Avaliação da qualidade microbiológica, contagem de Pseudomonas spp, e sua importância durante a obtenção e armazenamento de leite cru refrigerado no período de seca e chuva

Na propriedade rural, onde o leite cru refrigerado fica armazenado até a captação pelo caminhão tanque em coleta a granel, o mesmo é mantido a temperatura de refrigeração entre 1 a 4ºC por longos períodos (até 96 horas), os microrganismos psicrotróficos encontram condições favoráveis para sua multiplicação, produzindo enzimas proteolíticas e lipolíticas termotolerantes, podendo provocar alterações indesejáveis no leite e nos seus derivados. Quando estes microrganismos estão presentes em elevadas populações, pode ser indicativo de baixa qualidade do leite e insatisfatória condições sanitárias para o processamento. Devido a necessidade da melhora da qualidade dos produtos lácteos, objetivou-se a execução desta pesquisa realizando levantamentos sobre o cumprimento dos padrões microbiológicos exigidos pela atual legislação brasileira IN 62 (BRASIL, 2011), pesquisas sobre os microrganismos psicrotróficos, Pseudomonas spp. e produção de enzimas proteolítica e lipolítica por Pseudomonas spp. As coletas foram realizadas em 10 propriedades do Estado de São Paulo na Regional Agrícola do Escritório de Desenvolvimento Rural - EDR Limeira - SP, sendo, 5 propriedades com ordenha manual e 5 propriedades com ordenha mecânica, nos períodos de chuva e seca e em vários pontos durante a obtenção do leite cru refrigerado e também do leite com intervalo de 24 horas até a captação deste leite pelo caminhão. As médias das populações dos microrganismos mesófilos na ordenha manual, foi diferente estatisticamente significativo no leite recém ordenhado (1,52×106 UFC.mL-1) para o leite com 24 horas de armazenamento (2,67×107 UFC.mL-1) no período chuvoso, e na ordenha mecânica, o encontrado foi uma diferença estatisticamente significativa no leite recém ordenhado (3,87×106 UFC.mL-1) para o leite com 24 horas de armazenamento (9,82×108 UFC.mL-1) também no período chuvoso. Nas populações dos microrganismos psicrotróficos, suas médias diferiram estatisticamente na ordenha manual no período da chuva no leite recém ordenhado (1,48×104 UFC.mL-1) para o leite com 48 horas de armazenamento (1,49×105 UFC.mL-1) e na ordenha mecânica, o leite recém ordenhado (8,74×103 UFC.mL-1), com 24 horas de armazenamento (4,33×104 UFC.mL-1) não diferiram entre si e foram diferentes estatisticamente do leite com 48 horas de armazenamento (3,46×105 UFC.mL-1) apresentaram valor elevado, principalmente quando o leite cru refrigerado permanece por longos períodos de armazenamento na propriedade rural, que pode ser um sério fator de comprometimento pela produção de lipases ou proteases principalmente pelas Pseudomonas spp. onde em todos os pontos amostrados foram isolados este microrganismo produzindo enzimas (lipase e/ou protease). A maior porcentagem de atividade lipolítica foi verificada no período seco, já a maior porcentagem de atividade proteolítica foi verificada no período chuvoso. Contudo, deve-se intensificar as medidas de autocontrole para minimizar os efeitos dos microrganismos mesófilos e psicrotróficos sobre a qualidade do leite cru refrigerado e, consequentemente, de seus derivados.

Células-tronco de membrana amniótica de cão como terapia alternativa para o tratamento de ceratoconjuntivite seca em cães

