64 resultados para signalisation cellulaire
em Université de Montréal
Resumo:
Thse numrise par la Direction des bibliothques de l'Universit de Montral.
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Malgr que le contenu des gnomes mitochondriaux animaux soit dit bien conserv, des nouveaux gnes mitochondriaux ont t identifis chez plusieurs espces, surtout des invertbrs. Par exemple, les bivalves exhibant la double transmission uniparentale de leurs gnomes mitochondriaux possdent des nouveaux gnes spcifiques au sexe (M-ORF dans lADN de type M, F-ORF dans lADN de type F) qui ont t caractriss in silico chez trois espces de lordre Mytiloida, une espce de Veneroida et une espce de Unionoida par une prcdente tude. Mme si les squences varient beaucoup entre ces trois ordres, cette tude montr que des hlices transmembranaires ainsi que des peptides signaux sont conservs pour toutes les squences. Ltude a aussi montr que les nouveaux gnes pourraient avoir des rles dans la signalisation cellulaire, le cycle cellulaire et la rponse immunitaire et quils pourraient tre le rsultat de lendognisation de lADN viral. Le projet prsent ici a pour but de mieux caractriser ces nouveaux gnes et leur origine potentielle, en plus dtudier le H-ORF particulier aux hermaphrodites, en ciblant les espces des unionids. Les rsultats montrent que les hlices transmembranaires et peptides signaux sont conservs chez les unionids, les protines semblent tre associes la membrane et tre capables de lier des acides nucliques et protines, et les fonctions potentielles sont conserves. Les M-ORFs semblent avoir un rle dans le transport et des processus cellulaires tels que la signalisation, le cycle cellulaire et la division, et lorganisation du cytosquelette. Les F-ORFs semblent tre impliqus dans le trafic et transport cellulaire et la rponse immunitaire. Finalement, les H-ORFs semblent tre des glycoprotines structurales avec des rles dans la signalisation, le transport et la transcription. Les rsultats de ce projet pourraient supporter une origine virale ou mitochondriale pour ces gnes.
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Thse numrise par la Direction des bibliothques de l'Universit de Montral.
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Itch est un membre de la famille des ligases de lubiquitine de type CWH (C2-WW- HECT) impliqu dans le contrle de la signalisation inflammatoire, des facteurs de transcription et le tri des rcepteurs membranaires. La fonction dItch implique gnralement sa capacit induire la dgradation de ses substrats. Pour accomplir cette fonction, Itch doit dabord interagir avec ses cibles. Itch possde quatre domaines WW lui permettant daccomplir la majorit de ses fonctions. En plus de ces domaines, Itch possde une PRR (rgion riche en prolines) unique parmi les ligases CWH. Cette rgion est bien conserve chez les vertbrs, ce qui suggre son importance. Cette rgion permet Itch dinteragir avec des protines contenant un domaine SH3 (Src homology 3). Plusieurs partenaires SH3 furent identifis, cependant lon connait peu de choses concernant la fonction et ltablissement de ces complexes. Dans ce projet, nous avons analys les proprits de liaison dun sous-groupe de protines domaine SH3 impliques dans lendocytose et la signalisation cellulaire. Nos travaux ont permis didentifier de nouveaux partenaires et aussi de dterminer que diffrents domaines SH3 ciblent la mme rgion riche en prolines, mais impliquent des rsidus distincts. Ces rsultats dmontrent la varit des proprits de liaison dmontres par la PRR dItch et sa prfrence marque pour lEndophiline. Parmi les partenaires identifis, Grb2 (Growth factor receptor-bound protein 2) est particulirement intressant en raison de son rle crucial dans la signalisation cellulaire. Nous avons dmontr ici quItch ubiquityle Grb2, mais ne cause pas sa dgradation, contrairement lEndophiline. Nos travaux dmontrent que la PRR dItch est versatile quant ses interactions et leurs consquences.
