Efecto de ácido abscísico y giberelina A3 sobre la anatomía de tejidos vasculares y la expresión génica de transportadores de azúcares en plantas de vid (Vitis vinifera L.) cv. Malbec

La calidad de los vinos es dependiente de la calidad de las bayas, y ésta, a su vez, es dependiente de la acumulación y metabolismo de azúcares. Se conoce que el ácido abscísico (ABA) y las giberelinas (GAs) regulan la acumulación de carbohidratos en muchos cultivos de importancia económica, pero los mecanismos por los cuales sucede aún se desconocen. El trabajo desarrollado en la presente tesis tuvo como objetivo principal determinar si la mayor concentración de azúcares en bayas de vid (Vitis vinifera L.) cv. Malbec, mediada por ABA y GAs, se debe a una modificación en la carga floemática de órganos fuentes (hojas), en el área del floema y/o en la expresión de genes que codifican para transportadores de azúcares. Para lograr el objetivo propuesto, se planteó un experimento con plantas de vid (Vitis vinifera L.) cv. Malbec en macetas sometidas a condiciones de campo y asperjadas con ABA (250 mg L-1) y ácido giberélico (GA3, 500 mg L-1). Se midieron variables de crecimiento, fisiológicas, bioquímicas, anatómicas y expresión de genes. En ambos tratamientos se observó una mayor concentración de sacarosa en las hojas, en envero, y una disminución significativa en la expresión relativa de los genes que codifican para transportadores de azúcares en dicho tejido. Además, las plantas tratadas con GA3 presentaron un crecimiento exacerbado de la parte aérea coincidente con una mayor partición de fotoasimilados hacia el tallo de las mismas. Por su parte las aplicaciones con ABA favorecieron el transporte de carbono hacia las bayas durante envero, coincidente con la sobre-expresión de los genes VvHT2, VvHT3 y VvHT6. Debido a este comportamiento diferencial, el tratamiento con ABA aceleró el inicio de la maduración de las bayas mientras que el tratamiento con GA3 lo retrasó. Contrariamente, las bayas tratadas con GA3 mostraron las mayores concentraciones de monosacáridos en post-envero, en correlación con la sobre-expresión de los genes VvHT2 y VvHT3. Por otro lado, ambos tratamientos incrementaron el área del floema y xilema en la nervadura central de las hojas, en tallos y en el pedicelo de las bayas. Como conclusión, se postula que la estimulación del transporte de carbono hacia las bayas y tallos mediada por ABA y GA3 respectivamente, fue producto de modificaciones en la concentración de carbohidratos no estructurales en hojas, en el área del tejido floemático como así también de la expresión de los transportadores de azúcares en las bayas.

Manipulación de la senescencia de alfalfa (Medicago sativa L.) por ingeniería genética

En plantas forrajeras como la alfalfa, la senescencia foliar produce tanto una pérdida de la biomasa de forraje como una reducción de la calidad del mismo. Una estrategia molecular para retrasar la senescencia mediante la ingeniería genética se basa en la expresión de la secuencia codificante de la isopentenil transferasa (ipt), enzima clave en la biosíntesis de citoquininas. Para lograrlo resulta crítico la utilización de promotores con expresión no constitutiva que permitan la producción sitio-específica y autorregulada de citoquininas. La manipulación de la senescencia constituye un objetivo particularmente atractivo en especies forrajeras. Se transformaron clones de alfalfa con las construcción AtMYB32-ipt, se logró la regeneración de 3 plantas transgénicas, las cuales fueron confirmadas por PCR al amplificar el transgen ipt. La expresión del transgen se confirmó por RT-PCR y a través de la técnica de Southern blot se observó un patrón de inserción múltiple. También se estableció el patrón de expresión de la construcción AtMYB32-gus, la cual se limitó a los tejidos vasculares, con cierta variabilidad de expresión en la parte aérea las plantas. Los fenotipos observados en las plantas AtMYB32-ipt fueron desde plantas normales a plantas que perdieron la dominancia apical con raíces necrosadas en su mayoría. Se evaluó la senescencia foliar a través de bioensayos de hojas de plantas que incorporaron el transgen ipt y plantas que no lo incorporaron, se observó una senescencia foliar retrasada en plantas transgénicas, se cuantificó dicho retraso a través de los contenidos de clorofila a y b, proteínas foliares totales y cambios en el perfil de las proteínas foliares en geles SDS-PAGE (subunidad mayor de Rubisco). Se observó a los 35 días un mayor contenido de clorofila a y b, proteínas foliares y una mayor intensidad de las bandas de la subunidad mayor de Rubisco en las plantas que incorporaron el transgen ipt