A Ceratoconjuntivite Seca (KCS Keratoconjunctivitis Sicca) é uma desordem imunomediada e resulta de alterações do componente aquoso do filme lacrimal e da deficiência dos componentes lipídicos e mucoso.Seu diagnóstico é baseado no Teste Lacrimal de Schirmer (TLS) e no Teste de Ruptura do Filme Lacrimal (TRFL) e tem como sinais clínicos: secreção mucopurulenta, hiperemia conjuntival, blefaroespasmos, fotofobia, incômodo, dor, vascularização, opacidade corneana e pigmentação, além de cegueira em casos avançados. O tratamento convencional consiste em aplicações diárias de Ciclosporina 0,2% ou Tacrolimus 0,03% (pomada ou colírio oftálmicos), que apesar de controlar a doença, são custosos, não curativos e exigem alto comprometimento da interação paciente-proprietário. A terapia celular usando células-tronco (CT) traz uma nova esperança para doenças sem tratamento efetivo. Neste trabalho utilizamos CT mesenquimais (CTM) obtidas a partir de membrana amniótica (CTMA) de cães obtidas a partir do descarte destes tecidos em campanhas de castrações em diferentes tempos gestacionais, sem formação tumoral quando submetidas ao teste tumorigênico durante 60 dias. Dois animais com KCS crônica foram tratados com duas injeções de CTMA com intervalo de 30 dias, sendo a primeira de 0,5x106 células e a segunda de 1x106 células em cada glândula. Na segunda semana após a terapia foi observado aumento da TLS sugerindo um benéficio da terapia que foi diminuindo com o passar das semanas. O TRFL oscilou durante os testes e não apresentou diferenças significativas. A terapia celular utilizando CTMA de cães melhorou a condição ocular nos dois casos em momentos e parâmetros variados, com repercussão na melhoria da superfície, mas não houve regressão do quadro clínico. Investigações futuras em estágios menos avançados da doença podem ajudar a elucidar os mecanismos pelos quais esse efeito foi obtido

Inoculação com leveduras e exposição ao ar modificam o valor nutritivo de silagem de milho para vacas leiteiras

Silagens de milho são mais propensas à deterioração quando expostas ao ar. As leveduras assimiladoras de ácido lático são frequentemente os primeiros microrganismos a iniciar a deterioração aeróbia nas silagens. Alguns estudos reportam que silagem de milho aerobicamente instável está associada à redução no consumo, na produção de leite e depressão no teor de gordura do leite. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar a influência de inoculação de leveduras (Pichia norvegensis) e a exposição ao ar por 48 horas sobre o valor nutritivo das silagens e o desempenho de vacas leiteiras. O milho foi colhido com 34% de MS, tratado sem (Controle) ou com P. norvegensis, na dose 1×105 ufc/g MV (Levedura) e armazenado silos tipo bolsa (40 t/silo). Após 123 dias de armazenamento, os silos foram abertos e a silagem foi fornecida para vacas leiteiras. Diariamente, as silagens foram retiradas e fornecidas imediatamente (Fresca) ou após 48 horas de exposição (Exposta). Vinte vacas Holandesas foram distribuídas em 5 quadrados latinos replicados 4×4, com períodos de 21 dias (15 d para adaptação + 6 d para amostragem). As dietas foram formuladas para conter: 53% silagem de milho, 8% caroço de algodão, 18% farelo de soja, 9,5% polpa cítrica, 9% milho seco moído e 2,5% premix vitamínico e mineral. Os quatro tratamentos foram assim constituídos: silagem controle fresca (CF), silagem controle exposta (CE), silagem inoculada com levedura fresca (LF) e silagem inoculada com levedura exposta (LE). A inoculação com levedura aumentou as perdas de matéria seca (P<0,001) e reduziu o tempo de estabilidade aeróbia (P=0,03) das silagens de milho. No ensaio de desempenho animal, reduziu a produção de leite corrigida para 3,5% de gordura (P=0,03) e a eficiência alimentar (ELL leite/CMS) (P<0,01), porém não alterou o teor de gordura do leite. Quanto aos efeitos da exposição ao ar por 48 horas, estes reduziram a concentração de ácido lático (P<0,001), que consequentemente aumentou o pH (P=0,004) das silagens, além de reduzir outros produtos de fermentação. A exposição também reduziu a produção de leite corrigido para gordura (P=0,02) e a eficiência alimentar (P=0,10). Nenhum tratamento alterou o consumo de MS. Houve tendência para redução da digestibilidade da MS e FDN e do NDT, quando as silagens foram expostas ao ar. A inoculação com leveduras e a exposição ao ar por 48 horas deprimem o desempenho animal através da redução no valor nutritivo das silagens de milho.