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La muqueuse intestinale est expose des agents oxydants provenant de lingestion daliments modifis, de cellules immuno-inflammatoires et de la flore intestinale. Une dite leve en fruits et lgumes peut diminuer le stress oxydant (SOx) ainsi que linflammation via plusieurs mcanismes. Ces effets bnfiques peuvent tre attribuables leur contenu lev en polyphnols. La premire tude de mon doctorat consistait tester lhypothse que les polyphnols extraits de pelures de pomme (DAPP) pouvaient diminuer le stress oxydant et l'inflammation impliqus dans les maladies inflammatoires de l'intestin (MII). Nous avons caractris les polyphnols des DAPP par spectromtrie de masse (LC-MS) et examin leur potentiel antioxydant et anti-inflammatoire au niveau des cellules intestinales. Lidentification des structures chimiques des polyphnols a t effectue par LC-MS. Le SOx a t induit par lajout du complexe fer/ascorbate (Fe/Asc, 200 M/2 mM) et linflammation par la lipopolysaccharide (LPS, 200g/mL) des cellules intestinales Caco-2/15 pr-incubes avec les DAPP (250 g/mL). Leffet du SOx est dtermin par le dosage du malondialdhyde (MDA), de la composition des acides gras polyinsaturs et de lactivit des enzymes antioxydantes endognes (SOD et GPx). Limpact des DAPP sur linflammation a t test par lanalyse de lexpression des marqueurs inflammatoires: cyclooxygnase-2 (COX-2), le facteur de ncrose tumorale alpha (TNF-a et linterleukine-6 (IL-6) et les facteurs de transcription NF-KB, Nrf-2 et PGC1 par immunobuvardage. Nos donnes ont montr que les flavonols et les flavan-3-ols constituent les composs polyphnoliques majoritaires des DAPP. Lajout de Fer2+/Asc a provoqu une augmentation de la peroxidation lipidique comparativement aux cellules contrles, un appauvrissement des acides gras polyinsaturs n-3 et n-6, et une modulation des enzymes antioxydantes, se traduisant par une augmentation de lactivit de la SOD et une diminution de la GPx. En contrepartie, les DAPP ont exhib leur potentiel corriger la plupart des perturbations, y compris lexpression protique anormalement leve du COX-2 et la production de la prostaglandine E2 (PGE2), ainsi que linflammation telle que rflte par les facteurs NF-B, TNF- et IL-6. Par ailleurs, les mcanismes sous-jacents ces changements bnfiques des DAPP ont fait intervenir les facteurs de transcription antioxydants (Nrf-2, PGC1). Vraisemblablement, cette premire tude a permis de dmontrer la capacit des DAPP amoindrir le SOx et rduire linflammation, deux processus troitement impliqus dans les MII. Dans la deuxime tape de mon doctorat, nous avons voulu comparer les rsultats de DAPP ceux des polyphnols drivant de la canneberge qui est considre par la communaut scientifique comme le fruit ayant le plus fort potentiel antioxydant. cette fin, nous avons caractris leffet des composs polyphnoliques de la canneberge (CPC) sur le SOx, la dfense antioxydante et linflammation au niveau intestinal tout en dfinissant leur mtabolisme intraluminal. Les diffrents CPC ont t spars selon leur poids molculaire par chromatographie et leurs structures chimiques ont t identifies par LC-MS. Suite une pr-incubation des cellules Caco-2/15 avec les extraits CPC (250 g/mL), le Fe/Asc et la LPS ont t administrs comme inducteurs du SOx et de linflammation, respectivement. La caractrisation globale des CPC a rvl que les acides phnoliques composaient majoritairement lextrait de canneberge de petit poids molculaire (LC) alors que les flavonodes et les procyanidines dimriques/trimriques reprsentaient lextrait de poids molculaire moyen (MC) tout en laissant les procyanidines oligo et polymriques