Genotoxic risk of herbicides to Anguilla anguilla L.

No contexto dos contaminantes aquáticos, os herbicidas são considerados como um dos grupos mais perigosos. Uma vez aplicados, estes são facilmente transportados para cursos de água, quer devido a uma pulverização pouco cuidada ou devido a fenómenos de escorrência superficial e/ou subterrânea. A presença destes agroquímicos no ambiente tem vindo a ser associada a efeitos nefastos em organismos não-alvo, como é o caso dos peixes. Contudo, existe ainda uma grande lacuna no que diz respeito à informação científica relacionada com o seu impacto genotóxico. Deste modo, a presente tese foi delineada com o intuito de avaliar o risco genotóxico em peixes de duas formulações de herbicidas: o Roundup®, que tem como princípio activo o glifosato, e o Garlon®, que apresenta o triclopir na base da sua constituição, produtos estes largamente utilizados na limpeza de campos agrícolas, assim como em florestas. Foi ainda planeado desenvolver uma base de conhecimento no que diz respeito aos mecanismos de dano do ADN. Como último objectivo, pretendeu-se contribuir para a mitigação dos efeitos dos agroquímicos no biota aquático, nomeadamente em peixes, fornecendo dados científicos no sentido de melhorar as práticas agrícolas e florestais. Este estudo foi realizado adoptando a enguia europeia (Anguilla anguilla L.) como organismo-teste, e submetendo-a a exposições de curta duração (1 e 3 dias) dos produtos comerciais mencionados, em concentrações consideradas ambientalmente realistas. Para a avaliação da genotoxicidade foram aplicadas duas metodologias: o ensaio do cometa e o teste das anomalias nucleares eritrocíticas (ANE). Enquanto o ensaio do cometa detecta quebras na cadeia do ADN, um dano passível de ser reparado, o aparecimento das ANE revela lesões cromossomais, sinalizando um tipo de dano de difícil reparação. O ensaio do cometa foi ainda melhorado com uma nova etapa que incluiu a incubação com enzimas de reparação (FPG e EndoIII), permitindo perceber a ocorrência de dano oxidativo no ADN. No que diz respeito ao Roundup®, o envolvimento do sistema antioxidante como indicador de um estado próoxidante foi também alvo de estudo. Uma vez que as referidas formulações se apresentam sob a forma de misturas, o potencial genotóxico dos seus princípios activos foi também avaliado individualmente. No caso particular do Roundup®, também foram estudados o seu surfactante (amina polietoxilada; POEA) e o principal metabolito ambiental (ácido aminometilfosfórico; AMPA). Os resultados obtidos mostraram a capacidade do Roundup® em induzir tanto dano no ADN (em células de sangue, guelras e fígado) como dano cromossómico (em células de sangue). A investigação sobre o possível envolvimento do stresse oxidativo demonstrou que o tipo de dano no ADN varia com as concentrações testadas e com a duração da exposição. Deste modo, com o aumento do tempo de exposição, os processos relacionados com o envolvimento de espécies reactivas de oxigénio (ERO) ganharam preponderância como mecanismo de dano no ADN, facto que é corroborado pela activação do sistema antioxidante observado nas guelras, assim como pelo aumento dos sítios sensíveis a FPG em hepatócitos. O glifosato e o POEA foram também considerados genotóxicos. O POEA mostrou induzir uma maior extensão de dano no ADN, tanto comparado com o glifosato como com a mistura comercial. Apesar de ambos os componentes contribuirem para a genotoxicidade da formulação, a soma dos seus efeitos individuais nunca foi observada, apontando para um antagonismo entre eles e indicando que o POEA não aumenta o risco associado ao princípio activo. Deste modo, realça-se a necessidade de regulamentar limiares de segurança para todos os componentes da formulação, recomendando, em particular, a revisão da classificação do risco do POEA (actualmente classificado com “inerte”). Uma vez confirmada a capacidade do principal metabolito do glifosato – AMPA – em exercer dano no ADN assim como dano cromossómico, os produtos da degradação ambiental dos princípios activos assumem-se como um problema silencioso, realçando assim a importância de incluir o AMPA na avaliação do risco relacionado com herbicidas com base no glifosato. A formulação Garlon® e o seu princípio activo triclopir mostraram um claro potencial genotóxico. Adicionalmente, o Garlon® mostrou possuir um potencial genotóxico mais elevado do que o seu princípio activo. No entanto, a capacidade de infligir dano oxidativo no ADN não foi demonstrada para nenhum dos agentes. No que concerne à avaliação da progressão do dano após a remoção da fonte de contaminação, nem os peixes expostos a Roundup® nem os expostos a Garlon® conseguiram restaurar completamente a integridade do seu ADN ao fim de 14 dias. No que concerne ao Roundup®, o uso de enzimas de reparação de lesões específicas do ADN associado ao teste do cometa permitiu detectar um aparecimento tardio de dano oxidativo, indicando deste modo um decaimento progressivo da protecção antioxidante e ainda uma incapacidade de reparar este tipo de dano. O período de pós-exposição correspondente ao Garlon® revelou uma tendência de diminuição dos níveis de dano, apesar de nunca se observar uma completa recuperação. Ainda assim, foi evidente uma intervenção eficiente das enzimas de reparação do ADN, mais concretamente as direccionadas às purinas oxidadas. A avaliação das metodologias adoptadas tornou evidente que o procedimento base do ensaio do cometa, que detecta apenas o dano nãoespecífico no ADN, possui algumas limitações quando comparado com a metodologia que incluiu a incubação com as enzimas de reparação, uma vez que a última mostrou reduzir a possibilidade de ocorrência de resultados falsos negativos. Os dois parâmetros adoptados (ensaio do cometa e teste das ANE) demonstraram possuir aptidões complementares, sendo assim recomendado a sua utilização conjunta com vista a efectuar uma avaliação mais adequada do risco genotóxico. Globalmente, os resultados obtidos forneceram indicações de grande utilidade para as entidades reguladoras, contribuindo ainda para a (re)formulação de medidas de conservação do ambiente aquático. Neste sentido, os dados obtidos apontam para a importância da avaliação de risco dos herbicidas incluir testes de genotoxicidade. A magnitude de risco detectada para ambas as formulações adverte para a necessidade de adopção de medidas restritivas em relação à sua aplicação na proximidade de cursos de água. Como medidas mitigadoras de impactos ambientais, aponta-se o desenvolvimento de formulações que incorporem adjuvantes selecionados com base na sua baixa toxicidade.

