De l'utilisation des copolymères d'acide méthacrylique dans le transport intracellulaire des oligonucléotides antisens

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Stimulation de la survie et de la régénération des cellules ganglionnaires de la rétine par inactivation de la GTPase Rho après lésion du nerf optique du rat adulte

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Protocole d'isolation des virions périnucléaires et extracellulaires chez HSV-1 pour l'étude par une approche protéomique du mécanisme de transport intracellulaire emprunté par le virus

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Modulation des radeaux lipidiques et des propriétés de fusion des phagosomes par le lipophosphoglycane du parasite intracellulaire Leishmania donovani

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les voies de signalisation du facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) dans la survie neuronale et la régénération axonale des cellules ganglionnaires de la rétine adulte blessée

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Étude du rôle des domaines structuraux et du motif de ciblage YXXO dans le transport intracellulaire et de l'activité fusogénique de la gp41 du VIH-1

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Étude du trafic intracellulaire de la protéine Gag du VIH-1 : rôle des facteurs de l'hôte

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Implication du domaine intracellulaire du précurseur de la protéine amyloïde dans la modulation de la plasticité synaptique

Alzheimer's disease is the most common type of dementia in the elderly; it is characterized by early deficits in learning and memory formation and ultimately leads to a generalised loss of higher cognitive functions. While amyloid beta (Aβ) and tau are traditionally associated with the development of Alzheimer disease, recent studies suggest that other factors, like the intracellular domain (APP-ICD) of the amyloid precursor protein (APP), could play a role. In this study, we investigated whether APP-ICD could affect synaptic transmission and synaptic plasticity in the hippocampus, which is involved in learning and memory processes. Our results indicated that overexpression of APP-ICD in hippocampal CA1 neurons leads to a decrease in evoked AMPA-receptor and NMDA-receptor dependent synaptic transmission. Our study demonstrated that this effect is specific for APP-ICD since its closest homologue APLP2-ICD did not reproduce this effect. In addition, APP-ICD blocks the induction of long term potentiation (LTP) and leads to increased of expression and facilitated induction of long term depression (LTD), while APLP2-ICD shows neither of these effects. Our study showed that this difference observed in synaptic transmission and plasticity between the two intracellular domains resides in the difference of one alanine in the APP-ICD versus a proline in the APLP2-ICD. Exchanging this critical amino-acid through point-mutation, we observed that APP(PAV)-ICD had no longer an effect on synaptic plasticity. We also demonstrated that APLP2(AAV)-ICD mimic the effect of APP-ICD in regards of facilitated LTD. Next we showed that the full length APP-APLP2-APP (APP with a substitution of the Aβ component for its homologous APLP2 part) had no effect on synaptic transmission or synaptic plasticity when compared to the APP-ICD. However, by activating caspase cleavage prior to induction of LTD or LTP, we observed an LTD facilitation and a block of LTP with APP-APLP2-APP, effects that were not seen with the full length APLP2 protein. APP is phosphorylated at threonine 668 (Thr668), which is localized directly after the aforementioned critical alanine and the caspase cleavage site in APP-APLP2-APP. Mutating this Thr668 for an alanine abolishes the effects on LTD and restores LTP induction. Finally, we showed that the facilitation of LTD with APP-APLP2-APP involves ryanodine receptor dependent calcium release from intracellular stores. Taken together, we propose the emergence of a new APP intracellular domain, which plays a critical role in the regulation of synaptic plasticity and by extension, could play a role in the development of memory loss in Alzheimer’s disease.

Rôle de l'isoforme p35 de la chaîne invariante humaine dans la formation et le transport de complexes de CMH II

