Food and Indoor Air Isolated Bacillus Non-Protein Toxins: : Structures, Physico-Chemical Properties and Mechanisms of Effects on Eukaryotic Cells

We report here the structures and properties of heat-stable, non-protein, and mammalian cell-toxic compounds produced by spore-forming bacilli isolated from indoor air of buildings and from food. Little information is available on the effects and occurrence of heat-stable non-protein toxins produced by bacilli in moisture-damaged buildings. Bacilli emit spores that move in the air and can serve as the carriers of toxins, in a manner similar to that of the spores of toxic fungi found in contaminated indoor air. Bacillus spores in food cause problems because they tolerate the temperatures applied in food manufacture and the spores later initiate growth when food storage conditions are more favorable. Detection of the toxic compounds in Bacillus is based on using the change in mobility of boar spermatozoa as an indicator of toxic exposure. GC, LC, MS, and nuclear magnetic resonance NMR spectroscopy were used for purification, detection, quantitation, and analysis of the properties and structures of the compounds. Toxicity and the mechanisms of toxicity of the compounds were studied using boar spermatozoa, feline lung cells, human neural cells, and mitochondria isolated from rat liver. The ionophoric properties were studied using the BLM (black-lipid membrane) method. One novel toxin, forming ion channels permeant to K+ > Na+ > Ca2+, was found and named amylosin. It is produced by B. amyloliquefaciens isolated from indoor air of moisture-damaged buildings. Amylosin was purified with an RP-HPLC and a monoisotopic mass of 1197 Da was determined with ESI-IT-MS. Furthermore, acid hydrolysis of amylosin followed by analysis of the amino acids with the GS-MS showed that it was a peptide. The presence of a chromophoric polyene group was found using a NMR spectroscopy. The quantification method developed for amylosin based on RP-HPLC-UV, using the macrolactone polyene, amphotericin B (MW 924), as a reference compound. The B. licheniformis strains isolated from a food poisoning case produced a lipopeptide, lichenysin A, that ruptured mammalian cell membranes and was purified with a LC. Lichenysin A was identified by its protonated molecules and sodium- and potassium- cationized molecules with MALDI-TOF-MS. Its protonated forms were observed at m/z 1007, 1021 and 1035. The amino acids of lichenysin A were analyzed with ESI-TQ-MS/MS and, after acid hydrolysis, the stereoisomeric forms of the amino acids with RP-HPLC. The indoor air isolates of the strain of B. amyloliquefaciens produced not only amylosin but also lipopeptides: the cell membrane-damaging surfactin and the fungicidal fengycin. They were identified with ESI-IT-MS observing their protonated molecules, the sodium- and potassium-cationized molecules and analysing the MS/MS spectra. The protonated molecules of surfactin and fengycin showed m/z values of 1009, 1023, and 1037 and 1450, 1463, 1493, and 1506, respectively. Cereulide (MW 1152) was purified with RP-HPLC from a food poisoning strain of B. cereus. Cereulide was identified with ESI-TQ-MS according to the protonated molecule observed at m/z 1154 and the ammonium-, sodium- and potassium-cationized molecules observed at m/z 1171, 1176, and 1192, respectively. The fragment ions of the MS/MS spectrum obtained from the protonated molecule of cereulide at m/z 1154 were also interpreted. We developed a quantification method for cereulide, using RP-HPLC-UV and valinomycin (MW 1110, which structurally resembles cereulide) as the reference compound. Furthermore, we showed empirically, using the BLM method, that the emetic toxin cereulide is a specific and effective potassium ionophore of whose toxicity target is especially the mitochondria.

