花冠衰老过程中生理生化变化的初步研究

对紫茉莉花（MirabiIis jalapa L.）衰老过程中，花冠鲜重的变化，总游离氨基酸含量，总蛋白质含量、可溶性蛋白质含量、R—S蛋白含公以及DNA含量、RNA含量和总游离核苷酸进行了测定;并对相对子这些变化的过氧化酶活性。水解酶活性诸如蛋白水解酶、DNA水解酶、RNA水解酶、酸性磷酸酶等的活性分别进行了检测。花冠在不同衰老时间可溶性蛋白质用SDS—PAGE分析进行了分离，过氧化物同工酶通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行了检测。此外，应用了组织化学、细胞化学方法对细胞结构及“核穿壁”现象进行了显微镜观察。 从实验结果可以看出紫茉莉花冠的迅速衰老不但表现为细胞结构的变化和“核穿璧”现象的出现，还有细胞组分如蛋白质、核酸和其它大分子物质的降解。可溶性蛋白SDS—PA GE分析的图谱显示出衰老过程中某些蛋白质谱带的变化。其中，大分子量蛋白质117.5KD、91.2KD、 77.6KD 68.7KD、 6 3, 8KD谱带依次性地随着衰老的进行而消失;新带47.6 KD、 40.0KD出现，且吸收增大。部分蛋白质谱带的消失和新带的出现以及各种蛋白质含量的变化，游离氨基酸含量和蛋白水解酶活性的变化表明蛋白水解酶参与了蛋白质的降解，但由于蛋白质在整个衰老过程中是被连续地合成和分解，因此所测的蛋白含量实际上是合成与分解的净差值。D N A 、RNA含量的降低和游离核苷酸的增加可能是由于DNA水解酶和RNA水解酶作用的结果，但也不排除核酸合成过程的参与。过氧化物酶活性和同工酶谱带的增加证实该酶在衰老过程中促进衰老的作用

采后果实衰老和冷害的机理及调控研究

衰老和冷害是果实采后极易发生的两种重要的生理性失调，严重影响了果实的商品质量和市场价值。本论文选用在采后贮藏期间容易衰老和出现冷害的枇杷、杧果和桃果实作为研究材料，比较深入系统地研究了这些果实采后衰老或冷害的机理和调控。主要的研究内容包括：（1）枇杷果实在不同贮藏条件下（低温、气调）的生理代谢、品质变化、衰老进程和贮藏性;（2）杧果果实采后生理特性及外源草酸和水杨酸处理对杧果冷害、品质和活性氧代谢的影响;（3）桃果实在低温贮藏下冷害发生特征，并从氧化还原平衡和蛋白质组表达方面探讨了桃果实采后冷害的发生机理。 