Regulation of tumor suppressor protein p53 in cellular stress and tumorigenesis

Functional loss of tumor suppressor protein p53 is a common feature in diverse human cancers. The ability of this protein to sense cellular damage and halt the progression of the cell cycle or direct the cells to apoptosis is essential in preventing tumorigenesis. Tumors having wild-type p53 also respond better to current chemotherapies. The loss of p53 function may arise from TP53 mutations or dysregulation of factors controlling its levels and activity. Probably the most significant inhibitor of p53 function is Mdm2, a protein mediating its degradation and inactivation. Clearly, the maintenance of a strictly controlled p53-Mdm2 route is of great importance in preventing neoplastic transformation. Moreover, impairing Mdm2 function could be a nongenotoxic way to increase p53 levels and activity. Understanding the precise molecular mechanisms behind p53-Mdm2 relationship is thus essential from a therapeutic point of view. The aim of this thesis study was to discover factors affecting the negative regulation of p53 by Mdm2, causing activation of p53 in stressed cells. As a model of cellular damage, we used UVC radiation, inducing a complex cellular stress pathway. Exposure to UVC, as well as to several chemotherapeutic drugs, causes robust transcriptional stress in the cells and leads to activation of p53. By using this model of cellular stress, our goal was to understand how and by which proteins p53 is regulated. Furthermore, we wanted to address whether these pathways affecting p53 function could be altered in human cancers. In the study, two different p53 pathway proteins, nucleophosmin (NPM) and promyelocytic leukemia protein (PML), were found to participate in the p53 stress response following UV stress. Subcellular translocations of these proteins were discovered rapidly after exposure to UV. The alterations in the cellular localizations were connected to transient interactions with p53 and Mdm2, implicating their significance in the regulation of p53 stress response. NPM was shown to control Mdm2-p53 interface and mediate p53 stabilization by blocking the ability of Mdm2 to promote p53 degradation. Furthermore, NPM mediated p53 stabilization upon viral insult. We further detected a connection between cellular pathways of NPM and PML, as PML was found to associate with NPM in UV-radiated cells. The observed temporal UV-induced interactions strongly imply existence of a multiprotein complex participating in the p53 response. In addition, PML controlled the UV response of NPM, its localization and complex formation with chromatin associated factors. The relevance of the UV-promoted interactions was demonstrated in studies in a human leukemia cell line, being under abnormal transcriptional repression due to expression of oncogenic PML-RARa fusion protein. Reversing the leukemic phenotype with a therapeutically significant drug was associated with similar complex formation between p53 and its partners as following UV. In conclusion, this thesis study identifies novel p53 pathway interactions associated with the recovery from UV-promoted as well as oncogenic transcriptional repression.

Food and Indoor Air Isolated Bacillus Non-Protein Toxins: : Structures, Physico-Chemical Properties and Mechanisms of Effects on Eukaryotic Cells