Mapeamento associativo para múltiplos ambientes e múltiplos locos, visando tolerância à seca em milho

A seca é um dos estresses abióticos mais importantes na cultura do milho, o qual ocasiona reduções significativas na produção de grãos. A arquitetura genética da tolerância à seca é complexa, fazendo-se necessária a melhor compreensão desse caráter. Estudos envolvendo mapeamento associativo são úteis por explorarem a variação genética de caracteres quantitativos e, adicionalmente, levam em conta informações acerca de genótipos, ambientes e interações genótipo por ambiente (G × E). Ao considerar efeitos de G × E em modelos de mapeamento associativo há possibilidade de identificar regiões no genoma associadas à condições e ambientes específicos. Este trabalho teve como objetivo detectar associações relacionadas à tolerância à seca em milho por meio de um modelo de mapeamento associativo para múltiplos ambientes e múltiplos locos, o qual permitiu distinguir associações com efeitos ambiente-específico daquelas com efeitos principais e de interação associação por ambiente (QEI). O painel associativo foi composto por 190 linhagens, classificadas de acordo com os grupos heteróticos quanto ao tipo de grão. Marcadores SNPs (∼500k) foram utilizados para a genotipagem do painel associativo. Duas linhagens (L228-3 e L3) foram usadas como testadores comuns e os híbridos obtidos foram avaliados em duas localidades (Janaúba-MG e Teresina-PI), dois anos agrícolas (2010 e 2011), sob duas condições de tratamento (irrigado e não irrigado). Ao total, consideraram-se seis caracteres: peso de grãos, intervalo de florescimento, florescimento feminino e masculino, altura de planta e de espiga. Consideraram-se dois grupos de mapeamento, agrupados de acordo com os testadores utilizados. SNPs foram úteis para testar associações ao longo do genoma do milho e investigar o relacionamento genético entre indivíduos. O modelo de mapeamento associativo, com inclusão de informações sobre interação G × E, detectou o total de 179 associações, e o maior número de associações foram relacionadas aos caracteres de florescimento. A maioria das associações (168) apresentaram QEI significativo, sendo que o tamanho e a magnitude desses efeitos distinguiram-se de acordo com o ambiente em avaliação. Apenas o caráter florescimento feminino não apresentou associações com efeitos estáveis ao longo dos ambientes em estudo. A detecção de algumas associações em posições próximas do genoma evidenciam possíveis efeitos de pleiotropia. Algumas associações foram co-localizadas em regiões do genoma do milho relacionadas à tolerância à seca, sendo que algumas dessas associações estavam envolvidas a fatores pertencentes à vias metabólicas de interesse. O presente estudo forneceu informações úteis para a compreensão da base genética da tolerância à seca em milho sob os ambientes específicos em avaliação.

Efeito da substituição de plasma sanguíneo por levedura hidrolisada sobre rendimento e imunidade de leitões desmamados

O Experimento foi realizado com o objetivo de avaliar a substituição parcial e total de plasma bovino por levedura hidrolisada na dieta de leitões desmamados no período de 21 a 47 dias de idade. Foram utilizados 1600 leitões da linhagem PIC, distribuídos em blocos ao acaso, com quatro tratamentos. As dietas foram divididas em quatro fases (pré-inicial I 22 a 28 dias; pré-inicial II 29 a 35 dias; inicial I - 36 a 47 dias e inicial II 48 a 63 dias). A inclusão percentual, Plasma: Levedura, nas dietas foi: T1 (6:0; 4:0; 2:0 e 0:0); T2 (3: 4; 2: 3; 1: 2 e 0: 0); T3 (1,5: 6; 1: 4,5; 0,5: 3 e 0: 0) e T4 (0: 8; 0: 6; 0: 4 e 0: 0). Cada tratamento teve 10 repetições (cinco de machos e cinco de fêmeas) totalizando 40 unidades experimentais com 40 animais cada. As variáveis zootécnicas avaliadas durante o período experimental foram: consumo de ração, ganho de peso, e conversão alimentar. Foram tomadas amostras de sangue de 5 animais por tratamento no dia de início do experimento, e de 10 animais por tratamento 25 dias depois. Foram quantificadas a IgA e a IgG. Os dados obtidos foram submetidos a análise de variância ANOVA, utilizando-se o teste Tukey para comparação das médias ao nível de significância de 5% utilizando o pacote estatístico SAS. Não houve diferença estatística nas quantidades de Ig A e Ig G circulante, nem na variação destas imunoglobulinas no tempo, entre os tratamentos. Considerando a análise dos dados conclui-se que nas condições estudadas, a utilização da relação percentual de (1,5: 6; 1: 4,5; 0,5: 3 e 0: 0) de plasma: levedura hidrolisada resultou um maior consumo de ração e ganho de peso dos animais, em comparação às outras proporções, e consequentemente podendo trazer um maior lucro para o produtor