Quimeras transitorias en la producción de embriones bovinos

La transmisión de genética superior y consecuente generación de numerosas crías idénticas de alto valor, permitiría aumentar rápidamente la cantidad y calidad del ganado vacuno. Con este fin, optimizamos la técnica de fecundación in vitro (FIV), la cual nos permitió obtener altas tasas de embriones y preñeces. La selección del toro y la realización de experimentos de FIV con semen sexado, consiguieron aumentar los rendimientos por pajuela y la producción de embriones del sexo deseado en nuestras condiciones. También exploramos un sistema eficiente de criopreservación de embriones libres de zona pelúcida (LZP) por vitrificación, con resultados de sobrevida similares al grupo control con ZP. En este sentido, mediante la desagregación de embriones en estadio de 2 y 4 células, y el posterior cultivo LZP, fue posible incrementar la cantidad inicial de embriones. Si bien la TO en presuntos cigotos de FIV permitió generar embriones de mayor tamaño, también afectó severamente tanto la competencia de los embriones como la de sus blastómeras individuales. Sin embargo, la complementación troboblástica de blastómeras más avanzadas desagregadas demostró ser una alternativa innovadora para la clonación embrionaria. Este procedimiento se realizó electrofusionando embirones producidos por FIV en estadío de 2 células, que luego se agregaron con una única blastómera transgénica, generando lo que llamamos quimeras transitorias. Al emplear los embriones aneuploides y más jóvenes fue posible dirigir el destino de cada tipo celular, orientándolos hacia los tejidos extrembrionarios (que se descartarían en el momento del nacimiento), y soportando el desarrollo de una blastómera individual destinada al macizo celular interno (MCI). Por lo tanto, durante el desarrollo de esta Tesis fue posible desarrollar un sistema completo y original de clonación embrionaria, basado en la producción, multiplicación y criopreservación de embriones bovinos LZP.

Interacciones entre el ambiente lumínico y la producción de defensas contra hervíboros y patógenos en plantas

La radiación UV-B es un componente importante de la luz solar y tiene efetos netos sobre el desarrollo de las plantas. En condiciones naturales se observa frecuentemente que las plantas expuestas a la radiación UV-B son menos atacadas por insectos herbívoros. Estudios previos indicaron que este fenómeno se encontraba relacionado a cambios en la calidad de los tejidos vegetales producido por la radiación UV-B. Se ha sugerido que podría existir una convergencia entre las cascadas de señalización inducidas por el UV-B y por la herbivoría ya que algunos de los compuestos inducidos por el UV-B también son producidas en respuesta al ataque de insectos. En base a esto, en el presente trabajo de tesis se estudió el rol de la vía de señalización de jasmonatos y el papel del fotoreceptor de UV-B, UVR8, sobre el incremento de la resistencia a insectos y patógenos necrótrofos producidos porla exposición de las plantas a la radiación UV-B. A partir de experimentos realizados con las plantas modelo Nicotiana attenuata y Arabidopsis thaliana, se evaluó la producción de diversos componentes de la respuesta de defensa y la resistencia de insectos y patógenos mediante bioensayos. Como resultado, se encontró que parte del efecto de la radiación UV-B incrementando las defensas implica a la vía de los jasmonatos y que la radiación UV-B incrementa la sensibilidad de los tejidos a estas hormonas. En otros casos, el UV-B incrementa la resistencia a agresores bióticos por mecanismos independientes de los jasmonatos, pero que son dependientes del fotorreceptor UVR8. El trabajo presentado en esta tesis constituye la primera evidencia directa del rol de los jasmonatos en el incremento de las defensas producido por la radiación UV-B y es además el primer trabajo donde se evalúa el rol del fotorreceptor UVR8 sobre la producción de defensas