Metabonomics of human amniotic fluid for prenatal diagnostics

O trabalho apresentado nesta tese teve como principais objectivos contribuir para o conhecimento da composição do líquido amniótico humano (LA), colhido no 2º trimestre de gravidez, assim como investigar possíveis alterações na sua composição devido à ocorrência de patologias pré-natais, recorrendo à metabonómica e procurando, assim, definir novos biomarcadores de doenças da grávida e do feto. Após uma introdução descrevendo o estado da arte relacionado com este trabalho (Capítulo 1) e os princípios das metodologias analíticas usadas (Capítulo 2), seguida de uma descrição dos aspectos experimentais associados a esta tese (Capítulo 3), apresentam-se os resultados da caracterização da composição química do LA (gravidez saudável) por espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN), assim como da monitorização da sua estabilidade durante o armazenamento e após ciclos de congelamento-descongelamento (Capítulo 4). Amostras de LA armazenadas a -20°C registaram alterações significativas, tornando-se estas menos pronunciadas (mas ainda mensuráveis) a -70°C, temperatura recomendada para o armazenamento de LA. Foram também observadas alterações de composição após 1-2 ciclos de congelamento-descongelamento (a ter em conta aquando da reutilização de amostras), assim como à temperatura ambiente (indicando um período máximo de 4h para a manipulação e análise de LA). A aquisição de espectros de RMN de 1H de alta resolução e RMN acoplado (LC-NMR/MS) permitiu a detecção de 75 compostos no LA do 2º trimestre, 6 dos quais detectados pela primeira vez no LA. Experiências de difusão (DOSY) permitiram ainda a caracterização das velocidades de difusão e massas moleculares médias das proteínas mais abundantes. O Capítulo 5 descreve o estudo dos efeitos de malformações fetais (FM) e de cromossomopatias (CD) na composição do LA do 2º trimestre de gravidez. A extensão deste trabalho ao estudo dos efeitos de patologias no LA que ocorrem no 3º trimestre de gravidez é descrita no Capítulo 6, nomeadamente no que se refere ao parto pré-termo (PTD), pré-eclampsia (PE), restrição do crescimento intra-uterino (IUGR), ruptura prematura de membranas (PROM) e diabetes mellitus gestacional (GDM). Como complemento a estes estudos, realizou-se uma análise preliminar da urina materna do 2º trimestre para o estudo de FM e GDM, descrita no Capítulo 7. Para interpretação dos dados analíticos, obtidos por espectroscopia RMN de 1H, cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada a espectrometria de massa (UPLC-MS) e espectroscopia do infravermelho médio (MIR), recorreu-se à análise discriminante pelos métodos dos mínimos quadrados parciais e o método dos mínimos quadrados parciais ortogonal (PLS-DA e OPLS-DA) e à correlação espectral. Após análise por validação cruzada de Monte-Carlo (MCCV), os modelos PLS-DA de LA permitiram distinguir as FM dos controlos (sensibilidades 69-85%, especificidades 80-95%, taxas de classificação 80-90%), revelando variações metabólicas ao nível do metabolismo energético, dos metabolismos dos aminoácidos e glícidos assim como possíveis alterações ao nível do funcionamento renal. Observou-se também um grande impacto das FM no perfil metabólico da urina materna (medido por UPLC-MS), tendo no entanto sido registados modelos PLS-DA com menor sensibilidade (40-60%), provavelmente devido ao baixo número de amostras e maior variabilidade da composição da urina (relativamente ao LA). Foram sugeridos possíveis marcadores relacionados com a ocorrência de FM, incluindo lactato, glucose, leucina, valina, glutamina, glutamato, glicoproteínas e conjugados de ácido glucurónico e/ou sulfato e compostos endógenos e/ou exógenos (<1 M) (os últimos visíveis apenas na urina). No LA foram também observadas variações metabólicas devido à ocorrência de vários tipos de cromossomopatias (CD), mas de menor magnitude. Os perfis metabólicos de LA associado a pré- PTD produziram modelos que, apesar do baixo poder de previsão, sugeriram alterações precoces no funcionamento da unidade fetoplacentária, hiperglicémia e stress oxidativo. Os modelos obtidos para os grupos pré- IUGR pré- PE, pré- PROM e pré-diagnóstico GDM (LA e urina materna) registaram baixo poder de previsão, indicando o pouco impacto destas condições na composição do LA e/ou urina do 2º trimestre. Os resultados obtidos demonstram as potencialidades da análise dos perfis metabólicos do LA (e, embora com base em menos estudos, da urina materna) do 2º trimestre para o desenvolvimento de novos e complementares métodos de diagnóstico, nomeadamente para FM e PTD.