试验结果表明：（1）与自发气调包装（MAP）相比，气调（CA, 10% O2＋1%CO2）能更有效的抑制枇杷果实的腐烂、延缓衰老、保持品质，以及控制多聚半乳糖醛酸酶（PG）和多酚氧化酶（PPO）的活性。枇杷果实在1 ºC气调下贮藏50天，腐烂指数低于7%，并保持固有的风味品质。短时间的高氧处理对果实腐烂和品质影响不大，促进了贮藏后期果实内乙醇的积累;（2）外源草酸和水杨酸处理显著减轻了杧果果实在贮藏期间的冷害程度，但对果实的硬度、可溶性固型物和可滴定酸含量影响不大。外源草酸和水杨酸提高了果实内抗坏血酸和谷胱甘肽的还原状态、提高了H2O2含量、降低了O2-含量和脂氧合酶活性，并提高了超氧化物岐化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、抗坏血酸氧化酶和谷胱甘肽还原酶的活性;（3）与非冷害桃果实相比，冷害桃果实呈现较低的H2O2含量、较高的膜透性、较高的酚类物质含量以及较高的抗坏血酸和谷胱甘肽还原状态。水杨酸对果实内H2O2含量、膜透性、酚类物质含量有显著的影响。冷害桃果实与非冷害桃果实的蛋白质表达也有明显的区别，32个差异表达蛋白依其功能分为8类，分别为能量产生、代谢、次生代谢、抗性、蛋白质的分布、基因转录、细胞结构和细胞生长。水杨酸对其中20个蛋白质的表达有显著影响。烯醇化酶、脂质运载蛋白、脱水蛋白、分支酸变位酶以及桂醇脱氢酶等与桃冷害发生有密切关系。 通过对上述结果的分析，得出如下结论：（1）与MAP相比，CA（10% O2 + 1% CO2）可显著延缓枇杷果实的衰老、腐烂和品质下降，CA延缓枇杷衰老的作用机理可能与其减轻果实内氧胁迫、降低PG和PPO活性有关;（2）用外源草酸或水杨酸处理杧果，可减轻贮藏期间果实的冷害程度，其调控机制可能与提高果实抗坏血酸和谷胱甘肽的还原状态、抑制O2－含量和提高H2O2含量有关;（3）在低温贮藏下，桃冷害发生与果实内较低的H2O2含量、生物膜完整性的破坏以及酚类物质含量增加密切相关，果实生物膜完整性的破坏与烯醇化酶、脂质运载蛋白、过敏蛋白以及脱水蛋白的下调表达有关，而酚类物质含量的增加与分支酸变位酶、桂醇脱氢酶的上调表达有关。

