Food and Indoor Air Isolated Bacillus Non-Protein Toxins: : Structures, Physico-Chemical Properties and Mechanisms of Effects on Eukaryotic Cells

We report here the structures and properties of heat-stable, non-protein, and mammalian cell-toxic compounds produced by spore-forming bacilli isolated from indoor air of buildings and from food. Little information is available on the effects and occurrence of heat-stable non-protein toxins produced by bacilli in moisture-damaged buildings. Bacilli emit spores that move in the air and can serve as the carriers of toxins, in a manner similar to that of the spores of toxic fungi found in contaminated indoor air. Bacillus spores in food cause problems because they tolerate the temperatures applied in food manufacture and the spores later initiate growth when food storage conditions are more favorable. Detection of the toxic compounds in Bacillus is based on using the change in mobility of boar spermatozoa as an indicator of toxic exposure. GC, LC, MS, and nuclear magnetic resonance NMR spectroscopy were used for purification, detection, quantitation, and analysis of the properties and structures of the compounds. Toxicity and the mechanisms of toxicity of the compounds were studied using boar spermatozoa, feline lung cells, human neural cells, and mitochondria isolated from rat liver. The ionophoric properties were studied using the BLM (black-lipid membrane) method. One novel toxin, forming ion channels permeant to K+ > Na+ > Ca2+, was found and named amylosin. It is produced by B. amyloliquefaciens isolated from indoor air of moisture-damaged buildings. Amylosin was purified with an RP-HPLC and a monoisotopic mass of 1197 Da was determined with ESI-IT-MS. Furthermore, acid hydrolysis of amylosin followed by analysis of the amino acids with the GS-MS showed that it was a peptide. The presence of a chromophoric polyene group was found using a NMR spectroscopy. The quantification method developed for amylosin based on RP-HPLC-UV, using the macrolactone polyene, amphotericin B (MW 924), as a reference compound. The B. licheniformis strains isolated from a food poisoning case produced a lipopeptide, lichenysin A, that ruptured mammalian cell membranes and was purified with a LC. Lichenysin A was identified by its protonated molecules and sodium- and potassium- cationized molecules with MALDI-TOF-MS. Its protonated forms were observed at m/z 1007, 1021 and 1035. The amino acids of lichenysin A were analyzed with ESI-TQ-MS/MS and, after acid hydrolysis, the stereoisomeric forms of the amino acids with RP-HPLC. The indoor air isolates of the strain of B. amyloliquefaciens produced not only amylosin but also lipopeptides: the cell membrane-damaging surfactin and the fungicidal fengycin. They were identified with ESI-IT-MS observing their protonated molecules, the sodium- and potassium-cationized molecules and analysing the MS/MS spectra. The protonated molecules of surfactin and fengycin showed m/z values of 1009, 1023, and 1037 and 1450, 1463, 1493, and 1506, respectively. Cereulide (MW 1152) was purified with RP-HPLC from a food poisoning strain of B. cereus. Cereulide was identified with ESI-TQ-MS according to the protonated molecule observed at m/z 1154 and the ammonium-, sodium- and potassium-cationized molecules observed at m/z 1171, 1176, and 1192, respectively. The fragment ions of the MS/MS spectrum obtained from the protonated molecule of cereulide at m/z 1154 were also interpreted. We developed a quantification method for cereulide, using RP-HPLC-UV and valinomycin (MW 1110, which structurally resembles cereulide) as the reference compound. Furthermore, we showed empirically, using the BLM method, that the emetic toxin cereulide is a specific and effective potassium ionophore of whose toxicity target is especially the mitochondria.

"Litrasev viinapulloj ja séittemätóista kalijjaa" : Diftongin reduktio ja geminaatio erään pyhäjärvisistä nuorista koostuvan ryhmän puhekielessä