lextrait de haut poids molculaire (HC). Les CPC ont permis de restaurer la plupart des perturbations engendres dans les Caco-2/15 par le Fe/Asc et le LPS. Les CPC exhibaient le potentiel dabaisser les niveaux de MDA, de corriger la composition des acides gras polyinsaturs n-3 et n-6, daugmenter lactivit des enzymes antioxydantes (SOD, GPx et CAT) et dlever lexpression de Nrf2 et PGC1. En outre, les CPC pouvaient aussi rduire les niveaux levs des protines inflammatoires COX-2, TNF- et IL-6 ainsi que la production des PGE2 par un mcanisme impliquant le NF-B. Au niveau mitochondrial, les procyanidines oligomriques ont russi corriger les dysfonctions relies la production dnergie (ATP), lapoptose (Bcl-2, Cyt C et AIF) et le statut des facteurs de transcription mitochondriaux (mtTFA, mtTFB1, mtTFB2). Dans le but de bien comprendre les mcanismes daction des CPC, nous avons dfini par LC-MS les composs polyphnoliques qui ont t transports ou absorbs par lentrocyte. Nos analyses soulignent le transport (i) des acides cinnamiques et benzoques (LC); (ii) la querctine glycosyle et conjugue et les procyanidines dimriques de type A (MC); et (iii) lpicatchine et les procyanidines oligomriques (HC). Les processus de mtabolisation (mthylation, glucuronidation et sulfatation) au niveau de lentrocyte ont probablement permis le transport de ces CPC surtout sous leur forme conjugue. Les procyanidines oligomriques ayant un degr de polymrisation suprieur 2 (HC) ont sembl adhrer aux cellules Caco-2/15. Lpicatchine suivi par les procyanidines dimriques de type A ont t trouvs majoritaires au niveau des mitochondries. Mme si nous ignorons encore laction biologique de chaque compos polyphnolique, nous pouvons suggrer que leurs effets combinatoires exercent des fonctions antioxydantes, anti-inflammatoires et mitochondriales dans le modle intestinal Caco-2/15. Dans une troisime tape, nous avons procd lvaluation des aspects prventifs et thrapeutique des DAPP tout en sondant les mcanismes sous-jacents dans une tude prclinique. cette fin, nous avons exploit le modle de souris avec colite exprimentale provoque par le Dextran Sulfate de Sodium (DSS). Linduction de linflammation intestinale chez la souris C57BL6 a t effectue par ladministration orale de DSS 2.5% pendant 10 jours. Des doses physiologiques et supra-physiologiques de DAPP (200 et 400 mg/kg/j, respectivement) ont t administres par gavage pendant 10 jours pr- et post-DSS. Linflammation par le DSS a provoqu une perte de poids, un raccourcissement du clon, le dcollement dystrophique de lpithlium, lexulcration et les infiltrations de cellules mono et polynuclaires au niveau du clon. De plus, le DSS a induit une augmentation de la peroxidation lipidique, une rgulation la baisse des enzymes antioxydantes, une expression protique la hausse de la myloperoxidase (MPO), du COX-2 et de la production des PGE2. Par ailleurs, les DAPP ont permis de corriger ou du moins dallger la plupart de ces anomalies en situation prventive ou thrapeutique, en plus dabaisser lexpression protique de NF-B et des cytokines inflammatoires (TNF-a et lIL-6) tout en stimulant les facteurs de transcription antioxydants (Nrf-2, PGC1). Consquemment, les polyphnols des DAPP ont exhib leur puissant pouvoir antioxydant et anti-inflammatoire au niveau intestinal dans un modle in vivo. Leurs actions sont associes la rgulation des voies de signalisation cellulaire et des changements dans la composition du microbiote. Ces trois projets de recherche permettent denvisager lvaluation des effets prventifs et thrapeutiques des DAPP cliniquement chez les patients avec des dsordres inflammatoires de lintestin.