Patient classification for intelligent wheelchair adaptation

A importância e preocupação dedicadas à autonomia e independência das pessoas idosas e dos pacientes que sofrem de algum tipo de deficiência tem vindo a aumentar significativamente ao longo das últimas décadas. As cadeiras de rodas inteligentes (CRI) são tecnologias que podem ajudar este tipo de população a aumentar a sua autonomia, sendo atualmente uma área de investigação bastante ativa. Contudo, a adaptação das CRIs a pacientes específicos e a realização de experiências com utilizadores reais são assuntos de estudo ainda muito pouco aprofundados. A cadeira de rodas inteligente, desenvolvida no âmbito do Projeto IntellWheels, é controlada a alto nível utilizando uma interface multimodal flexível, recorrendo a comandos de voz, expressões faciais, movimentos de cabeça e através de joystick. Este trabalho teve como finalidade a adaptação automática da CRI atendendo às características dos potenciais utilizadores. Foi desenvolvida uma metodologia capaz de criar um modelo do utilizador. A investigação foi baseada num sistema de recolha de dados que permite obter e armazenar dados de voz, expressões faciais, movimentos de cabeça e do corpo dos pacientes. A utilização da CRI pode ser efetuada em diferentes situações em ambiente real e simulado e um jogo sério foi desenvolvido permitindo especificar um conjunto de tarefas a ser realizado pelos utilizadores. Os dados foram analisados recorrendo a métodos de extração de conhecimento, de modo a obter o modelo dos utilizadores. Usando os resultados obtidos pelo sistema de classificação, foi criada uma metodologia que permite selecionar a melhor interface e linguagem de comando da cadeira para cada utilizador. A avaliação para validação da abordagem foi realizada no âmbito do Projeto FCT/RIPD/ADA/109636/2009 - "IntellWheels - Intelligent Wheelchair with Flexible Multimodal Interface". As experiências envolveram um vasto conjunto de indivíduos que sofrem de diversos níveis de deficiência, em estreita colaboração com a Escola Superior de Tecnologia de Saúde do Porto e a Associação do Porto de Paralisia Cerebral. Os dados recolhidos através das experiências de navegação na CRI foram acompanhados por questionários preenchidos pelos utilizadores. Estes dados foram analisados estatisticamente, a fim de provar a eficácia e usabilidade na adequação da interface da CRI ao utilizador. Os resultados mostraram, em ambiente simulado, um valor de usabilidade do sistema de 67, baseado na opinião de uma amostra de pacientes que apresentam os graus IV e V (os mais severos) de Paralisia Cerebral. Foi também demonstrado estatisticamente que a interface atribuída automaticamente pela ferramenta tem uma avaliação superior à sugerida pelos técnicos de Terapia Ocupacional, mostrando a possibilidade de atribuir automaticamente uma linguagem de comando adaptada a cada utilizador. Experiências realizadas com distintos modos de controlo revelaram a preferência dos utilizadores por um controlo compartilhado com um nível de ajuda associado ao nível de constrangimento do paciente. Em conclusão, este trabalho demonstra que é possível adaptar automaticamente uma CRI ao utilizador com claros benefícios a nível de usabilidade e segurança.

Avaliação ecológica do efeito combinado de contaminantes ambientais

The assessment of ecological status of lotic freshwater bodies, based on stringent criteria of classification, has been defined by the Water Framework Directive (WFD), as a result of the implementation and optimization of methodologies that integrate physico-chemical, biological, and hydromorphological parameters. It is recognized that the application of this methodology is not easy, because it requires deep technical and scientific knowledge; it is time consuming in its application involving high financial costs. Thus, the main objective of this study was the development of cheaper and faster complementary methodologies that may contribute to the technical application of the classification criteria defined by the WFD, achieving the same final results of evaluation. In order to achieve this main goal, the river Mau, a small mountain river subjected to different stressors (eg, metals, pesticides), was established as the main sampling area. This thesis reviewed the historical development of various biotic indexes and its application in assessing water quality, especially highlighting the new paradigm defined by the WFD, and the corresponding actions developed for optimization and intercalibration of methodologies, evaluating the final state of water bodies. The ecological spatiotemporal characterization of the river Mau focused on the application of the WFD methodology, using at this stage only macroinvertebrates collected during four seasons. Results were compared with historical data of the last three years and they demonstrated that the river is in good condition. However, the ecological quality decreased at certain locations indicating that organisms were subjected to some type of disturbance. As the ecological quality can be conditioned by pulses of contamination from the sediments, in environmental adverse conditions, assays were performed with elutriates, obtained from sediments collected near the mining complex Braçal-Palhal. Results showed that this method was effective achieving the state of contamination, which may be important in prioritizing/scoring of critical areas within river ecosystems potentially impacted, using the WFD methodology. However, this methodology requires the collection of sediment which can promote the modification and / or loss of contaminants. To solve this potential problem, we developed a new methodology to obtain similar results. For this, we used a benthic microalga, belonging to the Portuguese flora, sensitive to organic pollution and metals. This methodology was optimized for application in situ, by immobilization of diatom in calcium alginate beads. The results showedthat their sensitivity and normal growth rate are similar to data obtained when used free cells of diatom. This new methodology allowed the achievement of a very quick response on the degree of contamination of a site, providing a complementary methodology to WFD.

Toxicogenomics of natural and anthropogenic effectors in eleutheroembryos

The introduction of chemicals into the environment by human activities may represent a serious risk to environmental and human health. Environmental risk assessment requires the use of efficient and sensitive tools to determine the impact of contaminants on the ecosystems. The use of zebrafish for the toxicity assessment of pharmaceuticals, drugs, and pollutants, is becoming well accepted due to zebrafish unique advantages for the screening of compounds for hazard identification. The aim of the present work is to apply toxicogenomic approaches to identify novel biomarkers and uncovered potential modes of action of classic and emergent contaminants able to disrupt endocrine systems, such as the Retinoic Acid Receptor, Retinoid X Receptor and the Aryl Hydrocarbon Receptor. This study relies on different nuclear and cytosolic protein receptors and other conditional (ligand- or stress- activated) transcriptional factors that are intimately involved in the regulation of defensome genes and in mechanisms of chemical toxicity. The transcriptomic effects of organic compounds, endogenous compounds, and nanoparticles were analysed during the early stages of zebrafish development. Studying the gene expression profiles of exposed and unexposed organisms to pollutants using microarrays allowed the identification of specific gene markers and to establish a "genetic code" for the tested compounds. Changes in gene expression were observed at toxicant concentrations that did not cause morphological effects. Even at low toxicant concentrations, the observed changes in transcript levels were robust for some target genes. Microarray responses of selected genes were further complemented by the real time quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR) methodology. The combination of bio-informatic, toxicological analyses of differential gene expression profiles, and biochemical and phenotypic responses across the treatments allowed the identification of uncovered potential mechanisms of action. In addition, this work provides an integrated set of tools that can be used to aid management-decision making by improving the predictive capability to measure environmental stress of contaminants in freshwater ecosystems. This study also illustrates the potential of zebrafish embryos for the systematic, large-scale analysis of chemical effects on developing vertebrates.

