低温胁迫下果实组织结构和生理变化及化学调控机理研究

低温贮藏是延缓园艺产品采后成熟、抑制病原菌生长和保持品质的常规方法。然而，许多园艺产品对低温(一般低于10 ºC~12 ºC)相当敏感，如果贮藏温度过低，就易产生冷害，降低其商业价值。所以研究采后园艺产品的冷害机制及如何提高其抗冷性是具有潜在经济价值的科学问题。水杨酸甲酯和茉莉酸甲酯是植物产生的信号物质，有研究表明这两种物质能够缓解低温贮藏下果实的冷害程度或提高果实的抗冷性，但是相关的作用机理并不清晰。本论文以芒果、桃和黄瓜为材料，研究水杨酸甲酯或茉莉酸甲酯处理的果实在冷害或非冷害贮藏条件下的抗氧化代谢、酚类物质代谢、细胞膜完整性以及细胞壁成分和结构等方面的变化，进一步证实了水杨酸甲酯和茉莉酸甲酯能够缓解果实的冷害，同时还探讨了提高抗冷性的机制。 　　本论文采用扫描电子显微镜研究果实表皮蜡层的变化，用光学显微镜、透射电子显微镜和傅里叶变换红外光谱仪研究果实细胞壁结构和成分的变化，用原子吸收分光光度计测定细胞壁钙离子的变化，用电导率仪检测果实细胞的完整性。同时测定了果实酚类物质含量、多酚氧化酶(EC 1.10.3.1)活性、过氧化物酶(EC 1.11.1.7)活性，并分析了果实硬度、糖和酸含量等品质指标。试验结果表明：适宜浓度的水杨酸甲酯和茉莉酸甲酯均能缓解果实的冷害症状，提高果实的抗冷性。其中，水杨酸甲酯处理能够改变果实表皮蜡层结构;降低表皮脂类物质和细胞壁酚类物质积累;抑制细胞壁纤维物质的降解，调节果胶物质的溶解，保护细胞壁结构。茉莉酸甲酯处理可以保护细胞膜的完整性;调节果实的酚类物质代谢，缓解果实的酶促褐变;抑制细胞壁果胶物质和纤维物质的降解，维持细胞壁结构和果实的硬度，有利于提高果实的抗冷性和缓解果实冷害。 　　虽然不同的果实表现的冷害症状不完全相同，但是低温胁迫对植物组织结构(膜系统和细胞壁结构)的破坏是造成果实冷害的根本原因。提高果实抗冷性的各种调节机制归根结底是通过保护细胞正常结构而发挥作用的。水杨酸甲酯与茉莉酸甲酯处理保护了果实的组织结构，缓解了低温胁迫对果实的伤害，提高了果实的抗冷性。然而，果实自身物质成分的差异是造成冷害症状表现不同的主要原因。 　　