Identificação e caracterização de RNA mensageiros candidatos a alvo das proteínas PUMILHO de Arabidopsis através do sistema triplo-híbrido de levedura

Proteínas PUF regulam a estabilidade e a tradução através da ligação a seqüências específicas nas regiões 3\' não traduzidas (3\' UTR) dos mensageiros. A ligação é mediada por um domínio de ligação conservado constituído por 8 repetições de aproximadamente 36 aminoácidos cada. Experimentos realizados no sistema triplo-híbrido de levedura mostraram que os homólogos PUF de Arabidopsis APUM-1, APUM-2 e APUM-3 são capazes de ligar especificamente à seqüência chamada de Elemento de Resposta a NANOS (NRE) reconhecida pelo homólogo PUF de Drosophila. A utilização de bibliotecas de expressão de RNA em ensaios no sistema triplo-híbrido permitiu a identificação de seqüências de ligação consenso para as três proteínas APUM. Análises computacionais identificaram elementos de ligação a APUM em regiões 3\' UTR de importantes transcritos relacionados ao controle do meristema do caule e à manutenção das células totipotentes. Nós mostramos que os homólogos APUM-l, APUM-2 e APUM-3 reconhecem elementos de ligação a APUM nas regiões 3\' UTR dos transcritos WUSCHEL, CLAVATA-1, ZWILLE e FASCIATA-2. Ensaios de RT-PCR e Western blot semiquantitativos mostraram que a quantidade dos transcritos WUSHEL e CLAVATA-1 é alterada em plantas antisenso induzíveis para APUM-l, APUM-2 e APUM-3. A relevância biológica dessas interações foi observada através de ensaios de coimunoprecipitação, confirmando, portanto, o primeiro caso de regulação traducional descrito para os mensageiros WUSCHEL e CLAVATA-1. Análises computacionais adicionais para a identificação de outros homólogos PUF em Arabidopsis encontraram vinte e cinco proteínas possuindo repetições PUF. Entre elas, os homólogos APUM-4, APUM-S e APUM-6 apresentam alta similaridade com as proteínas APUM-l, APUM-2 e APUM-3, sendo capazes de ligar especificamente à seqüência NRE e aos elementos de ligação a APUM presentes nas regiões 3\' UTR dos transcritos WUSCHEL, CLAVATA-1, ZWILLE e FASCIATA-ts resultados indicam que vários homólogos PUF podem agir como reguladores traducionais em Arabidopsis através de um mecanismo molecular conservado entre as espécies, podendo abrir uma nova área de investigação da regulação de mRNA em plantas.

Complexação de guaiacol com ß-ciclodextrina para tratamento de alveolite seca: avaliação in vitro e in vivo

A alveolite seca (AS) é uma das complicações pós-operatórias mais comuns e sintomáticas na odontologia, porém, até o momento não há um protocolo de tratamento definido. O composto fenólico guaiacol (Gu) é um dos materiais utilizados para revestimento intra-alveolar devido às suas propriedades analgésicas, antioxidantes e antimicrobianas. Contudo, sua desvantagem é a dificuldade de manipulação decorrente da sua baixa estabilidade, alta volatilidade e sensibilidade à oxidação. Para melhorar suas propriedades e aumentar sua aplicabilidade clínica, um complexo de inclusão de Gu com ß-ciclodextrina (ßcd) foi desenvolvido. A formação do complexo supramolecular de Gu:ßcd foi caracterizada mediante a ressonância magnética nuclear (RMN), nos experimentos de 1H e 2D ROESY. A atividade antibacteriana do Gu e Gu:ßcd frente a Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguis e Aggregatibacter actinomycetemcomitans foi analisada pelo método da microdiluição e sua citotoxicidade em osteoblastos de calvária de rato, foi estudado com o ensaio do MTT. O processo de reparo alveolar induzido pelo Gu:ßcd foi avaliado histologicamente após tratamento de alveolite seca em molares inferiores de ratos. A RMN mostrou correlações espaciais entre os hidrogênios internos (H3 e H5) da ßcd e os hidrogênios aromáticos, H(a) e H(b) do Gu, confirmando a formação do complexo. A complexação do Gu na ßcd potencializou seu efeito antibacteriano e reduziu sua citotoxicidade em osteoblastos. O estudo in vivo evidenciou a ocorrência de ossificação no ápice alveolar dos ratos tratados com Gu:ßcd, no 7o dia. No 14o dia, as trabéculas ósseas ocuparam também o terço médio do alvéolo e no 21o dia, todo o alvéolo se encontrava preenchido por osso neoformado. Estes resultados foram similares ao controle negativo e superiores ao controle positivo (Alvogyl®). Os benefícios obtidos pela inclusão do Gu na ßcd foram demonstrados pela melhora das propriedades biológicas do Gu in vitro e o adequado reparo alveolar in vivo.