Volatile terpenoids and C13 norisoprenoids in wines: development of rapid methods of analysis and evaluation of the sesquiterpenoids biological potential

Vitis vinifera L., the most widely cultivated fruit crop in the world, was the starting point for the development of this PhD thesis. This subject was exploited following on two actual trends: i) the development of rapid, simple, and high sensitive methodologies with minimal sample handling; and ii) the valuation of natural products as a source of compounds with potential health benefits. The target group of compounds under study were the volatile terpenoids (mono and sesquiterpenoids) and C13 norisoprenoids, since they may present biological impact, either from the sensorial point of view, as regards to the wine aroma, or by the beneficial properties for the human health. Two novel methodologies for quantification of C13 norisoprenoids in wines were developed. The first methodology, a rapid method, was based on the headspace solid-phase microextraction combined with gas chromatography-quadrupole mass spectrometry operating at selected ion monitoring mode (HS-SPME/GC-qMS-SIM), using GC conditions that allowed obtaining a C13 norisoprenoid volatile signature. It does not require any pre-treatment of the sample, and the C13 norisoprenoid composition of the wine was evaluated based on the chromatographic profile and specific m/z fragments, without complete chromatographic separation of its components. The second methodology, used as reference method, was based on the HS-SPME/GC-qMS-SIM, allowing the GC conditions for an adequate chromatographic resolution of wine components. For quantification purposes, external calibration curves were constructed with β-ionone, with regression coefficient (r2) of 0.9968 (RSD 12.51 %) and 0.9940 (RSD of 1.08 %) for the rapid method and for the reference method, respectively. Low detection limits (1.57 and 1.10 μg L-1) were observed. These methodologies were applied to seventeen white and red table wines. Two vitispirane isomers (158-1529 L-1) and 1,1,6-trimethyl-1,2-dihydronaphthalene (TDN) (6.42-39.45 μg L-1) were quantified. The data obtained for vitispirane isomers and TDN using the two methods were highly correlated (r2 of 0.9756 and 0.9630, respectively). A rapid methodology for the establishment of the varietal volatile profile of Vitis vinifera L. cv. 'Fernão-Pires' (FP) white wines by headspace solid-phase microextraction combined with comprehensive two-dimensional gas chromatography with time-of-flight mass spectrometry (HS-SPME/GCxGC-TOFMS) was developed. Monovarietal wines from different harvests, Appellations, and producers were analysed. The study was focused on the volatiles that seem to be significant to the varietal character, such as mono and sesquiterpenic compounds, and C13 norisoprenoids. Two-dimensional chromatographic spaces containing the varietal compounds using the m/z fragments 93, 121, 161, 175 and 204 were established as follows: 1tR = 255-575 s, 2tR = 0,424-1,840 s, for monoterpenoids, 1tR = 555-685 s, 2tR = 0,528-0,856 s, for C13 norisoprenoids, and 1tR = 695-950 s, 2tR = 0,520-0,960 s, for sesquiterpenic compounds. For the three chemical groups under study, from a total of 170 compounds, 45 were determined in all wines, allowing defining the "varietal volatile profile" of FP wine. Among these compounds, 15 were detected for the first time in FP wines. This study proposes a HS-SPME/GCxGC-TOFMS based methodology combined with classification-reference sample to be used for rapid assessment of varietal volatile profile of wines. This approach is very useful to eliminate the majority of the non-terpenic and non-C13 norisoprenic compounds, allowing the definition of a two-dimensional chromatographic space containing these compounds, simplifying the data compared to the original data, and reducing the time of analysis. The presence of sesquiterpenic compounds in Vitis vinifera L. related products, to which are assigned several biological properties, prompted us to investigate the antioxidant, antiproliferative and hepatoprotective activities of some sesquiterpenic compounds. Firstly, the antiradical capacity of trans,trans-farnesol, cis-nerolidol, α-humulene and guaiazulene was evaluated using chemical (DPPH• and hydroxyl radicals) and biological (Caco-2 cells) models. Guaiazulene (IC50= 0.73 mM) was the sesquiterpene with higher scavenger capacity against DPPH•, while trans,trans-farnesol (IC50= 1.81 mM) and cis-nerolidol (IC50= 1.48 mM) were more active towards hydroxyl radicals. All compounds, with the exception of α-humulene, at non-cytotoxic levels (≤ 1 mM), were able to protect Caco-2 cells from oxidative stress induced by tert-butyl hydroperoxide. The activity of the compounds under study was also evaluated as antiproliferative agents. Guaiazulene and cis-nerolidol were able to more effectively arrest the cell cycle in the S-phase than trans,trans-farnesol and α-humulene, being the last almost inactive. The relative hepatoprotection effect of fifteen sesquiterpenic compounds, presenting different chemical structures and commonly found in plants and plant-derived foods and beverages, was assessed. Endogenous lipid peroxidation and induced lipid peroxidation with tert-butyl hydroperoxide were evaluated in liver homogenates from Wistar rats. With the exception of α-humulene, all the sesquiterpenic compounds under study (1 mM) were effective in reducing the malonaldehyde levels in both endogenous and induced lipid peroxidation up to 35% and 70%, respectively. The developed 3D-QSAR models, relating the hepatoprotection activity with molecular properties, showed good fit (R2LOO > 0.819) with good prediction power (Q2 > 0.950 and SDEP < 2%) for both models. A network of effects associated with structural and chemical features of sesquiterpenic compounds such as shape, branching, symmetry, and presence of electronegative fragments, can modulate the hepatoprotective activity observed for these compounds. In conclusion, this study allowed the development of rapid and in-depth methods for the assessment of varietal volatile compounds that might have a positive impact on sensorial and health attributes related to Vitis vinifera L. These approaches can be extended to the analysis of other related food matrices, including grapes and musts, among others. In addition, the results of in vitro assays open a perspective for the promising use of the sesquiterpenic compounds, with similar chemical structures such as those studied in the present work, as antioxidants, hepatoprotective and antiproliferative agents, which meets the current challenges related to diseases of modern civilization.