La présentation antigénique par les molécules de classe II du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH II) est un mécanisme essentiel au contrôle des pathogènes par le système immunitaire. Le CMH II humain existe en trois isotypes, HLA-DP, DQ et DR, tous des hétérodimères composés d’une chaîne α et d’une chaîne β. Le CMH II est entre autres exprimé à la surface des cellules présentatrices d’antigènes (APCs) et des cellules épithéliales activées et a pour fonction de présenter des peptides d’origine exogène aux lymphocytes T CD4+. L’oligomérisation et le trafic intracellulaire du CMH II sont largement facilités par une chaperone, la chaîne invariante (Ii). Il s’agit d’une protéine non-polymorphique de type II. Après sa biosynthèse dans le réticulum endoplasmique (ER), Ii hétéro- ou homotrimérise, puis interagit via sa région CLIP avec le CMH II pour former un complexe αβIi. Le complexe sort du ER pour entamer son chemin vers différents compartiments et la surface cellulaire. Chez l’homme, quatre isoformes d’Ii sont répertoriées : p33, p35, p41 et p43. Les deux isoformes exprimées de manière prédominante, Iip33 et p35, diffèrent par une extension N-terminale de 16 acides aminés portée par Iip35. Cette extension présente un motif de rétention au réticulum endoplasmique (ERM) composé des résidus RXR. Ce motif doit être masqué par la chaîne β du CMH II pour permettre au complexe de quitter le ER. Notre groupe s’est intéressé au mécanisme du masquage et au mode de sortie du ER des complexes αβIi. Nous montrons ici que l’interaction directe, ou en cis, entre la chaîne β du CMH II et Iip35 dans une structure αβIi est essentielle pour sa sortie du ER, promouvant la formation de structures de haut niveau de complexité. Par ailleurs, nous démontrons que NleA, un facteur de virulence bactérien, permet d’altérer le trafic de complexes αβIi comportant Iip35. Ce phénotype est médié par l’interaction entre p35 et les sous-unités de COPII. Bref, Iip35 joue un rôle central dans la formation des complexes αβIi et leur transport hors du ER. Ceci fait d’Iip35 un régulateur clef de la présentation antigénique par le CMH II.

Rôles de la protéine tyrosine phosphatase DEP-1 dans l'angiogenèse, la perméabilité vasculaire et la progression tumorale

L’angiogenèse et l’augmentation de la perméabilité vasculaire sont des éléments clés pour la croissance et la progression tumorale. Par conséquent, de nombreux efforts sont déployés à comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la formation et le remodelage des vaisseaux sanguins de manière à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. De cette optique, les travaux de cette thèse se sont concentrés sur la protéine tyrosine phosphatase DEP-1, initialement identifiée comme un régulateur négatif de la prolifération et de la phosphorylation du VEGFR2 lorsque fortement exprimée dans les cellules endothéliales. Toutefois, en utilisant une approche d’ARNi, il a été démontré que via sa capacité à déphosphoryler la tyrosine inhibitrice de Src (Y529), DEP-1 était également un régulateur positif de l’activation de Src dans les cellules endothéliales stimulées au VEGF. Puisque Src joue un rôle central dans la promotion de l’angiogenèse et la perméabilité vasculaire, nous avons en plus démontré que DEP-1 était un promoteur de ces fonctions in vitro et que la tyrosine phosphorylation de sa queue C-terminale, permettant l’interaction et l’activation de Src, était requise. Les travaux de recherche présentés dans cette thèse démontrent dans un premier temps à partir d’une souris Dep1 KO, dont le développement ne présente aucun phénotype apparent, que la perte de l’expression de DEP-1 se traduit en une inhibition de l’activation de Src et de l’un de ses substrats, la VE-Cadherine, en réponse au VEGF chez la souris adulte. Nos résultats démontrent donc, pour la première fois, le rôle primordial de DEP-1 dans l’induction de la perméabilité vasculaire et de la formation de capillaires in vivo. Conséquemment, la croissance tumorale et la formation de métastases aux poumons sont réduites due à une inhibition de leur vascularisation ce qui se traduit par une diminution de la prolifération et une augmentation de l’apoptose des cellules cancéreuses. De façon intéressante, l’expression élevée de DEP-1 dans les vaisseaux sanguins tumoraux de patientes atteintes du cancer du sein corrèle avec une vascularisation accrue de la tumeur. En plus du rôle de DEP-1 dans la réponse angiogénqiue à l’âge adulte, nos travaux ont également démontré le rôle important de DEP-1 lors de la vascularisation de la rétine, un modèle in vivo d’angiogenèse développementale. Dans ce contexte, DEP-1 inhibe la prolifération des cellules endothéliales et limite leur bourgeonnement et la complexification du réseau vasculaire rétinien en permettant l’expression adéquate du Dll4, un régulateur crucial de l’organisation de la vascularisation développementale. Cette expression du Dll4 découlerait de la stabilisation de la β-caténine par l’inactivation de la GSK3β, un régulateur important de la dégradation de la β-caténine, en réponse au VEGF selon la voie de signalisation VEGFR2-Src-PI3K-Akt-GSK3β. Ainsi, ces travaux identifient DEP-1 comme un régulateur important de l’organisation vasculaire rétinienne. Les rôles positifs de DEP-1 dans les cellules endothéliales découlent principalement de sa capacité à lier et activer la kinase Src. En plus de contribuer à la réponse angiogénique, Src est également un oncogène bien caractérisé notamment pour sa contribution au programme invasif des cellules cancéreuses mammaires. Les travaux de cette thèse illustrent que DEP-1 est préférentiellement exprimée dans les cellules cancéreuses mammaires invasives et qu’il régule l’activation de Src, de voies de signalisation invasives et, par le fait même, de l’invasivité de ces cellules in vitro et in vivo. De façon intéressante, ces observations corrèlent avec des données cliniques où l’expression modérée de DEP-1 est associée à un mauvais pronostic de survie et de rechute. Ces résultats démontrent donc, pour la première fois, le rôle positif de DEP-1 dans l’activation de Src au niveau des cellules endothéliales et des cellules cancéreuses mammaires ce qui permet la régulation du bourgeonnement endothélial, de la perméabilité vasculaire, de l’angiogenèse normale et pathologique en plus de l’invasion tumorale.

