Nephrin-associated molecules in human glomerular diseases

The glomerular epithelial cells and their intercellular junctions, termed slit diaphragms, are essential components of the filtration barrier in the kidney glomerulus. Nephrin is a transmembrane adhesion protein of the slit diaphragm and a signalling molecule regulating podocyte physiology. In congenital nephrotic syndrome of the Finnish type, mutation of nephrin leads to disruption of the permeability barrier and leakage of plasma proteins into the urine. This doctoral thesis hypothesises that novel nephrin-associated molecules are involved in the function of the filtration barrier in health and disease. Bioinformatics tools were utilized to identify novel nephrin-like molecules in genomic databases, and their distribution in the kidney and other tissues was investigated. Filtrin, a novel nephrin homologue, is expressed in the glomerular podocytes and, according to immunoelectron microscopy, localizes at the slit diaphragm. Interestingly, the nephrin and filtrin genes, NPHS1 and KIRREL2, locate in a head-to-head orientation on chromosome 19q13.12. Another nephrin-like molecule, Nphs1as was cloned in mouse, however, no expression was detected in the kidney but instead in the brain and lymphoid tissue. Notably, Nphs1as is transcribed from the nephrin locus in an antisense orientation. The glomerular mRNA and protein levels of filtrin were measured in kidney biopsies of patients with proteinuric diseases, and marked reduction of filtrin mRNA levels was detected in the proteinuric samples as compared to controls. In addition, altered distribution of filtrin in injured glomeruli was observed, with the most prominent decrease of the expression in focal segmental glomerulosclerosis. The role of the slit diaphragm-associated genes for the development of diabetic nephropathy was investigated by analysing single nucleotide polymorphisms. The genes encoding filtrin, densin-180, NEPH1, podocin, and alpha-actinin-4 were analysed, and polymorphisms at the alpha-actinin-4 gene were associated with diabetic nephropathy in a gender-dependent manner. Filtrin is a novel podocyte-expressed protein with localization at the slit diaphragm, and the downregulation of filtrin seems to be characteristic for human proteinuric diseases. In the context of the crucial role of nephrin for the glomerular filter, filtrin appears to be a potential candidate molecule for proteinuria. Although not expressed in the kidney, the nephrin antisense Nphs1as may regulate the expression of nephrin in extrarenal tissues. The genetic association analysis suggested that the alpha-actinin-4 gene, encoding an actin-filament cross-linking protein of the podocytes, may contribute to susceptibility for diabetic nephropathy.

Munuaisten tehtävänä on poistaa verestä haitallisia kuona-aineita ja erittää ne virtsaan. Noin neljäsosa ihmisen verimäärästä kulkee jatkuvasti munuaisten läpi. Virtsan muodostuminen alkaa munuaiskeräsissä alkuvirtsan suodattumisella verestä. Munuaiskeräset koostuvat keräsen kotelosta ja sen sisäpuolella olevasta hiussuonikeräsestä. Podosyytti on monihaarainen epiteelisolu, joka verhoaa munuaisen hiussuonikeräsiä, ja ainutlaatuinen soluliitos eli välihila liittää solujen haarautuneet jalkalisäkkeet toisiinsa. Välihilan rakenne ja koostumus molekyylitasolla on ollut pitkään tuntematon. Synnynnäinen nefroosi on vastasyntyneillä ilmenevä vakava perinnöllinen munuaissairaus. Vuonna 1998 suomalainen tutkimusryhmä paikansi synnynnäistä nefroosia aiheuttavan NPHS1-geenin, jonka tuottama proteiini nefriini paikannettiin myöhemmin podosyyttien välihilaan. Nämä havainnot muodostavat väitöskirjatyön lähtökohdan. Diabeteksen aiheuttama munuaistauti on Suomessa yleisin pysyvää munuaisten vajaatoimintaa aiheuttava tauti. Lisäksi erityyppiset munuaiskerästulehdukset voivat johtavaa munuaisen vajaatoimintaan. Munuaistautien syynmukainen lääkehoito on toistaiseksi harvoin mahdollista. Munuaisen suodatusmekanismin toiminnan tarkempi tuntemus onkin tärkeää, kun kehitetään uusia munuaissairauksien hoitomenetelmiä. Väitöskirjatutkimuksessa havaitsimme, että aikaisemmin tuntematon, nefriinin kaltainen proteiini filtriini ilmentyy munuaiskeräsissä ja paikantuu podosyyttien väliseen soluliitokseen. Lisäksi totesimme kliinistä aineistoa hyödyntämällä, että filtriinin määrä on vähentynyt munuaiskerästulehdusta ja diabeettista munuaistautia sairastavilla potilailla. On mahdollista, että filtriini on osana munuaistaudin patologisissa prosesseissa. Tässä työssä myös eristimme ja kuvailimme hiiren Nphs1-geenin vastakkaiselta eli antisense-juosteelta tuotettavan lähetti-RNA:n, jota ei kuitenkaan tuoteta munuaisissa, mutta molekyyli saattaa osallistua nefriinin säätelyyn muissa kudoksissa. Antisense-RNA:n löytyminen voikin auttaa nefriinin biologisen toiminnan ymmärtämisessä. Väitöskirjan viimeinen osatyö kuuluu suomalaiseen FinnDiane-tutkimukseen, ja työssä kartoitimme diabeteksen aiheuttaman munuaistaudin perinnöllisiä taustatekijöitä. Valitsimme ehdokasgeeneiksi podosyyttien välihilan toimintaan osallistuvia geenejä ja tutkimme geenivaihteluja tyypin 1 diabeetikoilla. Tutkimustulokset viittaavat siihen, että tietyt muutokset alfa-aktiini-4 geenissä saattavat altistaa diabeettisen munuaistaudin kehittymiselle. Jatkotutkimuksissa on syytä hienokartoittaa alfa-aktiini-4:n geenialuetta ja varmentaa havaittujen muutosten merkitys muissa potilasaineistoissa.