Analysis of the organic matter associated to sea salt : definition of potential molecular markers based on the volatile composition and presence of glycosidic derivatives and polysaccharides

Sea salt is a natural product obtained from the evaporation of seawater in saltpans due to the combined effect of wind and sunlight. Nowadays, there is a growing interest for protection and re-valorisation of saltpans intrinsically associated to the quality of sea salt that can be evaluated by its physico-chemical properties. These man-made systems can be located in different geographical areas presenting different environmental surroundings. During the crystallization process, organic compounds coming from these surroundings can be incorporated into sea salt crystals, influencing their final composition. The organic matter associated to sea salt arises from three main sources: algae, surrounding bacterial community, and anthropogenic activity. Based on the hypothesis that sea salt contains associated organic compounds that can be used as markers of the product, including saltpans surrounding environment, the aim of this PhD thesis was to identify these compounds. With this purpose, this work comprised: 1) a deep characterisation of the volatile composition of sea salt by headspace solid phase microextraction combined with comprehensive two-dimensional gas chromatography time-of-flight mass spectrometry (HS-SPME/GCGC–ToFMS) methodology, in search of potential sea salt volatile markers; 2) the development of a methodology to isolate the polymeric material potentially present in sea salt, in amounts that allow its characterisation in terms of polysaccharides and protein; and 3) to explore the possible presence of triacylglycerides. The high chromatographic resolution and sensitivity of GC×GC–ToFMS enabled the separation and identification of a higher number of volatile compounds from sea salt, about three folds, compared to unidimentional chromatography (GC–qMS). The chromatographic contour plots obtained revealed the complexity of marine salt volatile composition and confirmed the relevance of GC×GC–ToFMS for this type of analysis. The structured bidimentional chromatographic profile arising from 1D volatility and 2D polarity was demonstrated, allowing more reliable identifications. Results obtained for analysis of salt from two locations in Aveiro and harvested over three years suggest the loss of volatile compounds along the time of storage of the salt. From Atlantic Ocean salts of seven different geographical origins, all produced in 2007, it was possible to identify a sub-set of ten compounds present in all salts, namely 6-methyl-5-hepten-2-one, 2,2,6-trimethylcyclohexanone, isophorone, ketoisophorone, β-ionone-5,6-epoxide, dihydroactinidiolide, 6,10,14-trimethyl-2-pentadecanone, 3-hydroxy-2,4,4-trimethylpentyl 2-methylpropanoate, 2,4,4-trimethylpentane-1,3-diyl bis(2-methylpropanoate), and 2-ethyl-1-hexanol. These ten compounds were considered potential volatile markers of sea salt. Seven of these compounds are carotenoid-derived compounds, and the other three may result from the integration of compounds from anthropogenic activity as metabolites of marine organisms. The present PhD work also allowed the isolation and characterisation, for the first time, of polymeric material from sea salt, using 16 Atlantic Ocean salts. A dialysis-based methodology was developed to isolate the polymeric material from sea salt in amounts that allowed its characterisation. The median content of polymeric material isolated from the 16 salts was 144 mg per kg of salt, e.g. 0.014% (w/w). Mid-infrared spectroscopy and thermogravimetry revealed the main occurrence of sulfated polysaccharides, as well as the presence of protein in the polymeric material from sea salt. Sea salt polysaccharides were found to be rich in uronic acid residues (21 mol%), glucose (18), galactose (16), and fucose (13). Sulfate content represented a median of 45 mol%, being the median content of sulfated polysaccharides 461 mg/g of polymeric material, which accounted for 66 mg/kg of dry salt. Glycosidic linkage composition indicates that the main sugar residues that could carry one or more sulfate groups were identified as fucose and galactose. This fact allowed to infer that the polysaccharides from sea salt arise mainly from algae, due to their abundance and composition. The amino acid profile of the polymeric material from the 16 Atlantic Ocean salts showed as main residues, as medians, alanine (25 mol%), leucine (14), and valine (14), which are hydrophobic, being the median protein content 35 mg/g, i.e. 4,9 mg per kg of dry salt. Beside the occurrence of hydrophobic volatile compounds in sea salt, hydrophobic non-volatile compounds were also detected. Triacylglycerides were obtained from sea salt by soxhlet extraction with n-hexane. Fatty acid composition revealed palmitic acid as the major residue (43 mol%), followed by stearic (13), linolenic (13), oleic (12), and linoleic (9). Sea salt triacylglycerides median content was 1.5 mg per kg of dry salt. Both protein and triacylglycerides seem to arise from macro and microalgae, phytoplankton and cyanobacteria, due to their abundance and composition. Despite the variability resulting from saltpans surrounding environment, this PhD thesis allowed the identification of a sea salt characteristic organic compounds profile based on volatile compounds, polysaccharides, protein, and triacylglycerides.