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Lubiquitination, une modification post-traductionnelle importante pour le contrle de nombreux processus cellulaires, est une raction rversible. La raction inverse, nomme dubiquitination est catalyse par les dubiquitinases (DUB). Nous nous sommes intresss dans nos travaux tudier lubiquitination de lhistone H2A (H2Aub), au niveau des rsidus lysines 118 et 119 (K118/K119), une marque pigntique implique dans la rgulation de la prolifration cellulaire et la rparation de lADN. Le rgulateur transcriptionnel BAP1, une dubiquitinase nuclaire, a t initialement identifi pour sa capacit promouvoir la fonction suppressive de tumeurs de BRCA1. BAP1 forme un complexe multi-protique avec plusieurs facteurs transcriptionnels et sa fonction principale est la dubiquitination de H2Aub. Plusieurs tudes ont dmontr que BAP1 est un gne suppresseur de tumeurs majeur et quil est largement mut et inactiv dans une multitude de cancers. En effet, BAP1 merge comme tant la DUB la plus mute au niveau des cancers. Cependant, le ou les mcanismes daction et de rgulation du complexe BAP1 restent trs peu connus. Dans cette tude nous nous sommes intresss la caractrisation molculaire et fonctionnelle des partenaires protiques de BAP1. De manire significative nous avons caractris un mcanisme unique de rgulation entre deux composants majeurs du complexe BAP1 savoir, HCF-1 et OGT. En effet, nous avons dmontr que HCF-1 est requis pour maintenir le niveau protique de OGT et que cette dernire est indispensable pour la maturation protolytique de HCF-1 en promouvant son clivage par O-GlcNAcylation, une signalisation cellulaire ncessaire au bon fonctionnement de HCF-1. galement, nous avons dcouvert un nouveau mcanisme de rgulation de BAP1 par lubiquitine ligase atypique UBE2O. En effet, UBE2O agit comme un rgulateur ngatif de BAP1 puisque lubiquitination de ce dernier induit sa squestration dans le cytoplasme et linhibition de sa fonction suppressive de tumeurs. Dautre part nous nous sommes penchs sur la caractrisation de lassociation de BAP1 avec deux facteurs de la famille des protines Polycombes nomms ASXL1 et ASXL2 (ASXL1/2). Nous avons investigu le rle de BAP1/ASXL1/2, particulirement dans les mcanismes de dubiquitination et suppression de tumeurs. Nous avons dmontr que BAP1 interagit directement iii via son domaine C-terminale avec le mme domaine ASXM de ASXL1/2 formant ainsi deux complexes mutuellement exclusifs indispensables pour induire lactivit dubiquitinase de BAP1. De manire significative, ASXM sassocie avec BAP1 pour crer un nouveau domaine composite de liaison lubiquitine. Ces interactions BAP1/ASXL1/2 rgulent la progression harmonieuse du cycle cellulaire. De plus, la surexpression de BAP1 et de ASXL2 au niveau des fibroblastes induit la snescence de manire dpendante de leurs interactions. Dautre part, nous avons identifi des mutations de cancers au niveau de BAP1 le rendant incapable de lier ASXL1/2, dexercer sa fonction dautodubiquitination et de ce fait dagir comme suppresseur de tumeurs. Ainsi nous avons rvl un lien troit entre le gne suppresseur de tumeurs BAP1, son activit dubiquitinase et le contrle de la prolifration cellulaire.
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Les cellules pithliales pulmonaires constituent la premire ligne de dfense face aux virus respiratoires via la scrtion de mucus, de peptides, de cytokines et chimiokines qui dterminent l'limination ou la progression de linfection. Les principales cytokines antivirales produites par les cellules pithliales alvolaires (AEC) sont les interfrons (IFN) type I (/) et III (). La liaison dIFN son rcepteur induit une voie antivirale bien caractrise qui aboutit lactivation du complexe ISGF3 (STAT1, STAT2 et IRF9) qui permet la transcription de multiples gnes codant pour des protines activit antivirale et immunorgulatrice. Il a rcemment t dmontr que la costimulation des cellules pithliales pulmonaires par lIFN et le Tumor Necrosis Factor (TNF), galement produit lors dune infection, synergisent pour induire un tat antiviral tardif distinct. Dautre part, il a t montr que la synergie entre le TNF et l'IFN induit une voie de signalisation impliquant STAT2 et IRF9, mais indpendante de STAT1 permettant lexpression du gne DUOX2. Notre but est de dterminer limportance de cette nouvelle