Dissection moléculaire de la sénescence cellulaire induite par le stress et la thérapie dans le cancer de l’ovaire et son impact sur la réponse des patientes

Le cancer de l’ovaire (COv) est le cancer gynécologique le plus létal chez la femme et les traitements existants, chirurgie et chimiothérapie, ont peu évolué au cours des dernières décennies. Nous proposons que la compréhension des différents destins cellulaires tels que la sénescence que peuvent choisir les cellules du cancer de l’ovaire en réponse à la chimiothérapie pourrait conduire à de nouvelles opportunités thérapeutiques. La sénescence cellulaire a été largement associée à l’activité de la protéine TP53, qui est mutée dans plus de 90% des cas de cancer de l’ovaire séreux de haut grade (COv-SHG), la forme la plus commune de la maladie. Dans nos travaux, à partir d’échantillons dérivés de patientes, nous montrons que les cultures primaires du cancer de l’ovaire séreux de haut grade exposées au stress ou à des drogues utilisées en chimiothérapie entrent en senescence grâce à l’activité d’un isoforme du gène CDKN2A (p16INK4A). Dans ces cellules, nous avons évalué les caractéristiques fondamentales de la sénescence cellulaire tels que les altérations morphologiques, l’activité béta galactosidase associée à la sénescence, les dommages à l’ADN, l’arrêt du cycle cellulaire et le phénotype sécrétoire associé à la sénescence. En utilisant des micromatrices tissulaires construites à partir d’échantillons humains de COv-SHG pré- et post-chimiothérapie, accompagnées de leurs données cliniques, nous avons quantifié des marqueurs de sénescence incluant une diminution de la prolifération cellulaire quelques semaines après chimiothérapie. De façon intéressante, l’expression de p16INK4A dans les échantillons de COv-SHG prétraitement corrèle avec une survie prolongée des patientes suite au traitement. Ceci suggère ainsi pour la première fois un impact biologique bénéfique pour la présence de cellules cancéreuses qui sont capable d’activer la sénescence, particulièrement pour le traitement du cancer de l’ovaire. Dans le but de complémenter les thérapies actuelles avec des approches de manipulation pharmacologique de la sénescence, nos résultats suggèrent qu’il serait important de déterminer l’impact positif ou négatif de la sénescence induite par la thérapie sur la progression de la maladie et la survie, pour chaque type de cancer de façon indépendante.

Impact des cavines sur le phénotype invasif et inflammatoire des cellules souches mésenchymateuses

L’évolution d’une cellule tumorale initiée à une tumeur solide nécessite, à chaque étape, un microenvironnement favorable à sa survie et à sa croissance. Le microenvironnement tumoral est comparé à un foyer d’inflammation chronique dont la composition cellulaire et moléculaire est complexe. Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) représentent l’un des principaux acteurs cellulaires présents. Elles migrent vers les sites tumoraux où elles soutiennent l’inflammation, l’angiogenèse et le développement tumoral en activant plusieurs voies de signalisation. Une des voies majeures qui contribuent à l’inflammation est la voie de signalisation NF-B. L’initiation de cette voie provient de la membrane cellulaire entre autres des cavéoles. Nous soumettons l’hypothèse que l’une des cavines, protéines associées aux cavéoles, modulerait le phénotype inflammatoire etou migratoire dans les CSM traitées à la cytokine TNF- (facteur de nécrose tumorale ) en modulant la voie de signalisation NF-B. En effet, nous avons observé une régulation à la hausse de l’expression de la COX-2 (cyclooxygénase-2) et une diminution de l’expression d’IκB qui sont synonymes de l’activation de la voie NF-B dans les CSM que nous avons traitées au TNF-. Nous avons trouvé que le TNF- induit la migration des CSM, et que la répression génique de la Cavine-2 augmente significativement la migration des CSM traitées par le TNF-. La répression génique de la Cavine-2 vient aussi amplifier la tubulogenèse dans les CSM en réponse au TNF-. D’un point de vue moléculaire, la répression génique de la Cavine-2 a montré une très forte amplification de l'expression protéique de la COX-2 dans les CSM en réponse au TNF-. Dans ces mêmes cellules où la Cavine-2 a été réprimée, et suite à un traitement au TNF-, le pic de phosphorylation est plus intense et la courbe de phosphorylation est plus prolongée dans le temps. Ces observations nous permettent d’affirmer que la Cavine-2 a un rôle répresseur sur l’expression de COX-2. Collectivement, nos résultats montrent que la Cavine-2 peut être proposée comme un gène suppresseur de tumeur et est de ce fait, une bonne cible thérapeutique dans les CSM qui permettraient d’agir à des stades précoces du développement tumoral.