Toxicidade de químicos em mistura: o caso da albufeira do Alqueva

In the environment humans and biota are generally exposed to chemical mixtures rather than individual chemicals. Therefore, when assessing the environmental risk of chemicals, it is important to consider chemical mixtures and their possible interactions. The main objective of this work focused on the environmental risk assessment of pesticides found in the water of the Alqueva reservoir and their binary combinations. In this aquatic ecosystem several pesticides were above of the environmental quality standards. But in addition, there were several sampling points of the reservoir where ecotoxicity was observed despite the presence of these contaminants at low concentrations. Here, a component-based approach was used to assess the effects of the pesticide mixtures. The effects of the binary combinations of four herbicides, atrazine (ATR), terbuthylazine (TER), simazine (SIM) and metolachlor (MET), on the growth rate of the microalgae Pseudokirchneriella subcapitata and the effects of the binary combinations of the s-triazine herbicides ATR and TER and the insecticide chlorpyrifos (CPF) on the swimming behaviour and acetylcholinesterase (AChE) activity of the zebrafish Danio rerio were assessed using the two reference models of concentration addition (CA) and independent action (IA). Moreover, the combined effects of the herbicides (ATR, TER and MET) and the insecticide CPF were also tested on the swimming behaviour and AChE activity of the aquatic midge Chironomus riparius after the cholinesterases characterization. In this risk characterization, the calculated risk quotients for the herbicides ATR, TER, SIM and MET were higher than 1, meaning that these herbicides present a high risk for the Alqueva ecosystem. As expected, the microalgae P. subcapitata was the most sensitive species to the herbicides. However, despite these herbicides pose no or low risk to other aquatic organisms tested in this study, with EC50 values much higher than the concentrations found in this aquatic ecosystem, they are able to increase the toxic effects of CPF when they are tested in binary mixtures. Moreover, the risk quotients of mixtures of these herbicides present simultaneously in three different locations of the reservoir were also higher than 1, so this confirms the fact that these herbicides when present in mixtures, present a greater risk for this ecosystem than the expected considering each single chemical by its own.

Characterization of proteotoxic stress in zebrafish

A fidelidade da síntese proteica é fundamental para a estabilidade do proteoma e para a homeostasia celular. Em condições fisiológicas normais as células têm uma taxa de erro basal associada e esta muitas vezes aumenta com o envelhecimento e doença. Problemas na síntese das proteínas estão associados a várias doenças humanas e aos processos de envelhecimento. De facto, a incorporação de erros nas proteínas devido a tRNAs carregados pelas aminoacil-tRNA sintetases com o amino ácido errado causa doenças neurodegenerativas em humanos e ratos. Ainda não é claro como é que estas doenças se desenvolvem e se são uma consequência directa da disrupção do proteoma ou se são o resultado da toxicidade produzida pela acúmulação de proteínas mal traduzidas ao nível do ribossoma. Para elucidar como é que as células eucarióticas lidam com proteínas aberrantes e agregados proteicos (stress proteotóxico) desenvolvemos uma estratégia para destabilizar o proteoma. Para isso estabelecemos um sistema de erros de tradução em embriões de peixe zebra que assenta em tRNAs mutantes capazes de incorporar erradamente serina nas proteínas. As proteínas produzidas neste sistema despoletam as vias de resposta ao stress, nomeadamente a via da ubiquitina-proteassoma (UPP – “ubiquitin protesome pathway”) e a via do retículo endoplasmático (UPR – “unfolded protein response”). O stress proteotóxico gerado pelos erros de tradução altera a expressão génica e perfis de expressão de miRNAs, o desenvolvimento embrionário e viabilidade, aumenta a produção de espécies reactivas de oxigénio (ROS), leva ainda à acumulação de agregados proteicos e à disfunção mitocondrial. As malformações embrionárias e fenótipos de viabilidade que observámos foram revertidos por antioxidantes, o que sugere que os ROS desempenham papéis importantes nos fenótipos degenerativos celulares induzidos pela produção de proteínas aberrantes e agregação proteica. Estabelecemos ainda uma linha de peixe zebra transgénica para o estudo do stress proteotóxico. Este trabalho mostra que a destabilização do proteoma em embriões de peixe zebra com tRNAs mutantes é uma boa metodologia para estudar a biologia do stress proteotóxico visto que permite a agregação controlada do proteoma, mimetizando os processos de agregação de proteínas que ocorrem naturalmente durante o envelhecimento e em doenças conformacionais humanas.

Challenges in mercury speciation and fractionation in soil and sediment

This investigation focused on the development, test and validation of methodologies for mercury fractionation and speciation in soil and sediment. After an exhaustive review of the literature, several methods were chosen and tested in well characterised soil and sediment samples. Sequential extraction procedures that divide mercury fractions according to their mobility and potential availability in the environment were investigated. The efficiency of different solvents for fractionation of mercury was evaluated, as well as the adequacy of different analytical instruments for quantification of mercury in the extracts. Kinetic experiments to establish the equilibrium time for mercury release from soil or sediment were also performed. It was found that in the studied areas, only a very small percentage of mercury is present as mobile species and that mobility is associated to higher aluminium and manganese contents, and that high contents of organic matter and sulfur result in mercury tightly bound to the matrix. Sandy soils tend to release mercury faster that clayey soils, and therefore, texture of soil or sediment has a strong influence on the mobility of mercury. It was also understood that analytical techniques for quantification of mercury need to be further developed, with lower quantification limits, particularly for mercury quantification of less concentrated fractions: water-soluble e exchangeable. Although the results provided a better understanding of the distribution of mercury in the sample, the complexity of the procedure limits its applicability and robustness. A proficiency-testing scheme targeting total mercury determination in soil, sediment, fish and human hair was organised in order to evaluate the consistency of results obtained by different laboratories, applying their routine methods to the same test samples. Additionally, single extractions by 1 mol L-1 ammonium acetate solution, 0.1 mol L-1 HCl and 0.1 mol L-1 CaCl2, as well as extraction of the organometallic fraction were proposed for soil; the last was also suggested for sediment and fish. This study was important to update the knowledge on analytical techniques that are being used for mercury quantification, the associated problems and sources of error, and to improve and standardize mercury extraction techniques, as well as to implement effective strategies for quality control in mercury determination. A different, “non chemical-like” method for mercury species identification was developed, optimised and validated, based on the thermo-desorption of the different mercury species. Compared to conventional extraction procedures, this method has advantages: it requires little to no sample treatment; a complete identification of species present is obtained in less than two hours; mercury losses are almost neglectable; can be considered “clean”, as no residues are produced; the worldwide comparison of results obtained is easier and reliable, an important step towards the validation of the method. Therefore, the main deliverables of this PhD thesis are an improved knowledge on analytical procedures for identification and quantification of mercury species in soils and sediments, as well as a better understanding of the factors controlling the behaviour of mercury in these matrices.