Síntese e transformações de compostos do tipo pirazol e 1,2,3-triazol

Compostos do tipo pirazol e 1,2,3-triazol encontram-se presentes em inúmeras moléculas biologicamente ativas. Muitos fármacos atualmente comercializados ou em fase de estudos clínicos contêm na sua estrutura base núcleos de pirazol ou 1,2,3-triazol. Por isso, estes compostos têm sido alvo de intensa pesquisa na procura de novas moléculas com potenciais aplicações medicinais e agroquímicas. Nesta dissertação são descritas novas vias de síntese de novos compostos do tipo pirazol e 1,2,3-triazol. No primeiro capítulo apresenta-se uma breve revisão bibliográfica sobre a atividade biológica, ocorrência natural e métodos de síntese de pirazóis e seus derivados. O segundo capítulo foca-se na síntese de (E)-2-estiril-3-halo-4H-cromen-4-onas e sua transformação em 3(5)-aril-5(3)-[2-(2-hidroxifenil)-2-oxoetil-1H-pirazóis. Em primeiro lugar faz-se uma revisão bibliográfica sobre as (E)-2-estiril-4H-cromen-4-onas e a sua semelhança estrutural com as flavonas, a sua importância e ocorrência natural e métodos de síntese. São ainda abordadas as metodologias mais utilizadas para a síntese de derivados halogenados de (E)-2-estiril-4H-cromen-4-onas. Seguidamente são apresentados e discutidos os resultados da síntese de (E)-3-bromo-2-estiril-4H-cromen-4-onas através da reação de 5-aril-3-hidroxi-1-(2-hidroxifenil)penta-2,4-dien-1-onas com NBS, sob irradiação com micro-ondas, tendo sido estabelecida uma nova metodologia mais eficiente, rápida e regiosseletiva para a síntese de (E)-3-bromo-2-estiril-4H-cromen-4-onas, na ausência de solvente. São igualmente apresentados os resultados da síntese regiosseletiva de (E)-2-estiril-3-iodo-4H-cromen-4-onas através da reação de 5-aril-3-hidroxi-1-(2-hidroxifenil)penta-2,4-dien-1-onas com NIS e TFA/TFAA/NaOAc. Em ambos os métodos de halogenação desenvolvidos, obtiveram-se como produtos secundários as (E)-2-estiril-4H-cromen-4-onas correspondentes. Seguidamente é apresentado o estudo da reação de (E)-2-estiril-3-halo-4H-cromen-4-onas com hidrato de hidrazina. Ao contrário do esperado, obtiveram-se os 3(5)-aril-5(3)-[2-(2-hidroxifenil)-2-oxoetil-1H-pirazóis através de uma reação de adição conjugada 1,6-, de hidrazina à posição C- da cromona com consequente abertura do anel, seguida de uma adição conjugada 1,4- intramolecular. Estes resultados demonstraram que esta reação segue um mecanismo diferente daquele que está reportado na literatura para a reação de (E)-2-estiril-4H-cromen-4-onas não halogenadas em C-3 com hidrato de hidrazina. No terceiro capítulo apresenta-se uma breve revisão bibliográfica sobre as propriedades, aplicações e metodologias de síntese de 1,2,3-triazóis, dando mais relevância às reações de cicloadição 1,3-dipolar e de “click-chemistry”. Seguidamente descrevem-se os resultados obtidos na reação de (E)-5(3)-estiril-3(5)-(2-hidroxifenil)-1H-pirazóis com a azida de sódio para obtenção de díades pirazol-1,2,3-triazol. No entanto esta reação deu origem a novos 5(3)-(2-aril-2-azidoetil)-3(5)-(2-hidroxifenil)-1H-pirazóis e não às díades pirazol-1,2,3-triazol pretendidas. Como o resultado não foi o esperado, desenvolveu-se outra metodologia de síntese, que envolve, num primeiro, a reação de (E)-2-estiril-4H-cromen-4-onas com azida de sódio, dando origem a 5(4)-aril-4(5)-(cromon-2-il)-1H-1,2,3-triazóis. No passo seguinte, efetuou-se a reação destes compostos com hidrato de hidrazina tendo ocorrido a formação das diades 5(4)-aril-4(5)-[3(5)-(2-hidroxifenil)-1H-pirazol-5(3)-il]-1H-1,2,3-triazol pretendidas. No quarto capítulo, estudou-se a reatividade de (E)-5(3)-estiril-3(5)-(2-hidroxifenil)-1H-pirazóis em reações de iodação com vista à obtenção de 4-iodo-1H-pirazóis. Apresenta-se uma breve revisão bibliográfica sobre os diferentes métodos descritos na literatura para a iodação de compostos heterocíclicos aromáticos, nomeadamente para a obtenção de 4-iodo-1H-pirazóis. Dos vários sistemas de iodação testados, o sistema oxidativo I2/CAN foi o que deu melhores resultados na iodação dos (E)-5(3)-estiril-3(5)-(2-hidroxifenil)-1H-pirazóis. Este método permitiu iodar a posição C-4 do núcleo de pirazol apenas para os derivados que possuem o grupo nitro ou o átomo de cloro no anel do grupo estirilo, obtendo-se o 3(5)-(2-hidroxifenil)-4-iodo-5(3)-(4-nitrofenil)vinil-1H-pirazol e o 5(3)-(4-clorofenil)vinil)-3(5)-(2-hidroxi-5-iodofenil)-4-iodo-1H-pirazol; no entanto, para os restantes derivados, verificou-se apenas a iodação nas posições ativadas do anel fenólico. Todos os novos compostos sintetizados foram caraterizados estruturalmente recorrendo a estudos de espetroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) mono e bidimensionais. Sempre que possível, para uma caraterização estrutural mais completa, foram efetuados espetros de massa (EM) e análises elementares ou espetros de massa de alta resolução (EMAR) para todos os novos compostos sintetizados. Finalmente são apresentadas as conclusões gerais deste trabalho e perspetivas futuras.

