Fisiologia e formação de partículas lipídicas durante o crescimento da levedura Yarrowia lipolytica IMUFRJ 50682.

A levedura Yarrowia lipolytica tem sido muito investigada, especialmente por ser um microrganismo oleaginoso, ou seja, capaz de acumular grandes quantidades de lipídios, o que ocorre majoritariamente em organelas denominadas partículas lipídicas. Estes lipídios apresentam várias potenciais aplicações biotecnológicas, como por exemplo na produção de óleo microbiano (single cell oil) e na produção de biodiesel. Durante este projeto de mestrado, objetivou-se estudar a fisiologia de duas linhagens da levedura Y. lipolytica, sendo uma tradicionalmente estudada pela comunidade científica internacional (linhagem w29) e outra isolada da Baía da Guanabara, no Rio de Janeiro (linhagem IMUFRJ 50682). Foram realizados cultivos em frascos agitados tipo Erlenmeyer com defletores tampados com algodão (volume total 500 mL, volume de meio 100 mL, 28 oC e 200 rotações por minuto), durante os quais foi possível: 1) escolher um meio de cultivo de composição totalmente definida, com tiamina como único fator de crescimento, adequado a estudos de fisiologia quantitativa com esta levedura; 2) verificar que Y. lipolytica não é capaz de crescer com sacarose ou xilose como única fonte de carbono; 3) verificar que Y. lipolytica cresce com velocidade específica de crescimento máxima (Máx) de 0,49 h-1 num meio complexo contendo glicose, extrato de levedura e peptona (meio YPD), 0,31 h-1 em meio definido com glicose como única fonte de carbono e 0,35 h-1 no mesmo meio, mas com glicerol como única fonte de carbono, sem excreção de metabólitos para o meio de cultivo; 4) verificar que ocorreu limitação por oxigênio nos cultivos em frasco agitado, sendo este o motivo pelo qual as células deixaram de crescer exponencialmente; 5) verificar que o uso de ureia, em vez de sulfato de amônio, como fonte de nitrogênio, contribui para uma variação menor do pH durante os cultivos, sem prejuízo ao crescimento da levedura; 6) observar que, ao se restringir a oferta de nitrogênio à levedura (aumento da relação C/N inicial no meio de 12,6 para 126), as células têm sua morfologia alterada e apresentam maior quantidade de partículas lipídicas; 7) determinar uma composição elementar para a biomassa de Y. lipolytica (CH1,98O0,58N0,13), em que os átomos de carbono encontram-se em média mais reduzidos do que na biomassa de leveduras como Saccharomyces cerevisiae e Dekkera bruxellensis. Foram também realizados cultivos em biorreator em batelada (1 L de volume útil, 28 oC, aerobiose plena e pH controlado em 5,0), durante os quais foi possível: a) estabelecer um protocolo de cultivo para Y. lipolytica em biorreator (que envolvem agitação mecânica, aeração e uso de anti-espumante, entre outras diferenças em relação aos cultivos em frasco); b) confirmar os valores dos principais parâmetros fisiológicos apresentados por esta levedura, anteriormente obtidos a partir de cultivos em frasco; c) confirmar que o fator de conversão de substrato a células (Yx/s) é maior para cultivos realizados com glicerol como fonte única de carbono (0,53 g/g para a linhagem IMUFRJ 50682), do que com glicose (0,48 g/g para a mesma linhagem). Finalmente, cultivos realizados em quimiostato com glicerol como fonte de carbono e energia, limitados por amônio (fonte de nitrogênio, relação C/N 126), às vazões específicas de 0,25 h-1 e 0,15 h-1, permitiram observar que o número de partículas lipídicas por célula de Y. lipolytica permaneceu em torno de 2 em ambas as situações e houve uma diminuição no teor de nitrogênio nas células quando a velocidade específica de crescimento diminuiu de 0,25 para 0,15 h-1.

Estudo da cinética de crescimento de células de inseto Sf21 e infecção por baculovírus Anticarsia gemmatalis (AgMNPV) para a produção de bioinseticida.

O interesse em estudar o cultivo das células de inseto está relacionado entre outros usos a sua utilização na produção de biopesticidas. Há muitos anos os pesticidas químicos vêm contribuindo no controle de pragas na agricultura. Entretanto, o uso desses compostos prolongadamente tem resultado na seleção de insetos resistentes e em poluição ambiental. Diante disso, torna-se necessário o desenvolvimento e aprimoramento dos bioinseticidas. No Brasil, o baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) foi o principal agente de controle biológico da praga da soja Anticarsia gemmatalis. Assim, estudos que viabilizem a produção desses vírus in vitro possibilitariam uma produção mais controlada e de melhor qualidade desses biopesticidas. Neste trabalho, investigou-se a suscetibilidade à infecção por AgMNPV de diferentes linhagens celulares de Sf21 e o crescimento dessas células em diferentes sistemas: cultivos em schotts, em spinner e em biorreator, variando-se a idade do inóculo (IA) e a concentração celular inicial (X0). Constatou-se variação no perfil de infecção das linhagens, sendo as linhagens mais adequadas para a produção de bioinseticida as linhagens de Sf21 denominadas EMBRAPA, UFRN e GibcoG, uma vez que estas apresentaram mais do que 40 % das células com poliedros em cultivos em suspensão, enquanto a linhagem denominada GibcoSF teve menos de 2 % das células infectadas com poliedros. Ao se estudar o efeito do número de subcultivos na morfologia e crescimento celular, foi averiguado um aumento no diâmetro de 10 % e no volume de 26 % das células UFRN em relação às células GibcoSF. Além disso, o crescimento das células UFRN foi 49% menor do que das células GibcoSF. Quando realizado o Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) para se analisar o efeito da IA e a X0 na taxa de crescimento específica máxima (?max) e na concentração celular máxima (Xvmax) em cultivos em schott com células UFRN, obteve-se um modelo empírico. Quando analisadas as variáveis IA e X0 separadamente, não foram encontradas diferenças significativas para as respostas Xvmax e ?max em relação a X0. Para a IA, entretanto, obteve-se os resultados mais satisfatórios para os inóculos com IA de 72 e 96 horas: Xvmax de 5,97.106 cel/mL e 5,99.106 cel/mL, e ?max de 0,70 dia-1 e 0,63 dia-1, respectivamente. Nos cultivos em spinner com células UFRN, foi observada a formação de grumos, o que levou a Xvmax de 2,00.106 cel/mL. No cultivo em biorreator com células UFRN, foi obtido um Xvmax de 6,21.106 cel/mL, ?max de 0,70 dia-1, Qo2 na fase exponencial de 67,3 ± 3,6 .10-18 molO2/cel/s, rendimento de glicose em célula igual a 1,0.109 cel/g de glicose e um rendimento de glutamina em células de 3,0.109 cel/mL. Comprovou-se, portanto, a existência de alterações na infecção entre diferentes linhagens de Sf21; a importância do estado fisiológico da célula nos subcultivos, a ocorrência de mudanças no crescimento celular de acordo com os sistemas de cultivo e o efeito do número de subcultivos na morfologia e crescimento de células Sf21.