雪莲细胞培养物中黄酮类物质代谢调控及其生物活性成份分析

水母雪莲（Saussurea medusa Maxim.）和新疆雪莲（Saussurea involucrata Karel. et Kir.）是我国珍稀的药用植物资源，具有清热解毒、止痉镇痛、敛伤、消肿及治疗热病、风湿等多种功效。雪莲的主要药用成份为紫丁香甙（Syringin）、芦丁(Rutin)、高车前素（Hispidulin）和Jaceosidin等苯基丙酸类（phenylpropanoid）和黄酮类（flavonoids）物质。最新的药理研究表明，上述物质还具有抗菌消炎、保肝降压、延缓衰老和抑制癌细胞增殖等重要的研发价值。 雪莲生境恶劣，生长缓慢，人工引种困难，加上长期掠夺性采挖，已使雪莲处于灭绝的边缘。为了保存国家珍稀植物品种，保护生态环境，满足临床上对雪莲药物的需求，本研究在雪莲组织培养的基础上，应用诱导子添加技术和毛状根培养技术对雪莲中具有重要药用价值的次生代谢物质进行调控，并对雪莲MYB类转录因子的功能进行了初步探索，为保护珍稀植物资源、维护生态环境、开发野生雪莲替代产品、缩短雪莲药用成份的生产周期奠定了基础。另外，分析了野生雪莲和雪莲培养物中主要生物活性成份的种类及含量，为今后雪莲药理药效研究及品质评价奠定了基础。 为了提高雪莲黄酮的产量，满足工业化生产的需要，在细胞培养水平上，通过添加茉莉酸甲酯（MJ），对雪莲黄酮类物质的代谢进行调控。研究了诱导子的添加时间、添加浓度对水母雪莲红色系悬浮细胞的生物量和总黄酮产量的影响。发现在细胞培养的指数期（第9天）添加5.0 µmol/L的MJ，可以使总黄酮产量提高2.4倍（1134.5 ± 63.86 mg/L），而雪莲细胞干重（dw）仅比对照提高23.8 %（20.4 ±0.27 g/L）。另外，细胞中苯丙氨酸裂解酶（PAL）的活性分析表明，MJ添加后PAL活性的增加与雪莲总黄酮含量增长之间存在相关性。 在器官培养水平上，对雪莲毛状根的诱导频率及其培养条件进行了研究。结果表明，选择发根农杆菌R1601侵染预培养2天的新疆雪莲根段外植体，毛状根的诱导效率可达到83 %。毛状根的冠瘿碱检测、PCR和Southern分析表明，Ri质粒中的T-DNA已整合到植物基因组中并稳定表达。以新疆雪莲毛状根为外植体，能够容易地获得再生芽。在含有1.0 mg/L 6-BA的MS固体培养基上，其再生频率高达91 ± 5.9 %，是其正常根的2.4倍。而水母雪莲在该培养条件下，仅有少量的畸形芽出现。进而对毛状根的培养条件进行初步研究，结果表明在无激素附加的MS液体培养基中，新疆雪莲的HR1601根系在一个培养周期内（32 天），其生物量能够达到接种量的16倍，而紫丁香甙含量（43.5 ± 1.13 mg/g dw）能够达到野生雪莲的83倍。从而显示了雪莲毛状根培养体系的优良特性。 在基因水平上，对雪莲黄酮类物质代谢调控的研究已经展开。玉米P基因编码的Myb类转录因子能够调节黄酮类物质代谢途径关键酶基因的表达。根据P基因的保守序列设计引物，从雪莲细胞培养物中获得了SmP基因。核酸序列分析表明，SmP基因与烟草中涉及苯丙素类物质代谢途径的LBM 1、LBM 3和MybAS 1基因具有较高的一致性，分别为66 %、60 %和61 %。因此为了研究雪莲SmP基因的功能，构建了正义表达载体，并与先前构建好的反义表达载体分别导入烟草，分析了转基因植株的形态特征及黄酮类物质的含量变化。其中，约有30 %转反义SmP基因的株系表现叶片皱缩、叶脉紊乱、主侧脉角度缩小、叶片、花瓣失去对称性以及花粉败育等性状。 另外，通过正交试验设计优化了雪莲提取工艺的条件，并对雪莲细胞提取物进行了分离纯化。正交试验设计结果表明，温度对雪莲黄酮提取效率的影响极为显著，而分批多次提取比一次性浸提，能够收到较好的提取效果。考虑到工业生产中的实际问题，推荐在60 ℃水浴条件下，采用50 %乙醇对雪莲样品连续浸提2次的方案。对雪莲提取物的纯化研究表明，雪莲成份复杂，仅依靠单一的分离手段，往往难以奏效。另外，野生雪莲及雪莲培养物中生物活性成份的比色法、HPLC（High Performance Liquid Chromatography）、LC-ESI-MS（Liquid Chromotagraphy Electrospray Ionization Mass Spectrometry）分析表明，传统的NaNO2-AlCl3 法测定雪莲总黄酮的含量，结果偏高，不利于雪莲黄酮的实验室研究分析与今后工业化生产的质量监控。而AlCl3 法的显色反应较为特异，今后有望取代NaNO2-AlCl3 法，作为雪莲类药材品质评价的标准。而HPLC-DAD结合LC-ESI-MS可以对雪莲中的主要生物活性成份进行较为准确的定性分析，从而解决了由于缺乏相应的雪莲化合物标准品而难以对雪莲中的成份进行定性定量分析及比较的难题。最后综合利用上述分析方法，对雪莲细胞培养物中的花素类物质进行了分析。结果表明，雪莲细胞中至少含有7种花色素类物质，分别为矢车菊素-3-O-葡萄糖甙及其衍生物、天竺葵素糖甙衍生物和芍药色素糖甙衍生物。