We report here the structures and properties of heat-stable, non-protein, and mammalian cell-toxic compounds produced by spore-forming bacilli isolated from indoor air of buildings and from food. Little information is available on the effects and occurrence of heat-stable non-protein toxins produced by bacilli in moisture-damaged buildings. Bacilli emit spores that move in the air and can serve as the carriers of toxins, in a manner similar to that of the spores of toxic fungi found in contaminated indoor air. Bacillus spores in food cause problems because they tolerate the temperatures applied in food manufacture and the spores later initiate growth when food storage conditions are more favorable. Detection of the toxic compounds in Bacillus is based on using the change in mobility of boar spermatozoa as an indicator of toxic exposure. GC, LC, MS, and nuclear magnetic resonance NMR spectroscopy were used for purification, detection, quantitation, and analysis of the properties and structures of the compounds. Toxicity and the mechanisms of toxicity of the compounds were studied using boar spermatozoa, feline lung cells, human neural cells, and mitochondria isolated from rat liver. The ionophoric properties were studied using the BLM (black-lipid membrane) method. One novel toxin, forming ion channels permeant to K+ > Na+ > Ca2+, was found and named amylosin. It is produced by B. amyloliquefaciens isolated from indoor air of moisture-damaged buildings. Amylosin was purified with an RP-HPLC and a monoisotopic mass of 1197 Da was determined with ESI-IT-MS. Furthermore, acid hydrolysis of amylosin followed by analysis of the amino acids with the GS-MS showed that it was a peptide. The presence of a chromophoric polyene group was found using a NMR spectroscopy. The quantification method developed for amylosin based on RP-HPLC-UV, using the macrolactone polyene, amphotericin B (MW 924), as a reference compound. The B. licheniformis strains isolated from a food poisoning case produced a lipopeptide, lichenysin A, that ruptured mammalian cell membranes and was purified with a LC. Lichenysin A was identified by its protonated molecules and sodium- and potassium- cationized molecules with MALDI-TOF-MS. Its protonated forms were observed at m/z 1007, 1021 and 1035. The amino acids of lichenysin A were analyzed with ESI-TQ-MS/MS and, after acid hydrolysis, the stereoisomeric forms of the amino acids with RP-HPLC. The indoor air isolates of the strain of B. amyloliquefaciens produced not only amylosin but also lipopeptides: the cell membrane-damaging surfactin and the fungicidal fengycin. They were identified with ESI-IT-MS observing their protonated molecules, the sodium- and potassium-cationized molecules and analysing the MS/MS spectra. The protonated molecules of surfactin and fengycin showed m/z values of 1009, 1023, and 1037 and 1450, 1463, 1493, and 1506, respectively. Cereulide (MW 1152) was purified with RP-HPLC from a food poisoning strain of B. cereus. Cereulide was identified with ESI-TQ-MS according to the protonated molecule observed at m/z 1154 and the ammonium-, sodium- and potassium-cationized molecules observed at m/z 1171, 1176, and 1192, respectively. The fragment ions of the MS/MS spectrum obtained from the protonated molecule of cereulide at m/z 1154 were also interpreted. We developed a quantification method for cereulide, using RP-HPLC-UV and valinomycin (MW 1110, which structurally resembles cereulide) as the reference compound. Furthermore, we showed empirically, using the BLM method, that the emetic toxin cereulide is a specific and effective potassium ionophore of whose toxicity target is especially the mitochondria.

The Population Consequences of Sex and Conflict

Natural selection generally operates at the level of the individual, or more specifically at the level of the gene. As a result, individual selection does not always favour traits which benefit the population or species as a whole. The spread of an individual gene may even act to the detriment of the organism in which it finds. Thus selection at the level of the individual can affect processes at the level of the organism, group or even at the level of the species. As most behaviours ultimately affect births, deaths and the distribution of individuals, it seems inevitable that behavioural decisions will have an impact on population dynamics and population densities. Behavioural decisions can often involve costs through allocation of energy into behavioural strategies, such as the investment into armaments involved in fighting over resources or increased mortality due to injury or increased predation risk. Similarly, behaviour may act o to benefit the population, in terms of higher survival and increased fecundity. Examples include increased investment through parental care, choosing a mate based on the nuptial gifts they may supply and choosing territories in the face of competition. Investigating the impact of behaviour on population ecology may seem like a trivial task, but it is likely to have important consequences at different levels. For example, antagonistic behaviour may occasionally become so extreme that it increases the risk of extinction, and such extinction risk may have important implications for conservation. As a corollary, any such behaviour may also act as a macroevolutionary force, weeding out populations with traits which, whilst beneficial to the individuals in the short term, ultimately result in population extinction. In this thesis, I examine how behaviours, specifically conflict and competition over a resource and aspects of behaviour involved in sexual selection, can affect population densities, and what the implications are for the evolution and ecology of the populations in question. It is found that both behaviours related to individual conflict and mating strategies can have an effect at the level of the population, but that various factors, such as a feedback between selection and population densities or macroevolution caused by species extinctions, may act to limit the intensity of conflicts that we observe in nature.