voie de signalisation induite par la costimulation du TNF+IFN, impliquant STAT2 et IRF9 indpendamment de STAT1 dans la rgulation dun programme transcriptionnel antiviral et immunorgulateur tardif. Notre premier objectif est de dterminer si des gnes antiviraux et immunorgulateurs qui sont induits par la costimulation par TNF+IFN sont dpendants de la voie STAT2/IRF9, indpendamment de STAT1. En utilisant la technique de qRT-PCR, nous avons identifi 3 gnes immunorgulateurs, CXCL10, IDO et APOBEC3G, induits de manire synergique en rponse TNF+IFN dans les cellules A549, un modle de cellules pithliales pulmonaires. Afin de confirmer que ces gnes sont induits indpendamment de STAT1, nous avons valid leur expression dans la ligne cellulaire U3A dficiente en STAT1. Par l'utilisation d'ARN interfrants (ARNi) dirigs contre STAT2 et IRF9, nous avons confirm que linduction de ces gnes est dpendante de STAT2 et IRF9. Finalement, lanalyse de lactivit du promoteur de CXCL10 en rponse TNF+IFN par des essais rapporteurs lucifrases a permis de montrer que la rgulation se fait au niveau transcriptionnel. Notre deuxime objectif, est de dterminer si STAT6 pourrait remplacer STAT1 dans la voie de signalisation induite par TNF+IFN. En effet, STAT6 est un inducteur connu de lexpression de DUOX2 en rponse IL4+IL13. Contrairement notre hypothse, linhibition de STAT6 par ARNi augmente lexpression de DUOX2 en rponse TNF+IFN suggrant que STAT6 est un rgulateur ngatif. Nos rsultats ont permis de comprendre de manire plus dtaille les mcanismes mis en place dans le dveloppement dune rponse antivirale. Dautre part, ltude de leffet de lIFN et du TNF est galement pertinente pour les maladies chroniques inflammatoires et autoimmunes. De plus, nos rsultats illustrent un nouveau paradigme concernant les mcanismes de signalisation cellulaire impliqus dans la synergie entre deux cytokines qui pourrait tre applicable des combinaisons de cytokines autres que TNF+IFN.
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Mmoire numris par la Direction des bibliothques de l'Universit de Montral.
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Thse numrise par la Direction des bibliothques de l'Universit de Montral.
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Le cancer colorectal reprsente la troisime forme de cancer la plus frquente au Canada. Malgr les rcents dveloppements, aucun traitement curatif nest disponible pour les patients diagnostiqus un stade avanc de la maladie. Plusieurs vidences supportent un rle important des prostaglandines dans cette maladie. En effet, une surexpression des rcepteurs de type EP et FP est remarque. Ces derniers ainsi que les molcules de signalisations intracellulaires quils activent reprsentent donc de nouvelles cibles pour traiter ce cancer. Nous et dautres groupes avons dmontr que les protines G monomriques sont des petits interrupteurs molculaires importants dans la signalisation intracellulaire engage par les rcepteurs dans des cellules saines mais quun drglement de celles-ci est associ au cancer. Lobjectif principal de ce projet de recherche vise donc identifier les voies de signalisations par lesquelles le rcepteur FP contribue aux capacits invasives des cellules tumorales dorigine colorectale. Notre hypothse est que la protine ARF6, une des 6 isoformes des ARFs, et la protine RhoA, agissent pour coordonner lactivation des voies de signalisations associes la migration et linvasion cellulaire. Nos rsultats ont indiqu que la stimulation des cellules HEK293 exprimant de faon stable le rcepteur FP (HA-FP) ainsi que les cellules SW480, une ligne invasive de cancer colorectal, par le PGF2 augmentait les niveaux dactivation dARF6 mais galement de la protine RhoA. De plus, dautres mdiateurs et intermdiaires associs la rorganisation du cytosquelette comme la cofiline et la chaine lgre de la myosine (MLC) ont t hautement phosphoryls suite la stimulation par la prostaglandine. Ces observations sont associes avec une augmentation des fibres de stress dans les cellules. Nous avons tent de dterminer si linhibition de ces protines G affectait la capacit du PGF2 activer ces intermdiaires de signalisation ainsi que certains effets biologiques. Ainsi, nos expriences contribueront identifier de nouvelles cibles thrapeutiques potentielles pour le traitement du cancer colorectal.