La simbiosis con endófitos del género Neotyphodium y su impacto en la interacción del pasto hospedante con otros hongos

En los pastizales naturales se encuentran muchas especies de gramíneas asociadas a endófitos asexuales del género Neotyphodium. La persistencia de la simbiosis en las comunidades ha sido asociada a los beneficios que el endófito le confiere al hospedante frente a situaciones de herbivoría y estrés abiótico. El objetivo general de esta tesis es evaluar el impacto de la presencia del endófito sobre el desarrollo de otros hongos que forman asociaciones patogénicas con el mismo pasto hospedante y estudiar de qué manera esta triple interacción se relaciona con el resto de la comunidad y el ambiente abiótico. Como sistema de estudio se utilizó a la gramínea anual Lolium multiflorum, su endófito Neotyphodium occultans y hongos con estrategias de vida contrastantes que colonizan distintos tejidos en distintos estadios del hospedante y generan cambios diversos en su demografía y ecología. La hipótesis general de esta tesis es que la presencia de endófitos altera tanto de manera directa como indirecta la interacción entre la planta hospedante y la comunidad de patógenos, y que estos cambios impactan sobre la permanencia de la simbiosis y su interacción con el resto de la comunidad vegetal. A través de un meta-análisis y experimentos manipulativos en laboratorio, invernáculo y a campo demostramos que el mutualismo reduce la infección por diversos hongos patógenos a través de mecanismos tanto fisiológicos como ecológicos, e impacta sobre otras especies de pastos. La conclusión general de esta tesis es que esta triple interacción está lejos de ser simple como fue planteado en sus inicios. Esta interacción es compleja e incluye a otros organismos de la comunidad, tanto como mediadores de la infección o como beneficiarios de los efectos de la simbiosis.

Análisis genético de la respuesta de los caracteres ecofisiológicos determinantes del rendimiento en grano a la disponibilidad de nitrógeno en maíz (Zea mays L.)

Un entendimiento del tipo de control genético subyacente a la expresión del rendimiento en grano por planta (RGP) en híbridos de maíz (Zea mays L.) cultivados en condiciones de baja disponibilidad de nitrógeno (N) es crucial para la selección y el desarrollo de genotipos más eficientes en el uso de N. El objetivo de esta tesis fue el estudio de los componentes de la variabilidad genética para componentes numéricos y ecofisiológicos del RGP con atención especial a la expresión de heterosis, tipo de acción génica, y sus interacciones con el ambiente. El estudio consistió de un dialélico completo conducido en condiciones contrastantes de N y disponibilidad de agua para evaluar 25 atributos ecofisiológicos de 6 lineas endocriadas y todos los posibles híbridos simples. Los resultados permitieron (i) demostrar una disminución de la expresión de heterosis en condiciones de restricciones abióticas con efecto predominante sobre la expansión de tejidos, tal como estrés de N o hídrico durante el periodo de crecimiento vegetativo previo a floración; (ii) identificar atributos ecofisiológicos asociados con heterosis para RGP en condiciones de baja pero no de alta disponibilidad de N (i.e. peso grano); (iii) modelar la respuesta de heterosis para RGP a índice ambiental como una relación linear-plateau, identificando un valor umbral por sobre el cual no se observa incremento de heterosis para RGP; (iv) determinar la magnitud y tipo de acción génica de caracteres ecofisiológicos, identificando a la tasa de crecimiento de la espiga durante el periodo crítico como un carácter secundario promisorio dado su fuerte control genético aditivo y asociación con el RGP, así como el índice de área foliar a madurez fisiológica y el peso de grano en condiciones de baja disponibilidad de N. La integración de un modelo genético y ecofisiológico con la finalidad de explorar las relaciones genotipo a fenotipo utilizando los paisajes de adaptación sugiere que atributos tales como la tasa de removilización de N foliar y el N foliar específico podrían ser útiles para la identificación de loci importantes para el control de caracteres cuantitativos en condiciones de baja disponibilidad de N.

