapid, simple, and high sensitive methodologies with minimal sample handling; and ii) the valuation of natural products as a source of compounds with potential health benefits. The target group of compounds under study were the volatile terpenoids (mono and sesquiterpenoids) and C13 norisoprenoids, since they may present biological impact, either from the sensorial point of view, as regards to the wine aroma, or by the beneficial properties for the human health. Two novel methodologies for quantification of C13 norisoprenoids in wines were developed. The first methodology, a rapid method, was based on the headspace solid-phase microextraction combined with gas chromatography-quadrupole mass spectrometry operating at selected ion monitoring mode (HS-SPME/GC-qMS-SIM), using GC conditions that allowed obtaining a C13 norisoprenoid volatile signature. It does not require any pre-treatment of the sample, and the C13 norisoprenoid composition of the wine was evaluated based on the chromatographic profile and specific m/z fragments, without complete chromatographic separation of its components. The second methodology, used as reference method, was based on the HS-SPME/GC-qMS-SIM, allowing the GC conditions for an adequate chromatographic resolution of wine components. For quantification purposes, external calibration curves were constructed with β-ionone, with regression coefficient (r2) of 0.9968 (RSD 12.51 %) and 0.9940 (RSD of 1.08 %) for the rapid method and for the reference method, respectively. Low detection limits (1.57 and 1.10 μg L-1) were observed. These methodologies were applied to seventeen white and red table wines. Two vitispirane isomers (158-1529 L-1) and 1,1,6-trimethyl-1,2-dihydronaphthalene (TDN) (6.42-39.45 μg L-1) were quantified. The data obtained for vitispirane isomers and TDN using the two methods were highly correlated (r2 of 0.9756 and 0.9630, respectively). A rapid methodology for the establishment of the varietal volatile profile of Vitis vinifera L. cv. 'Fernão-Pires' (FP) white wines by headspace solid-phase microextraction combined with comprehensive two-dimensional gas chromatography with time-of-flight mass spectrometry (HS-SPME/GCxGC-TOFMS) was developed. Monovarietal wines from different harvests, Appellations, and producers were analysed. The study was focused on the volatiles that seem to be significant to the varietal character, such as mono and sesquiterpenic compounds, and C13 norisoprenoids. Two-dimensional chromatographic spaces containing the varietal compounds using the m/z fragments 93, 121, 161, 175 and 204 were established as follows: 1tR = 255-575 s, 2tR = 0,424-1,840 s, for monoterpenoids, 1tR = 555-685 s, 2tR = 0,528-0,856 s, for C13 norisoprenoids, and 1tR = 695-950 s, 2tR = 0,520-0,960 s, for sesquiterpenic compounds. For the three chemical groups under study, from a total of 170 compounds, 45 were determined in all wines, allowing defining the "varietal volatile profile" of FP wine. Among these compounds, 15 were detected for the first time in FP wines. This study proposes a HS-SPME/GCxGC-TOFMS based methodology combined with classification-reference sample to be used for rapid assessment of varietal volatile profile of wines. This approach is very useful to eliminate the majority of the non-terpenic and non-C13 norisoprenic compounds, allowing the definition of a two-dimensional chromatographic space containing these compounds, simplifying the data compared to the original data, and reducing the time of analysis. The presence of sesquiterpenic compounds in Vitis vinifera L. related products, to which are assigned several biological properties, prompted us to investigate the antioxidant, antiproliferative and hepatoprotective activities of some sesquiterpenic compounds. Firstly, the antiradical capacity of trans,trans-farnesol, cis-nerolidol, α-humulene and guaiazulene was evaluated using chemical (DPPH• and hydroxyl radicals) and biological (Caco-2 cells) models. Guaiazulene (IC50= 0.73 mM) was the sesquiterpene with higher scavenger capacity against DPPH•, while trans,trans-farnesol (IC50= 1.81 mM) and cis-nerolidol (IC50= 1.48 mM) were more active towards hydroxyl radicals. All compounds, with the exception of α-humulene, at non-cytotoxic levels (≤ 1 mM), were able to protect Caco-2 cells from oxidative stress induced by tert-butyl hydroperoxide. The activity of the compounds under study was also evaluated as antiproliferative agents. Guaiazulene and cis-nerolidol were able to more effectively arrest the cell cycle in the S-phase than trans,trans-farnesol and α-humulene, being the last almost inactive. The relative hepatoprotection effect of fifteen sesquiterpenic compounds, presenting different chemical structures and commonly found in plants and plant-derived foods and beverages, was assessed. Endogenous lipid peroxidation and induced lipid peroxidation with tert-butyl hydroperoxide were evaluated in liver homogenates from Wistar rats. With the exception of α-humulene, all the sesquiterpenic compounds under study (1 mM) were effective in reducing the malonaldehyde levels in both endogenous and induced lipid peroxidation up to 35% and 70%, respectively. The developed 3D-QSAR models, relating the hepatoprotection activity with molecular properties, showed good fit (R2LOO > 0.819) with good prediction power (Q2 > 0.950 and SDEP < 2%) for both models. A network of effects associated with structural and chemical features of sesquiterpenic compounds such as shape, branching, symmetry, and presence of electronegative fragments, can modulate the hepatoprotective activity observed for these compounds. In conclusion, this study allowed the development of rapid and in-depth methods for the assessment of varietal volatile compounds that might have a positive impact on sensorial and health attributes related to Vitis vinifera L. These approaches can be extended to the analysis of other related food matrices, including grapes and musts, among others. In addition, the results of in vitro assays open a perspective for the promising use of the sesquiterpenic compounds, with similar chemical structures such as those studied in the present work, as antioxidants, hepatoprotective and antiproliferative agents, which meets the current challenges related to diseases of modern civilization.