Silver nanoparticles flow in an aquatic trophic chain

Silver nanoparticles (AgNP) have been produced and applied in a variety of products ranging from personal care products to food package containers, clothing and medicine utilities. The antimicrobial function of AgNP makes it very useful to be applied for such purposes. Silver (Ag) is a non-essential metal for organisms, and it has been historically present in the environment at low concentrations. Those concentrations of silver increased in the last century due to the use of Ag in the photographic industry and lately are expected to increase due to the use of AgNPs in consumer products. The presence of AgNP in the aquatic environment may pose a risk for aquatic species, and the effects can vary from lethal to sublethal effects. Moreover, the contact of aquatic organisms with AgNP may not cause immediately the death of individuals but it can be accumulated inside the animals and consequently transferred within the food chain. Considering this, the objective of this work was to study the transfer of silver nanoparticles in comparison to silver ions, which was used as silver nitrate, within an aquatic food chain model. To achieve this goal, this study was divided into four steps: the toxicity assessment of AgNP and AgNO3 to aquatic test-species, the bioaccumulation assessment of AgNP and AgNO3 by Pseudokirchneriella subcapitata and Daphnia magna under different exposure scenarios, and finally the evaluation of the trophic transfer of Ag through an experimental design that included the goldfish Carassius auratus in a model trophic chain in which all the species were exposed to the worse-case scenario. We observed that the bioconcentration of Ag by P. subcapitata is mainly driven by ionic silver, and that algae cannot internalize these AgNPs, but it does internalizes dissolved Ag. Daphnia magna was exposed to AgNP and AgNO3 through different exposure routes: water, food and both water and food. The worse-case scenario for Daphnia Ag bioaccumulation was by the joint exposure of contaminated water and food, showing that Ag body burdens were higher for AgNPs than for AgNO3. Finally, by exposing C. auratus for 10 days through contaminated water and food (supplied as D. magna), with another 7 days of depuration phase, it was concluded that the 10 days of exposure were not enough for fish to reach a plateau on Ag internal concentration, and neither the 7 days of elimination were sufficient to cause total depuration of the accumulated Ag. Moreover, a higher concentration of Ag was found in the intestine of fish when compared with other organs, and the elimination rate constant of AgNP in the intestine was very low. Although a potential for trophic transfer of AgNP cannot be suggested based in the data acquired in this study, there is still a potential environmental risk for aquatic species.

Effect of vehicle characteristics on safety, fuel use and emissions

Nos últimos anos, o número de vítimas de acidentes de tráfego por milhões de habitantes em Portugal tem sido mais elevado do que a média da União Europeia. Ao nível nacional torna-se premente uma melhor compreensão dos dados de acidentes e sobre o efeito do veículo na gravidade do mesmo. O objetivo principal desta investigação consistiu no desenvolvimento de modelos de previsão da gravidade do acidente, para o caso de um único veículo envolvido e para caso de uma colisão, envolvendo dois veículos. Além disso, esta investigação compreendeu o desenvolvimento de uma análise integrada para avaliar o desempenho do veículo em termos de segurança, eficiência energética e emissões de poluentes. Os dados de acidentes foram recolhidos junto da Guarda Nacional Republicana Portuguesa, na área metropolitana do Porto para o período de 2006-2010. Um total de 1,374 acidentes foram recolhidos, 500 acidentes envolvendo um único veículo e 874 colisões. Para a análise da segurança, foram utilizados modelos de regressão logística. Para os acidentes envolvendo um único veículo, o efeito das características do veículo no risco de feridos graves e/ou mortos (variável resposta definida como binária) foi explorado. Para as colisões envolvendo dois veículos foram criadas duas variáveis binárias adicionais: uma para prever a probabilidade de feridos graves e/ou mortos num dos veículos (designado como veículo V1) e outra para prever a probabilidade de feridos graves e/ou mortos no outro veículo envolvido (designado como veículo V2). Para ultrapassar o desafio e limitações relativas ao tamanho da amostra e desigualdade entre os casos analisados (apenas 5.1% de acidentes graves), foi desenvolvida uma metodologia com base numa estratégia de reamostragem e foram utilizadas 10 amostras geradas de forma aleatória e estratificada para a validação dos modelos. Durante a fase de modelação, foi analisado o efeito das características do veículo, como o peso, a cilindrada, a distância entre eixos e a idade do veículo. Para a análise do consumo de combustível e das emissões, foi aplicada a metodologia CORINAIR. Posteriormente, os dados das emissões foram modelados de forma a serem ajustados a regressões lineares. Finalmente, foi desenvolvido um indicador de análise integrada (denominado “SEG”) que proporciona um método de classificação para avaliar o desempenho do veículo ao nível da segurança rodoviária, consumos e emissões de poluentes.Face aos resultados obtidos, para os acidentes envolvendo um único veículo, o modelo de previsão do risco de gravidade identificou a idade e a cilindrada do veículo como estatisticamente significativas para a previsão de ocorrência de feridos graves e/ou mortos, ao nível de significância de 5%. A exatidão do modelo foi de 58.0% (desvio padrão (D.P.) 3.1). Para as colisões envolvendo dois veículos, ao prever a probabilidade de feridos graves e/ou mortos no veículo V1, a cilindrada do veículo oposto (veículo V2) aumentou o risco para os ocupantes do veículo V1, ao nível de significância de 10%. O modelo para prever o risco de gravidade no veículo V1 revelou um bom desempenho, com uma exatidão de 61.2% (D.P. 2.4). Ao prever a probabilidade de feridos graves e/ou mortos no veículo V2, a cilindrada do veículo V1 aumentou o risco para os ocupantes do veículo V2, ao nível de significância de 5%. O modelo para prever o risco de gravidade no veículo V2 também revelou um desempenho satisfatório, com uma exatidão de 40.5% (D.P. 2.1). Os resultados do indicador integrado SEG revelaram que os veículos mais recentes apresentam uma melhor classificação para os três domínios: segurança, consumo e emissões. Esta investigação demonstra que não existe conflito entre a componente da segurança, a eficiência energética e emissões relativamente ao desempenho dos veículos.