果实成熟衰老与抗病性的调控机制研究

　　果实为开花植物所特有的发育器官，在种子的成熟和传播过程中发挥着重要作用。同时，肉质果实中含有丰富的营养物质，包括纤维素、维生素、抗氧化剂等，成为人们饮食的重要组成部分。由于果实的成熟衰老和抗病性直接影响果品的质量和市场价值，因此，研究果实成熟衰老和抗病性的调控机制具有重要的理论意义和应用前景。本文主要利用蛋白质组学的方法，探讨外源化学物质抑制果实成熟衰老和诱导抗病性的调控机制。 1. 硅对果实的抗病性诱导：用硅酸钠（1%）处理采后的甜樱桃果实，再接种褐腐病原菌（Molinilia fracticola），置于20C下，观测贮藏期间果实的发病率，并分析硅处理后诱导的主要蛋白质及调控机制。研究结果表明：硅酸钠处理可显著抑制贮藏期间褐腐病的发生，其抑病机理与硅诱导PR-蛋白的表达，提高果实的抗氧化水平，减轻由病原菌侵染造成的氧化胁迫相关。同时，硅处理还能保护细胞骨架结构，有利于增强果实对病原菌入侵的抵抗力。 2. 水杨酸对果实的抗病性诱导：用水杨酸（SA，2mM）在果园处理三种成熟度的甜樱桃果实，然后接种青霉病原菌（Penicillium expansum）观察其发病情况，并取样分析参与抗病性应答的主要蛋白质及调控机制。试验结果表明：SA处理能显著降低青霉病的发病率和抑制病斑扩展，而且SA对低成熟度甜樱桃果实的抗性诱导效果更好。在八成熟的果实中，有5个热激蛋白和4个脱氢酶蛋白被SA诱导，这些蛋白参与了糖酵解和三羧酸循环。抗氧化蛋白和PR蛋白主要参与较低成熟度果实的抗性应答，而热激蛋白和脱氢酶在较高成熟度果实的抗性应答中更明显，SA诱导的抗性与代谢途径相关。 　　3. 草酸对果实的抗性诱导：用5mM的草酸处理冬枣果实后，接种青霉菌（P. expansum），观察果实发病情况，测定果实相关的生理指标，分析参与果实抗性应答的主要蛋白质及调控机制。结果表明：草酸能明显延缓冬枣果实的衰老，提高果实对青霉菌的抗性。草酸处理能抑制果实乙烯的释放量和呼吸强度，延缓叶绿素的降解，减少乙醇积累。利用蛋白质组学的研究方法证实了在25个参与了草酸处理应答的蛋白中，胱硫醚-β-合酶结构域包含蛋白（CBB domain-containing protein）和3个与光合作用相关蛋白[二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase activase, chloroplast precursor），二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亚基结合蛋白（RuBisCO large subunit-binding protein subunit beta, chloroplast precursor），植物光系统Ⅱ放氧复合蛋白2（PSII oxygen-evolving complex protein 2）]的表达量上调，乙醇脱氢酶的表达量出现下调。草酸处理还提高了与乙烯合成前体相关蛋白的表达，抑制了ACC合成酶的活性。草酸提高果实抗病的机制与延缓果实成熟衰老和保持果实抗性有关。 4. 果实衰老的调控机制：采用高氧（100%）和低氧（2-3%）处理苹果果实，观察果实衰老的进程，并基于蛋白质组学的研究方法，探讨苹果果实衰老与线粒体蛋白质组的关系。结果表明，在苹果衰老过程中有22个蛋白的表达量发生变化，这些蛋白主要参与了三羧酸循环，电子传递，碳代谢和胁迫应答。高氧处理能诱导氧化胁迫，加速了果实的衰老。质谱鉴定结果证明：在高氧胁迫下，超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，MnSOD）和线粒体外膜通道蛋白（porin) 的表达量降低，MnSOD的活性受到抑制，由此提高了线粒体中超氧阴离子的含量，增加了蛋白质的氧化损伤。 此外，高氧处理改变了porin的功能，导致了线粒体膜的透势发生变化，从而引起外膜损伤。由此阐明了活性氧在果实的成熟衰老调控中的重要作用。