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Le cancer de lovaire (COv) est le cancer gyncologique le plus ltal chez la femme et les traitements existants, chirurgie et chimiothrapie, ont peu volu au cours des dernires dcennies. Nous proposons que la comprhension des diffrents destins cellulaires tels que la snescence que peuvent choisir les cellules du cancer de lovaire en rponse la chimiothrapie pourrait conduire de nouvelles opportunits thrapeutiques. La snescence cellulaire a t largement associe lactivit de la protine TP53, qui est mute dans plus de 90% des cas de cancer de lovaire sreux de haut grade (COv-SHG), la forme la plus commune de la maladie. Dans nos travaux, partir dchantillons drivs de patientes, nous montrons que les cultures primaires du cancer de lovaire sreux de haut grade exposes au stress ou des drogues utilises en chimiothrapie entrent en senescence grce lactivit dun isoforme du gne CDKN2A (p16INK4A). Dans ces cellules, nous avons valu les caractristiques fondamentales de la snescence cellulaire tels que les altrations morphologiques, lactivit bta galactosidase associe la snescence, les dommages lADN, larrt du cycle cellulaire et le phnotype scrtoire associ la snescence. En utilisant des micromatrices tissulaires construites partir dchantillons humains de COv-SHG pr- et post-chimiothrapie, accompagnes de leurs donnes cliniques, nous avons quantifi des marqueurs de snescence incluant une diminution de la prolifration cellulaire quelques semaines aprs chimiothrapie. De faon intressante, lexpression de p16INK4A dans les chantillons de COv-SHG prtraitement corrle avec une survie prolonge des patientes suite au traitement. Ceci suggre ainsi pour la premire fois un impact biologique bnfique pour la prsence de cellules cancreuses qui sont capable dactiver la snescence, particulirement pour le traitement du cancer de lovaire. Dans le but de complmenter les thrapies actuelles avec des approches de manipulation pharmacologique de la snescence, nos rsultats suggrent quil serait important de dterminer limpact positif ou ngatif de la snescence induite par la thrapie sur la progression de la maladie et la survie, pour chaque type de cancer de faon indpendante.
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Lvolution dune cellule tumorale initie une tumeur solide ncessite, chaque tape, un microenvironnement favorable sa survie et sa croissance. Le microenvironnement tumoral est compar un foyer dinflammation chronique dont la composition cellulaire et molculaire est complexe. Les cellules souches msenchymateuses (CSM) reprsentent lun des principaux acteurs cellulaires prsents. Elles migrent vers les sites tumoraux o elles soutiennent linflammation, langiogense et le dveloppement tumoral en activant plusieurs voies de signalisation. Une des voies majeures qui contribuent linflammation est la voie de signalisation NF-B. Linitiation de cette voie provient de la membrane cellulaire entre autres des cavoles. Nous soumettons lhypothse que lune des cavines, protines associes aux cavoles, modulerait le phnotype inflammatoire etou migratoire dans les CSM traites la cytokine TNF- (facteur de ncrose tumorale ) en modulant la voie de signalisation NF-B. En effet, nous avons observ une rgulation la hausse de lexpression de la COX-2 (cyclooxygnase-2) et une diminution de lexpression dIB qui sont synonymes de lactivation de la voie NF-B dans les CSM que nous avons traites au TNF-. Nous avons trouv que le TNF- induit la migration des CSM, et que la rpression gnique de la Cavine-2 augmente significativement la migration des CSM traites par le TNF-. La rpression gnique de la Cavine-2 vient aussi amplifier la tubulogense dans les CSM en rponse au TNF-. Dun point de vue molculaire, la rpression gnique de la Cavine-2 a montr une trs forte amplification de l'expression protique de la COX-2 dans les CSM en rponse au TNF-. Dans ces mmes cellules o la Cavine-2 a t rprime, et suite un traitement au TNF-, le pic de phosphorylation est plus intense et la courbe de phosphorylation est plus prolonge dans le temps. Ces observations nous permettent daffirmer que la Cavine-2 a un rle rpresseur sur lexpression de COX-2. Collectivement, nos rsultats montrent que la Cavine-2 peut tre propose comme un gne suppresseur de tumeur et est de ce fait, une bonne cible thrapeutique dans les CSM qui permettraient dagir des stades prcoces du dveloppement tumoral.