Diffusion coefficients in dense and supercritical fluids

Os coeficientes de difusão (D 12) são propriedades fundamentais na investigação e na indústria, mas a falta de dados experimentais e a inexistência de equações que os estimem com precisão e confiança em fases comprimidas ou condensadas constituem limitações importantes. Os objetivos principais deste trabalho compreendem: i) a compilação de uma grande base de dados para valores de D 12 de sistemas gasosos, líquidos e supercríticos; ii) o desenvolvimento e validação de novos modelos de coeficientes de difusão a diluição infinita, aplicáveis em amplas gamas de temperatura e densidade, para sistemas contendo componentes muito distintos em termos de polaridade, tamanho e simetria; iii) a montagem e teste de uma instalação experimental para medir coeficientes de difusão em líquidos e fluidos supercríticos. Relativamente à modelação, uma nova expressão para coeficientes de difusão a diluição infinita de esferas rígidas foi desenvolvida e validada usando dados de dinâmica molecular (desvio relativo absoluto médio, AARD = 4.44%) Foram também estudados os coeficientes de difusão binários de sistemas reais. Para tal, foi compilada uma extensa base de dados de difusividades de sistemas reais em gases e solventes densos (622 sistemas binários num total de 9407 pontos experimentais e 358 moléculas) e a mesma foi usada na validação dos novos modelos desenvolvidos nesta tese. Um conjunto de novos modelos foi proposto para o cálculo de coeficientes de difusão a diluição infinita usando diferentes abordagens: i) dois modelos de base molecular com um parâmetro específico para cada sistema, aplicáveis em sistemas gasosos, líquidos e supercríticos, em que natureza do solvente se encontra limitada a apolar ou fracamente polar (AARDs globais na gama 4.26-4.40%); ii) dois modelos de base molecular biparamétricos, aplicáveis em todos os estados físicos, para qualquer tipo de soluto diluído em qualquer solvente (apolar, fracamente polar e polar). Ambos os modelos dão origem a erros globais entre 2.74% e 3.65%; iii) uma correlação com um parâmetro, específica para coeficientes de difusão em dióxido de carbono supercrítico (SC-CO2) e água líquida (AARD = 3.56%); iv) nove correlações empíricas e semi-empíricas que envolvem dois parâmetros, dependentes apenas da temperatura e/ou densidade do solvente e/ou viscosidade do solvente. Estes últimos modelos são muito simples e exibem excelentes resultados (AARDs entre 2.78% e 4.44%) em sistemas líquidos e supercríticos; e v) duas equações preditivas para difusividades de solutos em SC-CO2, em que os erros globais de ambas são inferiores a 6.80%. No global, deve realçar-se o facto de os novos modelos abrangerem a grande variedade de sistemas e moléculas geralmente encontrados. Os resultados obtidos são consistentemente melhores do que os obtidos com os modelos e abordagens encontrados na literatura. No caso das correlações com um ou dois parâmetros, mostrou-se que estes mesmos parâmetros podem ser ajustados usando um conjunto muito pequeno de dados, e posteriormente serem utilizados na previsão de valores de D 12 longe do conjunto original de pontos. Uma nova instalação experimental para medir coeficientes de difusão binários por técnicas cromatográficas foi montada e testada. O equipamento, o procedimento experimental e os cálculos analíticos necessários à obtenção dos valores de D 12 pelo método de abertura do pico cromatográfico, foram avaliados através da medição de difusividades de tolueno e acetona em SC-CO2. Seguidamente, foram medidos coeficientes de difusão de eucaliptol em SC-CO2 nas gamas de 202 – 252 bar e 313.15 – 333.15 K. Os resultados experimentais foram analisados através de correlações e modelos preditivos para D12.