Caracterização limnológica do rio do Peixe (microrregião geográfica de Botucatu - SP), em duas épocas do ano (períodos de seca e chuva)

O rio do Peixe, um dos principais afluentes do rio Tietê (Reservatório de Barra Bonita/Hidrovia Tietê Paraná), juntamente com seus formadores (microrregião geográfica de Botucatu - SP) constituem os principais mananciais das cidades que se localizam em suas bacias. A maior parte da bacia hidrográfica do rio do Peixe desenvolve-se sob rochas sedimentares arenosas, favoráveis às atividades de extração de areia, fato que aliado ao manejo incorreto do solo favorece a ocorrência de processos erosivos. Foram realizadas amostragens de água durante dez dias consecutivos e de sedimento durante três dias alternados, em dois períodos hidrológicos (seca e chuva), para a determinação de variáveis físicas, químicas e biológicas,com o objetivo principal de caracterizar do ponto de vista limnológico esse rio e sua foz. As análises das diferentes variáveis seguiram os métodos que são utilizados rotineiramente no Laboratório de Limnologia do CRHEA/EESC/USP. As águas do rio do Peixe apresentaram, principalmente altas concentrações de sólidos em suspensão. Os maiores valores de turbidez, condutividade, alcalinidade, HCO3-, CO3-, nitrito, nitrogênio amoniacal, nitrogênio Kjedhal, fosfato inorgânico, carbono orgânico e sólidos em suspensão foram obtidos durante o período de chuvas, influenciados principalmente pelo escoamento superficial que promove o carreamento de materiais da bacia hidrográfica. Foi possível ainda através das características limnológicas, agrupar as estações de amostragem ao longo do contínuo do rio em três regiões (alto, médio e baixo curso), e diferenciar do ponto de vista trófico as estações da foz com o rio Tietê. Um aumento da biomassa fitoplanctônica, no período de seca, no baixo curso do rio do Peixe foi favorecido pela menor vazão na barragem de Barra Bonita.

Rizobactérias nativas da Caatinga com potencial para redução dos efeitos da seca em soja (Glycine max L.)

No semiárido brasileiro, a vegetação predominante é a Caatinga, bioma ainda pouco explorado, que apresenta plantas e micro-organismos com alta resistência aos períodos de seca imposto pelo clima. Os micro-organismos associados às plantas deste bioma, são capazes de desenvolver mecanismos de proteção celular contra o estresse hídrico, assim como proteção vegetal contra a dessecação. O presente estudo buscou compreender as rizobactérias associadas a Mimosa artemisiana a fim de selecionar bactérias tolerantes à seca com características de promover o crescimento de plantas sob condições de estresse hídrico, diminuindo assim, os efeitos adversos impostos pela seca. As amostras de solo rizosférico foram coletadas ao longo da Caatinga, englobando os estados da BA e PE, totalizando quatro pontos de coleta. Com o uso de metodologias dependentes de cultivo, foi isolado bactérias com algumas características de promoção de crescimento de plantas diretos e/ou indiretos, como produção de AIA e fixação de nitrogênio. Além disso, linhagens capazes de crescer em meio com reduzida atividade de água e com mecanismos de proteção contra a dessecação, como, produção de EPS, biofilme, produção da ACC deaminase e indução de resistência sistêmica através das enzimas peroxidase e polifenoloxidase. Uma linhagem de Paenibacillus sp. e outra de Bacillus sp. foram capazes de promover o crescimento de soja sob condições de estresse hídrico, aumentando alguns parâmetros vegetais como, parte aérea e sistema radicular analisados.