Suokasvillisuuden vaste muuttuvaan ilmastoon: kokeellinen tutkimus kuivumisen vaikutuksesta

Soilla on merkittävä rooli ilmastonmuutoksen hillitsemisessä suuren hiilivarastonsa sekä ekosysteemin ja ilmakehän välisen kaasunvaihdon ansiosta. Ilmastonmuutoksen ennustetaan vaikuttavan suokasvillisuuteen ja suon toimintaan epäsuorasti. Vedenpinnan ennustetaan laskevan 14–21 cm johtuen kasveista ja avoimilta pinnoilta tapahtuvan haihdunnan lisääntymisestä lämpötilan noustessa, mikäli sadanta ei lisäänny. Aiemmat vedenpinnan laskun jälkeistä kasvillisuutta seuranneet tutkimukset ovat osoittaneet, että putkilokasvit hyötyvät alhaisemmasta vedenpinnan tasosta ja että kuljuun sopeutuneet rahkasammalet kärsivät kuivuneista oloista. Kasvillisuuden runsaussuhteiden muuttumisen lisäksi kasviyhteisöjen monimuotoisuus vähenee. Erityisen herkkiä vedenpinnan laskulle ovat olleet välipinta- ja kuljurahkasammalet ja sarat. Funktionaalisten kasviryhmien vasteiden selvittämiksesi käytettiin BACI (before-after-control-impact) –tutkimusotetta. Tutkimuksessa oli kolme verrokkialaa ja kolme käsittelyalaa, joissa vedenpintaa oli laskettu 14–21 senttimetriin. Lisäksi vertailukohdaksi tutkimuksessa oli mukana kolme alaa, joissa oli tehty metsäojitus n. 50 vuotta sitten. Nämä toistot sijaitsivat meso-, oligo ombrotrofisilla suotyypeillä Oriveden Lakkasuolla. Kasvillisuus kartoitettiin ja vedenpinnat mitattiin aloilta ennen käsittelyä vuonna 2000 sekä vuosina 2001–2003 ja 2009. Aineisto analysoitiin TWINSPAN- (PC-Ord), PRC ja DCA (CANOCO)-monimuuttujamenetelmillä. Tulokset osoittivat, että verrokki- ja käsittelyalat olivat samanlaisia lähtökohdiltaan, joten niitä voitiin käsittelyn jälkeen verrata toisiinsa. Kasvillisuuden rakenne vaihteli vuosien välillä myös verrokkialoilla, mikä osoittaa kasvien sopeutumiskyvyn muuttuviin sääoloihin (lämpötila, sademäärä). Vuosi 2003 erottui tutkimuksessa alhaisella vedenpinnantasolla, mutta toisaalta myös ainavihantien varpujen suuren peittävyyden osalta. Vuoteen 2009 mennessä kasvillisuuden erityisesti sarojen peittävyys väheni. Ravinteikkaimmilla toistoilla kasvillisuuden vasteet vaikuttivat olevan vahvemmat kuin vähäravinteisilla toistoilla. Kasviryhmistä kulju- ja välipintasammalilla oli vahvimmat vasteetvedenpinnan laskuun ja mätäslajeilla heikoimmat. Tulosten mukaan kasviryhmien vasteet vaihtelevat riippuen tarkasteltavasta aikajaksosta: ensimmäiset kolme vuotta käsittelyn jälkeen suo oli häiriötilassa ja vasta sen jälkeen kasvillisuus sopeutui muuttuneisiin oloihin.