Implicating the mechanisms of ADP-ribosylation factor activation in the resistance of invasive breast cancer cells to EGFR tyrosine kinase inhibitors

ADP-ribosylation factor-1 (ARF1) est une petite GTPase principalement connue pour son rôle dans la formation de vésicules au niveau de l’appareil de Golgi. Récemment, dans des cellules de cancer du sein, nous avons démontré qu’ARF1 est aussi un médiateur important de la signalisation du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) contrôlant la prolifération, la migration et l'invasion cellulaire. Cependant, le mécanisme par lequel l’EGFR active la GTPase ainsi que le rôle de cette dernière dans la régulation de la fonction du récepteur demeure inconnue. Dans cette thèse, nous avions comme objectifs de définir le mécanisme d'activation de ARF1 dans les cellules de cancer du sein hautement invasif et démontrer que l’activation de cette isoforme de ARF joue un rôle essentiel dans la résistance de ces cellules aux inhibiteurs de l'EGFR. Nos études démontrent que les protéines d’adaptatrices Grb2 et p66Shc jouent un rôle important dans l'activation de ARF1. Alors que Grb2 favorise le recrutement d’ARF1 à l'EGFR ainsi que l'activation de cette petite GTPase, p66Shc inhibe le recrutement du complexe Grb2-ARF1 au récepteur et donc contribue à limiter l’activation d’ARF1. De plus, nous démontrons que ARF1 favorise la résistance aux inhibiteurs des tyrosines kinases dans les cellules de cancer du sein hautement invasif. En effet, une diminution de l’expression de ARF1 a augmenté la sensibilité descellules aux inhibiteurs de l'EGFR. Nous montrons également que de hauts niveaux de ARF1 contribuent à la résistance des cellules à ces médicaments en améliorant la survie et les signaux prolifératifs à travers ERK1/2, Src et AKT, tout en bloquant les voies apoptotiques (p38MAPK et JNK). Enfin, nous mettons en évidence le rôle de la protéine ARF1 dans l’apoptose en réponse aux traitements des inhibiteurs de l’EGFR. Nos résultats indiquent que la dépletion d’ARF1 promeut la mort cellulaire induite par gefitinib, en augmentant l'expression de facteurs pro-apoptotiques (p66shc, Bax), en altérant le potentiel de la membrane mitochondriale et la libération du cytochrome C. Ensemble, nos résultats délimitent un nouveau mécanisme d'activation de ARF1 dans les cellules du cancer du sein hautement invasif et impliquent l’activité d’ARF1 comme un médiateur important de la résistance aux inhibiteurs EGFR.

Role of the cotransporter KCC2 in cortical excitatory synapse development and febrile seizure susceptibility

