Desorptioilmanpainefotoionisaatio- ja desorptiosähkösumutusionisaatio-massaspektrometria lipidien analytiikassa

Lipidit ovat rasvaliukoisia kudoksesta peräisin olevia yhdisteitä, joilla on monia eri fysiologisia tehtäviä. Lipidien analyysimenetelmien kehittämien on tärkeää, sillä niiden esiintymistä elimistössä voidaan käyttää biomarkkerina sairauksien diagnostiikassa ja apuna sairauksien kehittymismekanismien tutkimisessa. Lipideihin kuuluu polaarisuudeltaan ja rakenteeltaan hyvin erilaisia yhdisteitä. Niiden massaspektrometria-analytiikassa on aikaisemmin käytetty useita erilaisia ionisaatiomenetelmiä, jotka vaativat näytteen esikäsittelyn ennen analyysia. Desorptiosähkösumutusionisaatio-massaspektrometria (DESI-MS) ja desorptio-ilmanpainefotoionisaatio-massaspektrometria (DAPPI-MS) ovat uusia ionisaatio-menetelmiä, jotka mahdollistavat yhdisteiden analysoinnin suoraan eri matriiseista, kuten kudosnäytteistä, usein ilman esikäsittelyä. DESI-MS soveltuu parhaiten suhteellisen polaaristen yhdisteiden analytiikkaan, kun taas DAPPI:lla voidaan ionisoida myös poolittomia yhdisteitä. DESI-MS:lla on jo aikaisemmin analysoitu erilaisia lipidejä, kun taas DAPPI-MS:lla on aikaisemmin analysoitu vain steroideja. DAPPI- ja DESI-MS:lla tutkittiin erilaisten lipidien (fosfolipidit, triglyseridit, rasvahapot, rasvaliukoiset vitamiinit ja steroidit) ionisoitumista. Molemmilla menetelmillä optimoitiin standardiyhdisteille mittausolosuhteet. Lipidejä analysoitiin myös suoraan farmaseuttisista valmisteista. DAPPI:n ja DESI:n soveltuvuudessa erilaisten lipidien ionisoimiseen oli jonkin verran eroja. DAPPI toimi hyvin varsinkin poolittomampien lipidien, eli triglyseridien, steroidien, vitamiinien ja rasvahappojen ionisaatiossa, mutta huonosti hieman polaarisempien ja herkästi hajoavien fosfolipidien ionisaatiossa. Fosfolipidit fragmentoituivat DAPPI-ionisaatiossa, eikä moolimassatiedon sisältävää ionia saatu näkyviin. DESI puolestaan toimii hyvin fosfolipidien ionisoimisessa ja melko hyvin myös muiden tutkittavien lipidien ionisoimisessa, lukuunottamatta kaikkein poolittomimpia lipidejä. Uutta tietoa tutkimuksessa saatiin varsinkin DAPPI:n soveltuvuudesta erilaisten lipidien analytiikkaan. Tulosten perusteella voidaan sanoa, että DAPPI toimii yhtä hyvin tai jopa DESI:a paremmin useiden eri lipidien analytiikkassa. Menetelmää tulisi kuitenkin kehittää edelleen, jotta fosfolipidien, jotka ovat elimistön tärkeä lipidiryhmä, analysointi onnistuisi DAPPI:lla. Työssä ei analysoitu lipidejä suoraan kudosnäytteestä, joten DAPPI:n soveltuvuudesta lipidien analysointiin suoraan kudosnäytteistä ei voida tehdä johtopäätöksiä tämän työn perusteella.

Nephrin-associated molecules in human glomerular diseases

The glomerular epithelial cells and their intercellular junctions, termed slit diaphragms, are essential components of the filtration barrier in the kidney glomerulus. Nephrin is a transmembrane adhesion protein of the slit diaphragm and a signalling molecule regulating podocyte physiology. In congenital nephrotic syndrome of the Finnish type, mutation of nephrin leads to disruption of the permeability barrier and leakage of plasma proteins into the urine. This doctoral thesis hypothesises that novel nephrin-associated molecules are involved in the function of the filtration barrier in health and disease. Bioinformatics tools were utilized to identify novel nephrin-like molecules in genomic databases, and their distribution in the kidney and other tissues was investigated. Filtrin, a novel nephrin homologue, is expressed in the glomerular podocytes and, according to immunoelectron microscopy, localizes at the slit diaphragm. Interestingly, the nephrin and filtrin genes, NPHS1 and KIRREL2, locate in a head-to-head orientation on chromosome 19q13.12. Another nephrin-like molecule, Nphs1as was cloned in mouse, however, no expression was detected in the kidney but instead in the brain and lymphoid tissue. Notably, Nphs1as is transcribed from the nephrin locus in an antisense orientation. The glomerular mRNA and protein levels of filtrin were measured in kidney biopsies of patients with proteinuric diseases, and marked reduction of filtrin mRNA levels was detected in the proteinuric samples as compared to controls. In addition, altered distribution of filtrin in injured glomeruli was observed, with the most prominent decrease of the expression in focal segmental glomerulosclerosis. The role of the slit diaphragm-associated genes for the development of diabetic nephropathy was investigated by analysing single nucleotide polymorphisms. The genes encoding filtrin, densin-180, NEPH1, podocin, and alpha-actinin-4 were analysed, and polymorphisms at the alpha-actinin-4 gene were associated with diabetic nephropathy in a gender-dependent manner. Filtrin is a novel podocyte-expressed protein with localization at the slit diaphragm, and the downregulation of filtrin seems to be characteristic for human proteinuric diseases. In the context of the crucial role of nephrin for the glomerular filter, filtrin appears to be a potential candidate molecule for proteinuria. Although not expressed in the kidney, the nephrin antisense Nphs1as may regulate the expression of nephrin in extrarenal tissues. The genetic association analysis suggested that the alpha-actinin-4 gene, encoding an actin-filament cross-linking protein of the podocytes, may contribute to susceptibility for diabetic nephropathy.