Pregnancy and newborns disorders followed by urine metabolomics

Chapter 1 introduces the scope of the work by identifying the clinically relevant prenatal disorders and presently available diagnostic methods. The methodology followed in this work is presented, along with a brief account of the principles of the analytical and statistical tools employed. A thorough description of the state of the art of metabolomics in prenatal research concludes the chapter, highlighting the merit of this novel strategy to identify robust disease biomarkers. The scarce use of maternal and newborn urine in previous reports enlightens the relevance of this work. Chapter 2 presents a description of all the experimental details involved in the work performed, comprising sampling, sample collection and preparation issues, data acquisition protocols and data analysis procedures. The proton Nuclear Magnetic Resonance (NMR) characterization of maternal urine composition in healthy pregnancies is presented in Chapter 3. The urinary metabolic profile characteristic of each pregnancy trimester was defined and a 21-metabolite signature found descriptive of the metabolic adaptations occurring throughout pregnancy. 8 metabolites were found, for the first time to our knowledge, to vary in connection to pregnancy, while known metabolic effects were confirmed. This chapter includes a study of the effects of non-fasting (used in this work) as a possible confounder. Chapter 4 describes the metabolomic study of 2nd trimester maternal urine for the diagnosis of fetal disorders and prediction of later-developing complications. This was achieved by applying a novel variable selection method developed in the context of this work. It was found that fetal malformations (FM) (and, specifically those of the central nervous system, CNS) and chromosomal disorders (CD) (and, specifically, trisomy 21, T21) are accompanied by changes in energy, amino acids, lipids and nucleotides metabolic pathways, with CD causing a further deregulation in sugars metabolism, urea cycle and/or creatinine biosynthesis. Multivariate analysis models´ validation revealed classification rates (CR) of 84% for FM (87%, CNS) and 85% for CD (94%, T21). For later-diagnosed preterm delivery (PTD), preeclampsia (PE) and intrauterine growth restriction (IUGR), it is found that urinary NMR profiles have early predictive value, with CRs ranging from 84% for PTD (11-20 gestational weeks, g.w., prior to diagnosis), 94% for PE (18-24 g.w. pre-diagnosis) and 94% for IUGR (2-22 g.w. pre-diagnosis). This chapter includes results obtained for an ultraperformance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS) study of pre-PTD samples and correlation with NMR data. One possible marker was detected, although its identification was not possible. Chapter 5 relates to the NMR metabolomic study of gestational diabetes mellitus (GDM), establishing a potentially predictive urinary metabolic profile for GDM, 2-21 g.w. prior to diagnosis (CR 83%). Furthermore, the NMR spectrum was shown to carry information on individual phenotypes, able to predict future insulin treatment requirement (CR 94%). Chapter 6 describes results that demonstrate the impact of delivery mode (CR 88%) and gender (CR 76%) on newborn urinary profile. It was also found that newborn prematurity, respiratory depression, large for gestational age growth and malformations induce relevant metabolic perturbations (CR 82-92%), as well as maternal conditions, namely GDM (CR 82%) and maternal psychiatric disorders (CR 91%). Finally, the main conclusions of this thesis are presented in Chapter 7, highlighting the value of maternal or newborn urine metabolomics for pregnancy monitoring and disease prediction, towards the development of new early and non-invasive diagnostic methods.

Contributos para a eficácia do clustering usando o tagging social

Nos últimos anos temos vindo a assistir a uma mudança na forma como a informação é disponibilizada online. O surgimento da web para todos possibilitou a fácil edição, disponibilização e partilha da informação gerando um considerável aumento da mesma. Rapidamente surgiram sistemas que permitem a coleção e partilha dessa informação, que para além de possibilitarem a coleção dos recursos também permitem que os utilizadores a descrevam utilizando tags ou comentários. A organização automática dessa informação é um dos maiores desafios no contexto da web atual. Apesar de existirem vários algoritmos de clustering, o compromisso entre a eficácia (formação de grupos que fazem sentido) e a eficiência (execução em tempo aceitável) é difícil de encontrar. Neste sentido, esta investigação tem por problemática aferir se um sistema de agrupamento automático de documentos, melhora a sua eficácia quando se integra um sistema de classificação social. Analisámos e discutimos dois métodos baseados no algoritmo k-means para o clustering de documentos e que possibilitam a integração do tagging social nesse processo. O primeiro permite a integração das tags diretamente no Vector Space Model e o segundo propõe a integração das tags para a seleção das sementes iniciais. O primeiro método permite que as tags sejam pesadas em função da sua ocorrência no documento através do parâmetro Social Slider. Este método foi criado tendo por base um modelo de predição que sugere que, quando se utiliza a similaridade dos cossenos, documentos que partilham tags ficam mais próximos enquanto que, no caso de não partilharem, ficam mais distantes. O segundo método deu origem a um algoritmo que denominamos k-C. Este para além de permitir a seleção inicial das sementes através de uma rede de tags também altera a forma como os novos centróides em cada iteração são calculados. A alteração ao cálculo dos centróides teve em consideração uma reflexão sobre a utilização da distância euclidiana e similaridade dos cossenos no algoritmo de clustering k-means. No contexto da avaliação dos algoritmos foram propostos dois algoritmos, o algoritmo da “Ground truth automática” e o algoritmo MCI. O primeiro permite a deteção da estrutura dos dados, caso seja desconhecida, e o segundo é uma medida de avaliação interna baseada na similaridade dos cossenos entre o documento mais próximo de cada documento. A análise de resultados preliminares sugere que a utilização do primeiro método de integração das tags no VSM tem mais impacto no algoritmo k-means do que no algoritmo k-C. Além disso, os resultados obtidos evidenciam que não existe correlação entre a escolha do parâmetro SS e a qualidade dos clusters. Neste sentido, os restantes testes foram conduzidos utilizando apenas o algoritmo k-C (sem integração de tags no VSM), sendo que os resultados obtidos indicam que a utilização deste algoritmo tende a gerar clusters mais eficazes.

Interactions of cetaceans with Spanish and Portuguese fisheries in Atlantic waters : costs, benefits and implications for management