两种真核微藻逆境响应关键基因的调控机理研究

非生物逆境胁迫严重影响植物的生长发育和作物的产量。解析逆境下植物体基 因表达及信号传导网络调控机制对于阐明植物的适应性反应及培育耐逆性作物具有 重要理论和现实意义。 雨生红球藻（Haematoccoccus pluvialis）通过累积虾青素来适应胁迫环境，茉莉 酮酸甲酯（methyl jasmonate，MJ）和赤霉素（gibberellins，GA）对植物胁迫适应过 程中相关基因的诱导表达起到重要的调控作用。本文选取 H. pluvialis 作为出发株， 研究了 MJ 和 GA 对虾青素合成途径关键酶 β-胡萝卜素酮化酶基因的调控作用。 在其中一种 H. pluvialis 中克隆获得了三种不同的 β-胡萝卜素酮化酶基因。通过基 因组步移，获得了三种 β-胡萝卜素酮化酶的5’ 侧翼序列（5’-flanking region），其 中存在着多样的顺式作用元件，包括 MJ 和 GA 的顺式作用位点。进一步的实验 表明，MJ 和 GA 的诱导处理，可以促进 H. pluvialis 中虾青素的累积；同时，MJ 和 GA 调控了三种 β-胡萝卜素酮化酶基因的转录水平。 南极小球藻（Chlorella vulgaris NJ-7）可以在较大温度和盐度变化范围内存活， 是研究生物胁迫适应机理的理想模式生物。对数期的 C. vulgaris NJ-7 主要的脂肪酸

Instability of anthocyanin accumulation in Vitis vinifera L. var. Gamay Freaux suspension cultures

The inherent instability of metabolite production in plant cell culture-based bioprocessing is a major problem hindering its commercialization. To understand the extent and causes of this instability, this study was aimed at understanding the variability of anthocyanin accumulation during long-term subcultures, as well as within subculture batches, in Vitis vinifera cell cultures. Therefore, four cell line suspensions of Vitis vinitera L. var. Gamay Freaux, A, B, C and D, originated from the same callus by cell-aggregate cloning, were established with starting anthocyanin contents of 2.73 +/- 0.15, 1.45 +/- 0.04, 0.77 +/- 0.024 and 0.27 +/- 0.04 CV (Color Value)/g-FCW (fresh cell weight), respectively. During weekly subculturing of 33 batches over 8 months, the anthocyanin biosynthetic capacity was gradually lost at various rates, for all four cell lines, regardless of the significant difference in the starting anthocyanin content. Contrary to this general trend, a significant fluctuation in the anthocyanin content was observed, but with an irregular cyclic pattern. The variabilities in the anthocyanin content between the subcultures for the 33 batches, as represented by the variation coefficient (VC), were 58, 57, 54, and 84% for V vinifera cell lines A, B, C and D, respectively. Within one subculture, the VCs from 12 replicate flasks for each of 12 independent subcultures were averaged, and found to be 9.7%, ranging from 4 to 17%. High- and low-producing cell lines, VV05 and VV06, with 1.8-fold differences in their basal anthocyanin contents, exhibited different inducibilities to L-phenylalanine feeding, methyl jasmonate and light irradiation. The low-producing cell line, showed greater potential in enhanced the anthocyanin production.

Micromachining Of Passive Planar Micromixer On Poly (Methyl Methacrylate) Substrate With Excimer Laser Ablation

Excimer laser ablation technique was introduced into this work to fabricate a passive planar micromixer on the PMMA substrate. T-junction shaped and width-changed S-shaped microchannels were both designed in this micromixer to enhance mixing effect. The mixing experiment of distilled water and Rhodamine B with injection flow rate of 500 and 1,500 mu m/s validates the mixing effectivity of this micromixer, and indicates the feasibility of excimer laser ablation in the microfabrication of mu-TAS device.