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ADP-ribosylation factor-1 (ARF1) est une petite GTPase principalement connue pour son rle dans la formation de vsicules au niveau de lappareil de Golgi. Rcemment, dans des cellules de cancer du sein, nous avons dmontr quARF1 est aussi un mdiateur important de la signalisation du rcepteur du facteur de croissance pidermique (EGFR) contrlant la prolifration, la migration et l'invasion cellulaire. Cependant, le mcanisme par lequel lEGFR active la GTPase ainsi que le rle de cette dernire dans la rgulation de la fonction du rcepteur demeure inconnue. Dans cette thse, nous avions comme objectifs de dfinir le mcanisme d'activation de ARF1 dans les cellules de cancer du sein hautement invasif et dmontrer que lactivation de cette isoforme de ARF joue un rle essentiel dans la rsistance de ces cellules aux inhibiteurs de l'EGFR. Nos tudes dmontrent que les protines dadaptatrices Grb2 et p66Shc jouent un rle important dans l'activation de ARF1. Alors que Grb2 favorise le recrutement dARF1 l'EGFR ainsi que l'activation de cette petite GTPase, p66Shc inhibe le recrutement du complexe Grb2-ARF1 au rcepteur et donc contribue limiter lactivation dARF1. De plus, nous dmontrons que ARF1 favorise la rsistance aux inhibiteurs des tyrosines kinases dans les cellules de cancer du sein hautement invasif. En effet, une diminution de lexpression de ARF1 a augment la sensibilit descellules aux inhibiteurs de l'EGFR. Nous montrons galement que de hauts niveaux de ARF1 contribuent la rsistance des cellules ces mdicaments en amliorant la survie et les signaux prolifratifs travers ERK1/2, Src et AKT, tout en bloquant les voies apoptotiques (p38MAPK et JNK). Enfin, nous mettons en vidence le rle de la protine ARF1 dans lapoptose en rponse aux traitements des inhibiteurs de lEGFR. Nos rsultats indiquent que la dpletion dARF1 promeut la mort cellulaire induite par gefitinib, en augmentant l'expression de facteurs pro-apoptotiques (p66shc, Bax), en altrant le potentiel de la membrane mitochondriale et la libration du cytochrome C. Ensemble, nos rsultats dlimitent un nouveau mcanisme d'activation de ARF1 dans les cellules du cancer du sein hautement invasif et impliquent lactivit dARF1 comme un mdiateur important de la rsistance aux inhibiteurs EGFR.
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Afin deffectuer des tudes fonctionnelles sur le gnome de la souris, notre laboratoire a gnr une bibliothque de clones de cellules souches embryonnaires (ESC) prsentant des suppressions chromosomiques chevauchantes alatoires la bibliothque DELES. Cette bibliothque contient des dltions couvrant environ 25% du gnome murin. Dans le laboratoire, nous comptons identifier de nouveaux dterminants du destin des cellules hmatopotiques en utilisant cet outil. Un crible primaire utilisant la benzidine pour dmontrer la prsence d'hmoglobine dans des corps embryodes (EBS) a permis didentifier plusieurs clones dlts prsentant un phnotype hmatopotique anormal. Comme cet essai ne vrifie que la prsence d'hmoglobine, le but de mon projet est d'tablir un essai in vitro de diffrenciation des ESC permettant de mesurer le potentiel hmatopotique de clones DELES. Mon hypothse est que lessai de diffrenciation hmatopotique publi par le Dr Keller peut tre import dans notre laboratoire et utilis pour tudier l'engagement hmatopotique des clones DELES. laide dessais de RT-QPCR et de FACS, jai pu contrler la cintique de diffrenciation hmatopotique en suivant lexpression des gnes hmatopotiques et des marqueurs de surface comme CD41, c-kit, RUNX1, GATA2, CD45, -globine 1 et TER-119. Cet essai sera utilis pour valider le potentiel hmatopotique des clones DELES candidats identifis dans le crible principal. Mon projet secondaire vise utiliser la mme stratgie rtro-virale a base de Cre-loxP utilise pour gnrer la bibliothque DELES pour gnrer une bibliothque de cellules KBM-7 contenant des suppressions chromosomiques chevauchantes. Mon but ici est de tester si la ligne cellulaire leumique humaine presque haplode KBM-7 peut tre exploite en utilisant l'approche DELES pour crer cette bibliothque. La bibliothque de clones KBM-7 servira dfinir les activits molculaires de drogues anti-leucmiques potentielless que nous avons identifies dans le laboratoire parce quelles inhibent la croissance cellulaire dans plusieurs chantillons de leucmie mylode aigu drivs de patients. Elle me permettra galement d'identifier les voies de signalisation molculaires qui, lorsque gntiquement perturbes, peuvent confrer une rsistance ces drogues.