With the aim to provide new insights into operational cetacean-fishery interactions in Atlantic waters, this thesis assesses interactions of cetaceans with Spanish and Portuguese fishing vessels operating in Iberian and South West Atlantic waters. Different opportunistic research methodologies were applied, including an interview survey with fishers (mainly skippers) and onboard observations by fisheries observers and skippers, to describe different types of interactions and to identify potential hotspots for cetacean-fishery interactions and the cetacean species most involved, and to quantify the extent and the consequences of these interactions in terms of benefits and costs for cetaceans and fisheries. In addition, the suitability of different mitigation strategies was evaluated and discussed. The results of this work indicate that cetaceans interact frequently with Spanish and Portuguese fishing vessels, sometimes in a beneficial way (e.g. cetaceans indicate fish schools in purse seine fisheries), but mostly with negative consequences (depredation on catch, gear damage and cetacean bycatch). Significant economic loss and high bycatch rates are, however, only reported for certain fisheries and associated with particular cetacean species. In Galician fisheries, substantial economic loss was reported as a result of bottlenose dolphins damaging artisanal coastal gillnets, while high catch loss may arise from common dolphins scattering fish in purse seine fisheries. High cetacean bycatch mortality arises in trawl fisheries, mainly of common dolphin and particularly during trawling in water depths below 350 m, and in coastal set gillnet fisheries (mainly common and bottlenose dolphins). In large-scale bottom-set longline fisheries in South West Atlantic waters, sperm whales may significantly reduce catch rates through depredation on catch. The high diversity of cetacean-fishery interactions observed in the study area indicates that case-specific management strategies are needed to reduce negative impacts on fisheries and cetaceans. Acoustic deterrent devices (pingers) may be used to prevent small cetaceans from approaching and getting entangled in purse seines and set gillnets, although possible problems include cetacean habituation to the pinger sounds, as well as negative side effects on non-target cetaceans (habitat exclusion) and fisheries target species (reduced catch rates). For sardine and horse mackerel, target species of Iberian Atlantic fisheries, no aversive reaction to pinger sounds was detected during tank experiments conducted in the scope of this thesis. Bycatch in trawls may be reduced by the implementation of time/area restrictions of fishing activity. In addition, the avoidance of fishing areas with high cetacean abundance combined with the minimization of fishery-specific sound cues that possibly attract cetaceans, may also help to decrease interactions. In large-scale bottom-set longline fisheries, cetacean depredation on catch may be reduced by covering hooked fish with net sleeves ("umbrellas") provided that catch rates are not negatively affected by this gear modification. Trap fishing, as an alternative fishing method to bottom-set gillnetting and longlining, also has the potential to reduce cetacean bycatch and depredation, given that fish catch rates are similar to the rates obtained by bottom-set gillnets and longlines, whereas cetacean by-catch is unlikely. Economic incentives, such as the eco-certification of dolphin-safe fishing methods, should be promoted in order to create an additional source of income for fishers negatively affected by interactions with cetaceans, which, in turn, may also increase fishers’ willingness to accept and adopt mitigation measures. Although the opportunistic sampling methods applied in this work have certain restrictions concerning their reliability and precision, the results are consistent with previous studies in the same area. Moreover, they allow for the active participation of fishers that can provide important complementary ecological and technical knowledge required for cetacean management and conservation.

Brazilian savanna forest : conservation, medicinal reservoir and bioprospecting

This study aimed to analyse the Brazilian savanna forest from a Legal Reserve (LR) area from a perspective of conservation, reservoir of organic carbon and medicinal biomass for a prospective use of native medicinal plants. An ethnobotanical and ethnopharmacological survey was carried out close to a community settled in the rural area in the south of Tocantins, being selected 9 of the most cited species (cajuí- Anacardium othonianum; inharé-Brosimum gaudichaudii; jatobá-Hymenaeae courbaril; jenipapo-Genipa americana, aroeira-Myracrodruon urundeuva; negramina-Siparuna guianensis; barbatimão- Stryphnodendron obovatum; assa peixe-Vernonia brasiliana, embaúba-Cecropia pachystachya). Crude foliar extracts were subjected to a preliminary phytochemical prospection and triage of secondary metabolites with antimicrobial activity of potential interest in health and familiar agriculture. Phenolic compounds, terpenes and flavonoids were detected in the extracts of most species, which suggests the presence of antimicrobial, antioxidant and anti-insect activities. It was evident the need to better know the LR as a reservoir of medicinal biomass in an area under ecological tension where 35% (610ha) of the property is LR and should be protected by law. Therefore, a forest inventory of live woody species was performed using the allometric or indirect method. This identified a rare remnant of Semidecidual Seasonal Forest amidst the largest world savannah, the Cerrado biome. An analysis of the forest average productivity per basal area (m².ha), aerial live biomass (ton.ha-1) and carbon stock was carried out. The forest fragment was considered relatively rich in species and diversity, although showing signs of disturbance and dominance by a few species. Its horizontal structure suggests biotic regeneration conditions. It is an important reservoir of medicinal plants. Of the families (57.5%) presenting medicinal species, 19 from a total of 33 are represented in the area and contain 44% (27) of the total species (61) and 63% (432) of the total individuals catalogued. Medicinal species have ecological importance for the equilibrium of the local flora and represent 80% of the 10 species with higher Importance Value Index (IVI): Tetragastris altissima, Chrysophyllum marginatum, Oenocarpus distichus, Sclerolobium paniculatum, Simarouba versicolor, Alibertia macrophylla, Siparuna guianensis, Maprounea guianensis, Licania parvifolia e Physocalymma scaberrimum. Medicinal productivity was high for this type of phytophysionomy: 183,2 ton. ha-1 of biomass and 91,51 ton. ha-1 of carbon representing 66% of the total biomass and carbon of this Cerrado forest. From this stage S. guianensis (Siparunaceae) was selected for performing bioassays in order to verify its biological activity against microorganisms of health and agricultural relevance. This is a native aromatic medicinal plant recommended as priority for conservation, with local popular medicinal validation and availability of medicinal feedstock (3300 Kg.ha-1), with the foliar fraction giving 38Kg/ha of crude extract and 5L/ha of essential oil. Foliar crude extracts and essential oil were obtained and tested in vitro using a disk diffusion bioassay. Different concentrations of these natural products were tested against gram-positive bacteria (Staphylococcus aureus ATCC 29213), gram-negative bacteria (Escherichia coli ATCC 25922 and ATCC 35218; Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145) and fungi (Candida albicans ATCC 6258 e Fusarium oxysporum). The essential oil inhibited the growth of S. aureus in its crude concentration (380μg.mL-1), as well as diluted to half (190μg.mL-1) and a quarter strength (95μg.mL-1). It’s likely that such action is due to sesquiterpenes major components, such as bisabolol and bisabolene (10.35%), measured by gas chromatography (GC-MS, GC-FID). Extracts did not exhibit any antimicrobial activity against the microorganisms tested. The native medicinal plants prospective market is an alternative that favours the conservation of biodiversity while generating benefits for the development of sustainable family productive activities within local ecosystems instead of the current inappropriate uses. This strengthens conservation policies of Legal Reserve in rural settlements and is in agreement with public policy on global warming and climate changes.