La aplicación de herbicidas sistémicos de amplio espectro en pastizales naturales : efectos sobre los atributos y procesos del ecosistema

Esta tesis analiza los efectos de la aplicación de un herbicida sistémico no selectivo, el glifosato, sobre atributos estructurales y funcionales de pastizales naturales pastoreados por herbívoros domésticos. Se realizaron experimentos en un establecimiento ganadero de la Pampa Deprimida, donde la pulverización recurrente de pastizales con glifosato a fin de verano para incrementar la oferta de forraje invernal se ha difundido ampliamente. La pulverización de glifosato produjo un drástico cambio de la composición florística de la vegetación y del banco de semillas, aumentando la contribución de pastos anuales invernales y disminuyendo la de pastos perennes invernales, estivales y leguminosas, redujo la riqueza y la diversidad y disminuyó la cobertura y la calidad forrajera estival. Estos cambios en la vegetación modificaron atributos funcionales, ya que la pulverización incrementó la absorción de radiación y la productividad primaria neta aérea del pastizal en invierno-primavera y las redujo en verano, pero el incremento invierno-primaveral no compensó la disminución estival. La menor producción primaria anual podría relacionarse con el menor contenido de materia orgánica y de fósforo edáfico en los lotes pulverizados. Mediante experimentos en condiciones controladas investigué la respuesta de mecanismos biológicos claves, la regeneración vegetativa y la emergencia y crecimiento de plántulas, a la aplicación de glifosato, de Paspalum dilatatum, Schedonorus arundinaceus, Lotus tenuis y Trifolium repens, principales miembros de los grupos funcionales más afectados. El glifosato provocó la muerte de todos los tejidos, impidiendo la regeneración vegetativa, y redujo la emergencia y el establecimiento de plántulas cuando se pulverizó sobre vegetación pre-existente hasta sesenta días antes de la germinación. Estos mecanismos explican, en gran medida los cambios en la composición de la vegetación y del banco de semillas. Los resultados sugieren que los drásticos cambios que la aplicación de glifosato causa en el pastizal pueden ser irreversibles, poniendo en riesgo la integridad del ecosistema y su sustentabilidad como recurso forrajero

Crecimiento y partición de materia seca en Senecio madagascariensis Poiret (Compositae)

p.213-225

Microscopia electrónica de barrido en cultivos in vitro de embriones inmaduros y mesocotilos de plántulas de maíz

p.95-105

Quimeras transitorias en la producción de embriones bovinos

La transmisión de genética superior y consecuente generación de numerosas crías idénticas de alto valor, permitiría aumentar rápidamente la cantidad y calidad del ganado vacuno. Con este fin, optimizamos la técnica de fecundación in vitro (FIV), la cual nos permitió obtener altas tasas de embriones y preñeces. La selección del toro y la realización de experimentos de FIV con semen sexado, consiguieron aumentar los rendimientos por pajuela y la producción de embriones del sexo deseado en nuestras condiciones. También exploramos un sistema eficiente de criopreservación de embriones libres de zona pelúcida (LZP) por vitrificación, con resultados de sobrevida similares al grupo control con ZP. En este sentido, mediante la desagregación de embriones en estadio de 2 y 4 células, y el posterior cultivo LZP, fue posible incrementar la cantidad inicial de embriones. Si bien la TO en presuntos cigotos de FIV permitió generar embriones de mayor tamaño, también afectó severamente tanto la competencia de los embriones como la de sus blastómeras individuales. Sin embargo, la complementación troboblástica de blastómeras más avanzadas desagregadas demostró ser una alternativa innovadora para la clonación embrionaria. Este procedimiento se realizó electrofusionando embirones producidos por FIV en estadío de 2 células, que luego se agregaron con una única blastómera transgénica, generando lo que llamamos quimeras transitorias. Al emplear los embriones aneuploides y más jóvenes fue posible dirigir el destino de cada tipo celular, orientándolos hacia los tejidos extrembrionarios (que se descartarían en el momento del nacimiento), y soportando el desarrollo de una blastómera individual destinada al macizo celular interno (MCI). Por lo tanto, durante el desarrollo de esta Tesis fue posible desarrollar un sistema completo y original de clonación embrionaria, basado en la producción, multiplicación y criopreservación de embriones bovinos LZP.

Producción de artesanías de seda en la Argentina : análisis económico preliminar

p.259-270