超高产杂交稻Oryza sativa L.光合作用和光抑制特性的研究

较系统地比较研究了超高产杂交稻两优培九培矮64S 93-11和华安3号X07S 紫恢100与多年来大规模推广种植的杂交稻品种汕优63珍汕97A 明恢63的光合生理特性结果表明 1 从苗期到抽穗期超高产杂交稻两优培九和华安3号的净光合速率Pn都比汕优63高而在苗期的午间强光条件下和分蘖期的早晨以及抽穗期的早晚相对弱光条件下其Pn的差别尤为显著说明超高产杂交稻两优培九和华安3号不仅有较高的Pn和较强的抗光抑制能力而且还能充分利用早晨和傍晚较弱的光照条件有效地进行光合作用 2 超高产杂交稻剑叶具有较高的光合色素含量和Chla/b比值同时也具有较高的水分利用效率WUE较高的Chla/b比值表明超高产杂交稻剑叶能够更有效地利用太阳能而较高的WUE则有利于后期节约稻田用水 3 两优培九和华安3号类囊体膜的77K荧光光谱在不同发育时期均高于对照汕优63对其进行Gaussan分析发现这两个超高产杂交稻的反应中心以及天线复合物的发射峰均优于汕优63表明超高产杂交稻具有更强光能吸收能力并且能够将所吸收的光能高效地应用于光合电子传递 4 超高产杂交稻在苗期和分蘖期的净光合速率Pn都明显高于对照可以为群体的扩大后期的生长发育和高产奠定坚实的物质基础 5 三个杂交稻品种抽穗期剑叶的净光合速率相差不大但两优培九和华安3号具有较汕优63高得多的表观量子效率和羧化效率即超高产杂交稻能够高效地利用光能和田间二氧化碳首次提出对光能和二氧化碳的高效利用是两优培九和华安3号高产地重要原因 在对杂交稻净光合速率日变化的研究中发现超高产杂交稻两优培九和华安3号在午间强光条件下具有较对照汕优63更高的净光合速率表明超高产杂交稻具有更强的抗光抑制能力为了研究其光保护机理进一步研究了杂交稻对光抑制的响应结果表明 1超高产杂交稻两优培九和华安3号较对照品种汕优63具有更强的抗光抑制及光保护能力同时在光抑制结束后又能够更迅速地恢复光合功能较强的抗光抑制能力和较高的恢复能力可能是其高产的重要生理原因之一 2光抑制过程中超高产杂交稻叶黄素循环玉米黄素积累速率和积累量都明显高于对照并且在其后的恢复过程中其恢复速率和恢复程度也明显高于汕优63发现叶黄素循环的脱环化作用在光抑制处理30min时即基本接近最大值并未随着光抑制的进一步加重而不断上升认为叶黄素循环在杂交稻光保护中的重要作用可能在于玉米黄素的快速积累对光保护作用的启动 3在对自然条件下光抑制的研究中发现汕优63比超高产杂交稻两优培九和华安3号更容易受到午间光抑制的伤害 4午间光抑制条件下叶黄素循环的玉米黄素Z和环氧玉米黄素A大量积累而叶黄素循环库则没有什么变化认为是叶黄素循环脱环化组分A和Z的积累而不是叶黄素循环库对水稻在中午强光条件下的光保护起重要作用 5在所研究水稻品种的午间光抑制实验中叶绿素荧光的非光化学猝灭系数和叶黄素循环的脱环化状态DES之间没有正比例关系进一步推论环式电子传递可能在杂交稻的光保护中起重要作用 6对用不同试剂处理的杂交稻叶片进行光抑制处理研究发现ASAVDE酶底物其含量可以有效地调节活性处理对杂交稻的抗光抑制能力并没有带来多大改善而DTTVDE酶的特异抑制剂处理也没有使其光抑制大大加重而用DBMIB环式电子传递抑制剂处理则使杂交稻受到比对照强得多的光抑制对qN解析的结果发现强光下qE并未上升反而下降而qT却在光抑制条件下表现出上升现象这些实验结果首次阐明叶黄素循环的热耗散在杂交稻的光保护中不起关键作用而环式电子传递则对于杂交稻的光保护起至关重要的作用其机理可能在于强光条件下环式磷酸化的加剧生成大量ATP用于光破坏的修复作用同时避免类囊体膜的过度酸化从而导致强光下qN的下降这也是光抑制条件下qE下降和qT上升的原因所在此外在研究中发现光抑制处理导致Chla/b比值的上升并且提出这种上升的原因可能在于强光条件下光合系统对LHCII需求减少从而导致对Chlb需求减少最终使得部分Chlb向Chla转化这种转化可能是杂交稻在光抑制条件下的一种保护性响应 7对超高产杂交稻华安3号冠层不同衰老程度叶片的光合功能比较研究的结果表明剑叶的光合功能最强第二叶次之第三叶具有一定的光合功能第四和第五叶则相当衰老基本上丧失光合能力而光合机构的衰老可能始于反应中心的衰老天线系统的衰老要迟于反应中心的衰老叶片衰老进程中Chla和Chlb同步降解但是Chlb先还原为Chla导致Chla/b比值的上升并且认为衰老过程中的这种Chlb的还原是Chlb降解的一个早期的和不可避免的步骤