Le co-transporteur KCC2 spécifique au potassium et chlore a pour rôle principal de réduire la concentration intracellulaire de chlore, entraînant l’hyperpolarisation des courants GABAergic l’autorisant ainsi à devenir inhibiteur dans le cerveau mature. De plus, il est aussi impliqué dans le développement des synapses excitatrices, nommées aussi les épines dendritiques. Le but de notre projet est d’étudier l’effet des modifications concernant l'expression et la fonction de KCC2 dans le cortex du cerveau en développement dans un contexte de convulsions précoces. Les convulsions fébriles affectent environ 5% des enfants, et ce dès la première année de vie. Les enfants atteints de convulsions fébriles prolongées et atypiques sont plus susceptibles à développer l’épilepsie. De plus, la présence d’une malformation cérébrale prédispose au développement de convulsions fébriles atypiques, et d’épilepsie du lobe temporal. Ceci suggère que ces pathologies néonatales peuvent altérer le développement des circuits neuronaux irréversiblement. Cependant, les mécanismes qui sous-tendent ces effets ne sont pas encore compris. Nous avons pour but de comprendre l'impact des altérations de KCC2 sur la survenue des convulsions et dans la formation des épines dendritiques. Nous avons étudié KCC2 dans un modèle animal de convulsions précédemment validé, qui combine une lésion corticale à P1 (premier jour de vie postnatale), suivie d'une convulsion induite par hyperthermie à P10 (nommés rats LHS). À la suite de ces insultes, 86% des rats mâles LHS développent l’épilepsie à l’âge adulte, au même titre que des troubles d’apprentissage. À P20, ces animaux presentent une augmentation de l'expression de KCC2 associée à une hyperpolarisation du potentiel de réversion de GABA. De plus, nous avons observé des réductions dans la taille des épines dendritiques et l'amplitude des courants post-synaptiques excitateurs miniatures, ainsi qu’un déficit de mémoire spatial, et ce avant le développement des convulsions spontanées. Dans le but de rétablir les déficits observés chez les rats LHS, nous avons alors réalisé un knock-down de KCC2 par shARN spécifique par électroporation in utero. Nos résultats ont montré une diminution de la susceptibilité aux convulsions due à la lésion corticale, ainsi qu'une restauration de la taille des épines. Ainsi, l’augmentation de KCC2 à la suite d'une convulsion précoce, augmente la susceptibilité aux convulsions modifiant la morphologie des épines dendritiques, probable facteur contribuant à l’atrophie de l’hippocampe et l’occurrence des déficits cognitifs. Le deuxième objectif a été d'inspecter l’effet de la surexpression précoce de KCC2 dans le développement des épines dendritiques de l’hippocampe. Nous avons ainsi surexprimé KCC2 aussi bien in vitro dans des cultures organotypiques d’hippocampe, qu' in vivo par électroporation in utero. À l'inverse des résultats publiés dans le cortex, nous avons observé une diminution de la densité d’épines dendritiques et une augmentation de la taille des épines. Afin de confirmer la spécificité du rôle de KCC2 face à la région néocorticale étudiée, nous avons surexprimé KCC2 dans le cortex par électroporation in utero. Cette manipulation a eu pour conséquences d’augmenter la densité et la longueur des épines synaptiques de l’arbre dendritique des cellules glutamatergiques. En conséquent, ces résultats ont démontré pour la première fois, que les modifications de l’expression de KCC2 sont spécifiques à la région affectée. Ceci souligne les obstacles auxquels nous faisons face dans le développement de thérapie adéquat pour l’épilepsie ayant pour but de moduler l’expression de KCC2 de façon spécifique.

Cost-effectiveness of Transcatheter Mitral Valve Leaflet Repair for the Treatment of Mitral Regurgitation in Heart Failure

Contexte: La régurgitation mitrale (RM) est une maladie valvulaire nécessitant une intervention dans les cas les plus grave. Une réparation percutanée de la valve mitrale avec le dispositif MitraClip est un traitement sécuritaire et efficace pour les patients à haut risque chirurgical. Nous voulons évaluer les résultats cliniques et l'impact économique de cette thérapie par rapport à la gestion médicale des patients en insuffisance cardiaque avec insuffisance mitrale symptomatique. Méthodes: L'étude a été composée de deux phases; une étude d'observation de patients souffrant d'insuffisance cardiaque et de régurgitation mitrale traitée avec une thérapie médicale ou le MitraClip, et un modèle économique. Les résultats de l'étude observationnelle ont été utilisés pour estimer les paramètres du modèle de décision, qui a estimé les coûts et les avantages d'une cohorte hypothétique de patients atteints d'insuffisance cardiaque et insuffisance mitrale sévère traitée avec soit un traitement médical standard ou MitraClip. Résultats: La cohorte de patients traités avec le système MitraClip était appariée par score de propension à une population de patients atteints d'insuffisance cardiaque, et leurs résultats ont été comparés. Avec un suivi moyen de 22 mois, la mortalité était de 21% dans la cohorte MitraClip et de 42% dans la cohorte de gestion médicale (p = 0,007). Le modèle de décision a démontré que MitraClip augmente l'espérance de vie de 1,87 à 3,60 années et des années de vie pondérées par la qualité (QALY) de 1,13 à 2,76 ans. Le coût marginal était 52.500 $ dollars canadiens, correspondant à un rapport coût-efficacité différentiel (RCED) de 32,300.00 $ par QALY gagné. Les résultats étaient sensibles à l'avantage de survie. Conclusion: Dans cette cohorte de patients atteints d'insuffisance cardiaque symptomatique et d insuffisance mitrale significative, la thérapie avec le MitraClip est associée à une survie supérieure et est rentable par rapport au traitement médical.