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4-1BB (CD137) est un membre de la superfamille TNFR qui est impliqu dans la transmission des signaux de survie aux lymphocytes. TRAF1 est une protine adaptatrice qui est recrute par 4-1BB et autres TNFRs et est caractrise par une expression trs restreinte aux lymphocytes, cellules dendritiques et certaines cellules pithliales. TRAF1 est ncessaire pour lexpansion et la survie des cellules T mmoire en prsence d'agonistes anti-4-1BB in vivo. De plus, TRAF1 est requise en aval de 4-1BB pour activer (phosphoryler) la MAP kinase Erk implique dans la rgulation de la molcule pro-apoptotique Bim. Suite lactivation du rcepteur 4-1BB, TRAF1 et ERK sont impliqus dans la phosphorylation de Bim et la modulation de son expression. Lactivation et la rgulation de TRAF1 et Bim ont un rle important dans la survie des cellules T CD8 mmoires. Dans cette tude, nous avons utilis une approche protomique afin de pouvoir identifier de nouveaux partenaires de liaison de TRAF1. Utilisant cette stratgie, nous avons identifi que LSP1 (Leukocyte Specific Protein 1) est recrut dans le complexe de signalisation 4-1BB de manire TRAF1 dpendante. Une caractrisation plus pousse de linteraction entre TRAF1 et LSP1 a montr que LSP1 lie la rgion unique N-terminal de TRAF1 de faon indpendante de la rgion conserve C-terminal. linstar des cellules T dficientes en TRAF1, les cellules T dficientes en LSP1 ne sont pas capables dactiver ERK en aval de 4-1BB et par consquent ne peuvent pas rguler Bim. Ainsi, TRAF1 et LSP1 cooprent en aval de 4-1BB dans le but dactiver ERK et rguler en aval les niveaux de Bim dans les cellules T CD8. Selon la littrature, le rcepteur 4-1BB nest pas exprim la surface des cellules B murines, mais le rcepteur 4-1BB favorise la prolifration et la survie des cellules B humaines. Cependant, il est important d'tudier l'expression du rcepteur 4-1BB dans les cellules B murines afin de disposer d'un modle murin et de prdire la rponse clinique la manipulation de 4-1BB. En utilisant diffrentes stimulations de cellules B murines primaires, nous avons identifi que le rcepteur 4-1BB est exprim la surface des cellules B de souris suite une stimulation avec le LPS (Lipopolysaccharides). Une caractrisation plus pousse a montr que le rcepteur 4-1BB est induit dans les cellules B murines d'une manire dpendante de TLR4 (Toll Like Receptor 4). Collectivement, notre travail a dmontr que la stimulation avec le LPS induit lexpression du rcepteur 4-1BB la surface des cellules B murines, menant ainsi l'induction de TRAF1. De plus, TRAF1 et LSP1 cooprent en aval de 4-1BB pour activer la signalisation de la Map kinase ERK dans les cellules B murines de manire similaire aux cellules T. Les cellules B dficientes en TRAF1 et les cellules B dficientes en LSP1 ne sont pas en mesure d'activer la voie ERK en aval de 4-1BB et montrent un niveau dexpression du rcepteur significativement diminu compar aux cellules B dune souris WT. Ainsi, TRAF1 et LSP1 sont ncessaires pour une expression maximale du rcepteur 4-1BB la surface cellulaire de cellules B murines et cooprent en aval de 4-1BB afin d'activer la cascade ERK dans les cellules B murines.