大田小麦旗叶衰老过程中的光合作用及其抗氧化代谢研究

小麦是我国的重要粮食作物，小麦籽粒产量的形成主要来自小麦旗叶的光合同化产物，但是，小麦籽粒的灌浆时期正好伴随着旗叶的衰老过程，因此，研究小麦旗叶在衰老期间的光合作用有着重要意义。同时，光合器官也是产生活性氧的重要部位，如何消除衰老叶片中的活性氧，保证衰老旗叶光合作用的进行也有着重要意义。本文对衰老旗叶在衰老过程中的光合作用和抗氧化代谢进行了较为全面的研究。结果如下： 1．在大田小麦衰老旗叶中叶绿素含量，光合速率和RuBPCase活性随着衰老的进程而逐渐降低。但是在衰老过程中光系统II最大光化学效率（Fv/Fm），实际光系统II量子效率，光化学焠灭以及开放的光系统II激发能的利用效率在衰老初期和中期几乎不变，而到衰老晚期急剧下降。非光化学焠灭在衰老初期和中期也是几乎没有明显变化，到衰老晚期迅速上升。光系统II捕光色素复合体在衰老叶片中的下降要慢于光系统II核心和光系统I的下降。这些结果说明衰老叶片中，光系统II在叶绿素含量和光合速率和RuBPCase活性降低的情况下依然保持着完整的功能，而实际光系统II量子效率的下降是由于光系统II反应中心的关闭和光能热耗散的提高引起的。 2．叶黄素循环库随着衰老进程逐渐增加，叶黄素循环的脱环氧化状态也是逐渐增加。由于叶黄素循环在光能热耗散中有着重要贡献，这表明在衰老叶片中光能热耗散的提高与叶黄素循环在衰老叶片中的提高有关。 3．在衰老过程中，小麦旗叶的MDA，抗坏血酸含量以及其与脱氢抗坏血酸比值逐渐增加，谷胱甘肽含量逐渐降低，这说明在衰老叶片中，主要是抗坏血酸作为活性氧清除剂。 4． 分别以不同单位表示抗氧化代谢中各种酶的活性，这些酶包括：脱氢抗坏血酸还原酶，单脱氢抗坏血酸还原酶，抗坏血酸过氧化酶，谷胱甘肽还原酶，过氧化氢酶和超氧化物岐化酶。结果表明：以每克鲜重为单位表示的酶活随着衰老逐渐降低，而以每毫克蛋白表示的酶活都随着衰老逐渐升高，表现趋势为衰老初期小幅度变化，衰老晚期大幅度变化。同时，测定结果表明小麦旗叶衰老过程中的蛋白含量降低。这些说明在衰老过程中抗氧化酶的降解速度可能慢于其他蛋白的降解速度，相对提高了消除活性氧的能力。 5．对大田小麦开花期，衰老中期，衰老晚期的旗叶光合作用日变化作了较为系统的研究。结果表明，在小麦旗叶衰老的三个时期，叶绿素含量和Chl a/b比值以及叶黄素循环库在一天中变化不明显。光合速率随着光强增大而提高，在中午表现出明显的光抑制。光系统II最大光化学效率，实际光系统II量子效率，光化学焠灭和开放的光系统II激发能的利用效率在中午强光下较明显的降低，非光化学焠灭在中午强光下升高。它们的变化幅度都是在开花期和衰老中期较小或者几乎没有变化，而在衰老晚期旗叶中变化幅度明显增大。叶黄素脱环氧化状态随一天中光强的增大而增大，且在衰老晚期叶片中变化幅度最大。这说明在强光条件下，衰老叶片中光系统II仍然维持着完整的功能，这种功能的维持可能与高光强下光系统II的关闭和叶黄素循环参与的光能热耗散的增加有关。 6．对开花期，衰老中期，衰老晚期的旗叶抗氧化物日变化的研究发现：抗坏血酸含量和ASC/DASC都是在衰老晚期中午强光条件下有较明显的升高，在早晨和傍晚弱光条件下其值较低。脱氢抗坏血酸含量和ASC+DASC含量在一天中未表现出明显的变化规律。GSH＋GSSG，GSH和GSH/GSSG有相似的变化规律，即在衰老的三个时期都表现出在一天的中午强光下的值比早晨和傍晚弱光条件下要高。GSSG在一天几乎不变。对开花期，衰老中期，衰老晚期旗叶的抗氧化酶日变化的研究发现：在开花期和衰老中期，DHAR活性一天中变化不大;在衰老晚期，其活性在中午强光条件下显著上升，而早晨和下午光强较弱的条件下，活性相对较低。ASPX, MDHAR, CAT和GR活性变化与DHAR类似。SOD活性在一天中变化不明显。结果表明，强光促进了抗氧化代谢中抗坏血酸的再生，特别在严重衰老叶片中与抗坏血酸再生有关的酶都在中午强光下有显著提高。严重衰老叶片中其他抗氧化酶在强光下，也表现出显著的提高，在衰老叶片中抗氧化系统提高了消除活性氧的能力，特别是在强光下，抗氧化系统有着重要的作用。