Barrier properties of poly(lactic acid) based films

In recent years, the search for a environmentally friendly products has increased. One of the major challenges has been the demand for biodegradable materials that can replace plastic. If a few decades ago, plastic replaced, for example, the ivory in billiard balls, and in other products, saving the lives of thousands elephants, nowadays a replacement for that plastic is being searched, to prevent the change of the environmental conditions, essential to life in harmonly with the fauna and flora that the human specie has, in recent years, destroyed. Plastic is a petroleum derivate, whose price has been growing exponentially, mainly due to the fact of beind a cheap material and also to enable the production of products that are essential to modern life. Therefore, the petrochemical era is going to come to an end and a new environmentally sustainable era, based on biodegradable materials from renewable sources, will follow. The change to green routes only will be possible with the support of the major companies, and the implementation of drastic governmental law. Poly(lactic acid), PLA, is produced from the lactose present in the corn or sugarcane and has been intensively studied in recent years because if some limitants properties required its extrusion are overcome, it has the potential to replace the traditional polymers. PLA have high brittleness, low toughness and low tensile elongation. In this work, natural antioxidant (alpha-tocopherol) and synthetics antioxidants (BHT ant TBHQ) were added to the PLA with the aim not only to improve their flexibility, but also to create an active packaging to extend the shelf life of the foods and improve the organoleptic properties by preventing food losses. The impact of the addition of antioxidants into the PLA films, in its mechanical, thermal and barrier properties were studied by FTIR, DSC, SEM, AFM, DMA, TGA, QCM and time-lag techniques.

Avanços metodológicos na síntese de novos derivados de flavonas

As estirilflavonas poli-hidroxiladas são compostos heterocíclicos de natureza polifenólica que suscitam interesse devido à atividade biológica que possuem atuando, por exemplo, como antioxidantes. O desenvolvimento de novas rotas de síntese de estirilflavonas constitui um desafio e é neste contexto que se têm efetuado vários estudos sobre a aplicação de reações de acoplamento cruzado catalisadas por paládio, como a reação de Heck, na preparação deste tipo de compostos. Nesta dissertação reporta-se a síntese de (E)-8-estirilflavonas através da reação de Heck de 8-iodoflavonas com derivados de estireno com rendimentos excelentes, descrevendo-se um estudo no qual se optimizaram as condições experimentais desta reação. Adicionalmente, descrevem-se duas tentativas de desmetilação da (E)-8-[2-(4-metoxifenil)vinil]-4’,5,7-trimetoxiflavona. As 8- iodoflavonas foram preparadas com elevada regiosseletividade através da ciclização oxidativa/iodação das (E)-2’-hidroxicalconas correspondentes por aplicação do sistema de reagentes I2/DMSO. A propósito, descreve-se um estudo de ciclização oxidativa/iodação da (E)-2’-hidroxi-4,4’,6’- trimetoxicalcona, no qual se testou a aplicação do sistema de reagentes I2/DMSO na síntese de iodoflavonas em reações one-pot. As (E)-2’- hidroxicalconas foram sintetizadas através da condensação aldólica catalisada por base entre a 2’-hidroxi-4’,6’-dimetoxiacetofenona, previamente preparada, e derivados de benzaldeído. A caraterização estrutural da maioria dos compostos obtidos neste trabalho foi efetuada com base em estudos de espetroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN), nomeadamente de 1H e 13C, e, sempre que possível, em estudos bidimensionais de correlação espetroscópica heteronuclear (HSQC e HMBC), bem como em estudos de espetrometria de massa (EM).