Kaakkois-Suomen lapinraunioiden ikä ja kulttuurikonteksti

Lapinrauniot ovat Järvi-Suomen varhaismetallikautiseen (n. 1900 eaa.-300 jaa.) pyyntiväestöön yhdistettyjä kiviröykkiöitä. Tavallisesti ne esiintyvät yksittäisinä tai korkeintaan muutaman röykkiön ryhminä. Monista lapinraunioita on löytynyt palanutta ihmisen luuta ja joistakin myös hauta-anneiksi tulkittuja esineitä. Osasta ei ole kyetty paikallistaman mitään merkkejä hautauksesta. Jotkut ovat vaikuttaneet löytöjensä perusteella uhriröykkiöiltä. Tässä tutkielmassa selvitellään Etelä-Savon, Etelä-Karjalan ja Pohjois-Kymenlaakson lapinraunioiden ikää ja kulttuuri-kontekstia uusien lapinraunioajoitusten, alueelta aiemmin saatujen luonnontieteellisten ajoitusten ja sijaintitutki-musten avulla. Luonnontieteellisen keskusmuseon ajoituslaboratoriossa teetettiin tutkielmaa varten AMS-ajoitukset tutkimusalueen kolmesta riittävästi luulöytöjä tuottaneesta lapinrauniosta. Sijaintitutkimuksia toteutettiin suorittamalla tilastollisia vertailuja kaikkien tutkimusalueen lapinraunioiden sijoittumisesta suhteessa tekstiilikeramiikkaa (n. 1900-500 eaa.) ja/tai Sär2-keramiikkaa (n. 900 eaa. 300 jaa.) sisältäviin asuinpaikkakohteisiin. AMS-ajoitusten perusteella Iitin Hiidensalmen palanutta luuta, kvartsi-iskoksia ja astiamaisen luonnonkiven sisältänyt lapinraunio on rakennettu 1505-1385 eaa., Ristiinan Haukkavuoren palanutta luuta sisältänyt lapinraunio 1450-1305 eaa. ja Savonlinnan Häyrynjärvi A:n lapinrauniokohteen palanutta luuta, kvartsi-iskoksia sekä Sär2-keramiikan siruja sisältänyt röykkiö kaksi 415-230 eaa. Ajoitustulokset osoittavat, että lapinrauniorakentaminen on omaksuttu Järvi-Suomen kaakkoisosissa jo varhaismetallikauden alussa. Yhdessä aiempien lapinraunioajoitusten kanssa tämä viittaa siihen, että röykkiörakentaminen ei ole levinnyt Järvi-Suomen alueelle lounaisen Suomen pronssikautisesta rannikkokulttuurista (n. 1500-500 eaa), vaan sen taustalta löytyy luultavammin Perämeren rannikolla jo kivikaudella harjoitettu röykkiörakentaminen, jota ei ole kyetty yhdistämään minkäänlaisiin hautausrituaaleihin. Ajoitukset myös vahvistavat hypoteesia, jonka mukaan lapinrauniotradition varhaisvaiheisiin ei ole kuulunut esineiden eikä keramiikan laittaminen röykkiöihin. Ajoitusten vertailu tutkimusalueen aiempiin arkeologisiin ajoituksiin osoittaa, että lapinrauniot eivät ainakaan heti korvanneet maalauskallioita rituaalipaikkoina, vaan kalliomaalausten luona suoritettiin uhrirituaaleja vielä lapinrauniotradition omaksumisen jälkeen. Pienimuotoista kaskiviljelyä on harjoitettu alueella jo ennen lapinrauniorakentamisen omaksumista, mutta pyynti pysyi alueen pääelinkeinona ilmeisesti koko varhaismetallikauden. Varhaismetallikautiset asuinpaikat ovat alueella tyypillisesti leirimäisiä, mikä viittaa harvaan ja liikkuvaan asutukseen. Tutkimusalueen lapinrauniot ja tekstiilikeramiikkaa/Sär2-keramiikkaa sisältävät asuinpaikat ovat tässä tutkielmassa suoritettujen sijaintitutkimusten perusteella keskittyneet toistensa läheisyyteen, vaikka kaikkien lapinraunioiden läheisyydestä ei varhaismetallikautista asuinpaikkaa löydykään. Erityisen usein lapinraunioiden läheisyydessä näyttävät sijaitsevan asuinpaikat, joista on löydetty sekä tekstiilikeramiikkaa että Sär2-keramiikkaa. Tämä viittaa siihen, että lapinraunioiden luokse on palattu yhä uudelleen ja uudelleen. Ne ovat ilmeisesti toimineet rituaalisina kiinnekohtina liikkuvaa elämää viettäville yhteisöille. Roomalaiselle rautakaudelle (0-400 jaa.) ajoitetuista lapinraunioista on muualla Suomessa tyypillisesti löydetty metalliesineitä. Tutkimusalueen lapinrauniosta ei ole tehty yhtäkään metalliesinelöytöä. Tämän perusteella on mahdollista, että lapinrauniotradition myöhäisimpiä kehitysvaiheita ei ole alueella koskaan omaksuttu.