中国古牡丹资源调查及衰老相关研究

牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）是芍药科芍药属牡丹组植物，花大、色艳、型美、香郁、药用范围广、文化内涵丰富，被尊为“国色天香”、“花中之王”。我国植牡丹、赏牡丹有1600多年的历史，培育了许多价值高的品种，遗憾的是个别黄色、鲜红色、绿色等珍贵品种不断消失，而且现有的一些文化价值与观赏价值极高的古牡丹、著名的牡丹园的老牡丹均出现了衰弱现象，有的已奄奄一息。为了探索传统牡丹品种消失及牡丹衰老的原因，本研究在充分调查、整理国内品种资源的基础上，总结了牡丹品种的传承和消失情况，掌握了古牡丹的资源状况。通过连作土壤栽培试验证明了牡丹连作障碍的存在，并选定了生长在同一区域的5、10、15、20、25、30年生6个株龄的‘洛阳红（Luo Yang Hong）’为研究对象，从形态指标的调查、生理指标的测定、根际土壤及根系浸提液的化感成分分析三个方面着手，确定了牡丹开始衰老的时期;揭示了牡丹衰老机理;总结了古牡丹保留、复壮、养护办法;为牡丹专类园的管理及可持续性发展提供了理论和技术指导。本研究主要结果如下： 1、牡丹品种和古牡丹资源 通过对中国牡丹品种资源的文献查阅和实地考察，系统整理了我国不同时代的品种状况，调查结果表明：宋、元、明、清共有品种1109种，目前仅存143种，品种资源消失十分严重。收集整理了49处古牡丹资料，并据此绘制了我国目前古牡丹分布图;实地调查了17处24株古牡丹，详细介绍了部分品种的来历传说、生长状况和衰亡原因。5个优良传统品种在中国科学院植物研究所牡丹种质资源圃内得以保存，其中潞城古牡丹，植株最大（高2.3 m，冠径5.6 m），且生长旺盛;西溪牡丹属丰花品种，40年植株可开花811朵。 2、牡丹连作障碍 利用牡丹连作根际土壤及其浸出液栽培牡丹，结果表明，播种苗及分株苗的生长均受到了抑制;连作年限越久的处理抑制作用越强;根际土壤浸出液对牡丹生长的影响较大，对前期地下部和后期地上部都有很强的抑制作用，而且还抑制了上胚轴休眠的解除;根际土壤对后期株高和展叶幅的影响较大，对播种苗前期生根影响不大。牡丹存在连作障碍现象，连作障碍是牡丹衰弱的重要原因。 3、牡丹衰老时间及机理 通过对6 个株龄‘洛阳红’的形态、生理指标及根际土壤化感成分的比较得出，牡丹在同一地方大约栽植15 年后开始衰弱，20 年以内应该采取复壮措施。利用气相色谱—质谱联用技术（Gas Chromatograph-Mass Spectrometer, GC-MS）检测到根际土壤及根系浸提液中主要存在：烷烃、烯烃、芳香烃、醇、醚、酚醌、有机酸、醛、酮、酯、苯、胺等12 类有机物。对比分析得出有12 种物质可能是根系分泌物，根际土壤中可能具毒害作用的物质有40 种，栽植牡丹使土壤中增加的物质有24 种。 4、古牡丹复壮技术及应用 栽培基质中添加活性炭、沙子、麦饭石等均能有效的促进牡丹的生长，以活性炭的效果最好。对“汉牡丹”实施了综合复壮措施，效果明显。