Tämän väitöskirjan aiheena on sisäilmasta ja ruoka-aineista eristettyjen itiöitä muodostavien Basillusten tuottamien lämmönkestävien toksisten ei-proteiini yhdisteiden rakenne ja toksisuus nisäkäs soluille Basillusten erittämien toksisten ei-proteiini yhdisteiden esiintymisestä, vaikutuksista ja kulkeutumistavoista kosteusvaurioisten rakennusten sisäilmassa ei ole paljon tutkimustietoa. Basillukset muodostavat ilmassa liikkuvia itiöitä, jotka voivat toimia toksiinien kantajina, kuten sisäilmasta eristetyt toksisten sienien itiöt. Ruoka-aineissa Basillusten itiöt ovat ongelmana, koska ne kestävät ruuanvalmistuksessa käytettäviä lämpötiloja ja ovat valmiita lisääntymään ruoka-aineissa suotuisissa olosuhteissa. Basillusten toksiset yhdisteet löydettiin käyttäen toksisuus indikaattorina sian siittiöiden liikkuvuuden muutosta toksisen altistuksen johdosta. Yhdisteiden puhdistuksessa, detektoinnissa ja rakenteen analysoimisessa käytettiin kaasu- ja nestekromatografiaa, massaspektrometriaa ja ydinmagneettista resonanssispektroskopiaa. Yhdisteiden toksisuutta ja vaikutustapoja tutkittiin käyttäen sian siittiöitä, kissan keuhkosoluja, ihmisen hermosoluja ja rotan maksasta eristettyjä mitokondrioita sekä BLM:ää (Black lipid membrane) ioniforisten ominaisuuksien selvittämiseen. Tämän väitöskirjatyön tuloksena löydettiin uusi K+ > Na+ > Ca2+ ionikanavan muodostava toksiini joka sai nimen amylosiini. Amylosiinia tuottivat kosteusvaurioisen rakennuksen sisäilmasta eristetyt B. amyloliquefaciens kannat. Amylosiini puhdistettiin nestekromatografilla ja monoisotooppinen atomipaino 1197 Da selvitettiin sähkösumutusionisaatio ioniloukku massaspektrillä. Lisäksi sen todettiin olevan peptidi happohydrolyysin ja aminohappojen kaasukromatografisen massaspektrometri analyysin avulla. Sen rakenteen todettiin sisältävän kromoforisen polyeeni ryhmän käyttämällä ydinmagneettista resonanssispektroskopiaa. Amylosiinille kehitettiin nestekromatografinen kvantitointimenetelmä käyttäen makrolaktoni polyeenia amphoterisin B:tä (moolimassa 924 g/mol) referenssiaineena. Ruoka-aine myrkytyksestä eristetty B. licheniformis kanta tuotti solukalvoa rikkovaa lipopeptidiä, likenysiini A:ta, joka puhdistettiin nestekromatografilla. Likenysiini A identifioitiin matriisiavusteisella laserionisaatio lentoaika-massaspektrometrillä sen tuottamien protonoituneiden sekä kationioituneiden ammonium, natrium, kalium molekyylien avulla. Sen tuottamat protonoidut molekyylit olivat m/z 1007, 1021 ja 1035. Likenysiini A:n aminohapot analysoitiin sähkösumutus-ionisaatio kolmoiskvadrupolin massaspektrometrin tuottaman tandem-massaspektrin sekä lipopeptidin happohydrolyysin ja aminohappojen nestekromatografisen analyysin avulla. Sisäilmasta eristetyn B. amyloliquefaciens kannan havaittiin tuottavan amylosiinin lisäksi lipopeptideja: sienille toksista fengysiinia ja solukalvoa hajottavaa surfaktiinia. Ne identifioitiin sähkösumutusionisaatio ioniloukku massaspektrillä niiden tuottamien protonoituneiden ja kationisoituneiden ammonium, natrium, kalium molekyylien sekä analysoimalla niiden tuottamat tandem massaspektrit. Surfaktiinin tuottamat protonoidut molekyylit olivat m/z 1009, 1023 ja 1037 ja fengysiinin m/z 1450, 1463, 1493 ja 1506. Kereulidi (moolimassa 1152 g/mol) puhdistettiin nestekromatografisesti ruokamyrkytys tapaukseen liittyvästä B. cereus kannasta. Kereulidi identifioitiin sen sähkösumutusionisaatio kolmoiskvadrupoli massaspektrometrin tuottamien protonoidun molekyylin m/z 1154, ammonium m/z 1171, natrium m/z 1176 ja kalium m/z 1192 kationisoituneiden molekyylien avulla sekä tulkitsemalla kereulidin protonoidun molekyylin m/z 1154 tandem-massaspektrin tuote-ionit. Kereulidille kehitettiin nestekromatografinen kvantitointimenetelmä käyttäen sitä muistuttavaa valinomysiinia (moolimassa 1110 g/mol) referenssiaineena. Lisäksi osoitettiin empiirisesti, käyttämällä BLM:ää, että B. cereuksen tuottama emeettinen toksiini, kereulidi on tehokas ja spesifinen kalium ionifori, jonka toksinen vaikutus kohdistuu erityisesti mitokondrioiden toimintaan.