Tutkielmassa tarkastellaan erään 16- ja 17-vuotiaista syntyperäisistä pyhäjärvisistä nuorista tytöistä ja pojista koostuvan sosiaalisen ryhmän puhekieltä diftongin reduktion ja geminaatioilmiöiden kautta. Geminaatioilmiöistä tarkastellaan yleisgeminaatiota ja itämurteiden erikoisgeminaatiota mutta pääpaino on itämurteiden erikoisgeminaatiossa. Tutkimuspaikkakunta Pyhäjärvi sijaitsee maantieteellisesti Pohjois-Pohjanmaalla mutta kuuluu lingvistisesti savolaismurteisiin. Tutkielman tavoitteena on selvittää, kuinka elinvoimaisia tarkasteltavaksi valitut piirteet ovat sekä kuinka paljon ja miten ne varioivat ryhmän puhekielessä. Aineistoa analysoidaan pääasiassa kvantitatiivisesti. Kvalitatiivisesti piirteiden käyttöä tarkastellaan etenkin vuorovaikutuksen mutta myös sukupuolen näkökulmasta. Tutkittavia kielenoppaita on kuusi: kolme tyttöä ja kolme poikaa. Tytöt ovat lukio- ja pojat ammattikouluopiskelijoita. Kielenoppaiden muodostama ryhmä pohjautuu yläkouluaikaisiin ystävyyssuhteisiin ja oli jo olemassa ennen aineistonkeruuta. Tutkielman aineistona on 5 tuntia ryhmän jäsenten välisiä keskusteluja: 2,5 tuntia tyttöjen keskistä keskustelua, 1,5 tuntia poikien keskustelua ja 1 tunti keskustelua, jossa kaikki ryhmän jäsenet olivat läsnä koko ryhmän kesken. Kukin keskustelu on tallennettu sekä ääni- että videonauhalle. Nauhoitukset on tehty maalis- ja toukokuussa 2010. Tutkielman kvantitatiivinen analyysi perustuu korvakuulolla tehtyihin mittauksiin ja niihin perustuviin absoluuttisiin frekvensseihin. Sekä diftongin reduktio että molemmat geminaatioilmiöt ovat ryhmän puhekielessä elinvoimaisia piirteitä, joskin diftongin reduktion kohdalla esiintyminen on labiilia. Etenkin yleisgeminaatio on ryhmän puhekielessä, myös idiolekteittain katsottuna, taajaan esiintyvä ja lähes varioimaton piirre: geminoituminen esiintyy täysgeminaattana lähes aina yleisgeminaation sallivissa konteksteissa. Geminoituminen on vahvempaa ensi- kuin jälkitavuissa. Sen sijaan sekä diftongin reduktio että itämurteiden erikoisgeminaatio varioivat ryhmän puhekielessä yleiskielisten ja eriasteisten murteellisten varianttien välillä. Suurin osa diftongeista, niin i-, u- kuin y-loppuisistakin, esiintyy yleiskielisessä muodossa ja redusoituessaan reduktion lievässä asteessa. Itämurteiden erikoisgeminaation mahdollistavissa konteksteissa yleiskielisiä variantteja on niin ikään murrevariantteja enemmän. Murrevarianttien enemmistö on täysgeminaatallisia. Tutkielmassa selviää lisäksi, että eri diftongien ja konsonanttien välillä on ryhmän puhekielessä eroja sekä piirteiden asteittaisessa että määrällisessä esiintymisessä, samoin kuin eri äänneympäristöissä esiintymisessäkin. Myös idiolektien välillä on eroja diftongin reduktion ja itämurteiden erikoisgeminaation esiintymisessä. Aineisto osoittaa, että sekä diftongin reduktion että itämurteiden erikoisgeminaation esiintymisessä on selviä leksikaalisia rajoitteita kielenoppaiden puheessa. Kun diftongi ai tai ei muodostaa lekseemin yksin (ai dialogipartikkelina ja ei kieltosanana), se on yleiskielinen. Diftongi äi puolestaan esiintyy poikkeuksellisen vahvana varianttina affektisissa yhteyksissä lekseemissä äiti. Affektisuus vaikuttaa liittyvän myös konsonanttiyhtymien lj, rp ja rv jälkikomponenttien geminoitumiseen vahvistavasti lekseemeissä kaljaa, turpaan ja hirvee. Tarkasteluun valittujen puhekielen piirteiden esiintymisessä voi havaita säännönmukaisuutta myös lauserakennetta ja kielenkäyttöä laajemmin tarkastelemalla. Referoinnin ja tarinankerronnan yhteydessä diftongin reduktion ja itämurteiden erikoisgeminaation käyttö yleistyy ja vahvistuu. Vahvistuminen on puhetilanteen ja keskusteluun osallistuvien vuorovaikutustehtävien motivoimaa. Tällöin on kyse selvästä murteella tyylittelystä. Itsekorjauksen ja liitepartikkelin -kO avulla muodostettujen kysymysten yhteydessä piirteet puolestaan esiintyvät aineistossa yleiskielisinä. Yleisgeminaatioon edellä mainitut eivät näytä vaikuttavan. Sukupuolten välillä on huomattavissa eroja tarkasteltujen kielenpiirteiden esiintymisessä ja käytössä. Tutkielma osoittaa, että pojat ovat tarkasteluun valittujen kielenpiirteiden valossa jonkin verran tyttöjä murteellisempia. Sukupuolten välisiä murteellisuuseroja voidaan selittää etenkin opiskelupaikkakunnan, koulutuksen, sosiaalisten kontaktien, kielenkäytön tapojen ja vuorovaikutustehtävien avulla. Tutkimus tarjoaa tietoa nykypuhesuomen variaatiosta kolmen puhekielen piirteen kautta. Työ jättää paljon tarkasteltavaa myös tämän tutkielman jälkeiselle tutkimukselle. Edelleen selvitettäväksi jäävät monet muut kielenpiirteet ryhmän puhekielessä. Erityisen mielenkiintoinen tutkimuskohde olisi persoonapronominien variaatio (minä ~ mä ~ mää). Luonnollinen jatke tutkielmalle olisi myös ryhmän reaaliaikainen seuraaminen valittujen kielenpiirteiden osalta.