Fisiologia e formação de partículas lipídicas durante o crescimento da levedura Yarrowia lipolytica IMUFRJ 50682.

A levedura Yarrowia lipolytica tem sido muito investigada, especialmente por ser um microrganismo oleaginoso, ou seja, capaz de acumular grandes quantidades de lipídios, o que ocorre majoritariamente em organelas denominadas partículas lipídicas. Estes lipídios apresentam várias potenciais aplicações biotecnológicas, como por exemplo na produção de óleo microbiano (single cell oil) e na produção de biodiesel. Durante este projeto de mestrado, objetivou-se estudar a fisiologia de duas linhagens da levedura Y. lipolytica, sendo uma tradicionalmente estudada pela comunidade científica internacional (linhagem w29) e outra isolada da Baía da Guanabara, no Rio de Janeiro (linhagem IMUFRJ 50682). Foram realizados cultivos em frascos agitados tipo Erlenmeyer com defletores tampados com algodão (volume total 500 mL, volume de meio 100 mL, 28 oC e 200 rotações por minuto), durante os quais foi possível: 1) escolher um meio de cultivo de composição totalmente definida, com tiamina como único fator de crescimento, adequado a estudos de fisiologia quantitativa com esta levedura; 2) verificar que Y. lipolytica não é capaz de crescer com sacarose ou xilose como única fonte de carbono; 3) verificar que Y. lipolytica cresce com velocidade específica de crescimento máxima (Máx) de 0,49 h-1 num meio complexo contendo glicose, extrato de levedura e peptona (meio YPD), 0,31 h-1 em meio definido com glicose como única fonte de carbono e 0,35 h-1 no mesmo meio, mas com glicerol como única fonte de carbono, sem excreção de metabólitos para o meio de cultivo; 4) verificar que ocorreu limitação por oxigênio nos cultivos em frasco agitado, sendo este o motivo pelo qual as células deixaram de crescer exponencialmente; 5) verificar que o uso de ureia, em vez de sulfato de amônio, como fonte de nitrogênio, contribui para uma variação menor do pH durante os cultivos, sem prejuízo ao crescimento da levedura; 6) observar que, ao se restringir a oferta de nitrogênio à levedura (aumento da relação C/N inicial no meio de 12,6 para 126), as células têm sua morfologia alterada e apresentam maior quantidade de partículas lipídicas; 7) determinar uma composição elementar para a biomassa de Y. lipolytica (CH1,98O0,58N0,13), em que os átomos de carbono encontram-se em média mais reduzidos do que na biomassa de leveduras como Saccharomyces cerevisiae e Dekkera bruxellensis. Foram também realizados cultivos em biorreator em batelada (1 L de volume útil, 28 oC, aerobiose plena e pH controlado em 5,0), durante os quais foi possível: a) estabelecer um protocolo de cultivo para Y. lipolytica em biorreator (que envolvem agitação mecânica, aeração e uso de anti-espumante, entre outras diferenças em relação aos cultivos em frasco); b) confirmar os valores dos principais parâmetros fisiológicos apresentados por esta levedura, anteriormente obtidos a partir de cultivos em frasco; c) confirmar que o fator de conversão de substrato a células (Yx/s) é maior para cultivos realizados com glicerol como fonte única de carbono (0,53 g/g para a linhagem IMUFRJ 50682), do que com glicose (0,48 g/g para a mesma linhagem). Finalmente, cultivos realizados em quimiostato com glicerol como fonte de carbono e energia, limitados por amônio (fonte de nitrogênio, relação C/N 126), às vazões específicas de 0,25 h-1 e 0,15 h-1, permitiram observar que o número de partículas lipídicas por célula de Y. lipolytica permaneceu em torno de 2 em ambas as situações e houve uma diminuição no teor de nitrogênio nas células quando a velocidade específica de crescimento diminuiu de 0,25 para 0,15 h-1.