玉米原生质体培养、超低温保存和组织培养的研究

本文叙述了两个玉米基因型（小八趟×水白和白17）原生质体培养的植株再生;用基因型（小八趟×水白）为材料研究影响玉米原生质体培养的各种因素，并此基因型的原生质体经超低温保存后获得植株再生;以及用多种基因型玉米幼胚为材料诱导愈伤组织与植株再生。 影响玉米原生质体游离、分裂与植株再生的因素是多方面的。酶液组合0.2% Onozuka RS + 1% Hemicellulase + 0.1% Pectolyase，利用继代8-16天的愈伤组织，所获原生质体的数量与质量最佳。在原生质体植板率方面，结果表明：N6作为基本培养基是理想的;氮源中，NO3-具有明显的促进作用，而NH4+具有明显的抑制作用;有机氮源是不能缺少的，所使用的四种有机氮源中L-脯氨酸效果最明显。2,4-D浓度以1.0 mg/l最佳。原生质体培养后的渗透压浓度降低的时间以培养四星期后为宜。利用三步诱导，成功地获得胚胎发生的植株再生，并且还指出原生质体起始材料的保存年限大大影响原生质体所再生愈伤组织的分化。 采用上述筛选出的最佳游离、培养以及植株再生的方法，成功地培养了基因型（白17）的原生质体，并获得植株再生。原生质体再生细胞培养4-5天后开始一次分裂;培养15天后，植板率为3-4%。一个月后，原生质体所再生的肉眼可见的愈伤组织，分步转至分化培养基。最后，愈伤组织通过胚胎发生获得植株再生，频率约10%。 玉米原生质体，利用5%DMSO与0.55 M葡萄糖作为混合保护剂，经慢速（1 ℃/分钟）降至－40 ℃，停留二小时后直接投入液氮保存。保存3天后，原生质体在40 ℃的温水浴中快速化冻，成活率高达30-40%。成活原生质体培养后生长正常，植板率高达8-10%。培养5-6星期后，再生愈伤组织转至分化培养基;最后获得植株再生，频率为5-10%。 本文最后叙述了玉米七种基因型的幼胚诱导获得愈伤组织，再生植株频率可达70-80%。 上述各方面的研究结果，对玉米的遗传操作和细胞抗寒性研究、生理代谢的研究等都是十分有价值的。

硬粒小麦（Triticum durum Desf.）单倍体诱导新技术单倍体原生质体植株的再生

硬粒小麦DR147授以超甜玉米(ss7700)的花粉后，83.4%的小麦柱头上的玉米花粉萌发，花粉管经由花柱抵达胚囊，受精率和成胚率分别为44.4%和42.6%。杂种合子核型高度不稳定，在细胞分裂过程中来自父本玉米的染色体逐渐被排除，最后形成硬粒小麦单倍体胚。尽管硬粒小麦×玉米存在较高频率的双受精(32.7%)，同时形成胚和胚乳，但由于胚乳发育异常及败育，最后难以获得有生活力的种子。 硬粒小麦授以玉米的花粉后用100ppm 2，4-D进行处理（浸蘸穗子或向穗茎节间注射），可以延长杂种胚在植株上的存活时间。授粉9-13天后将颖果表面灭菌后在实体显微镜下剥取不同发育时期的幼胚，分别接种于含或不含2.0mg／l2，4-D，3%蔗糖，200mg／l水解酪蛋白，146mgl谷氨酰氨，300mg／l天冬氨酸的MS固体培养基上进行胚拯救或诱导愈伤组织。结果表明，发育程度较高的胚（具盾片的胚，长度大于0.5mm）容易通过胚拯救获得单倍体植株或诱导出愈伤组织，而发育程序较低的胚（琏形胚，梨形胚，鱼雷形胚，长度小于0.3mm）不易获得单倍体植株或诱导愈伤组织而常常变褐，最后死亡。如果将这些胚预先接种子含0.1mg／l BAP，3%蔗糖，200mg/l水解酪蛋白，146mg/l谷氨酰胺，300mg/l天冬氮酸的MS固体培养基上预培养20天，再转移至愈伤组织诱导培养基上则易于产生愈伤组织，通过选择和继代培养可以获得淡黄色，结构致密的胚性愈伤组织。将这种愈伤组织转移至含1.Omg/l BAP和0.1mg/l NAA的MS固体分化培养基上培养20天后即可分化出小植株和绿色芽点，将这些小植株和绿色芽点再在分化培养基上继代培养20天，形成大量根系发达的健壮植株及次生小植株。其中一个胚性愈伤组织系的分化频率高达70. 6%。从获得的100余棵植株中随机取6棵再生植株进行根尖细胞染色体计数发现它们均为单倍体。具发达根系的健壮植株移入实验田后成活率可达80％以上，并生长至成熟。 利用硬粒小麦×玉米建立的单倍性胚性愈伤组织系进行了原生质体培养的研究。胚性愈伤组织经液体悬浮培养4个月后形成了生长迅速的由大小不同(0.5mm至5mm)的愈伤组织块组成的混合悬浮愈伤组织系，酶解试验表明2.0%纤维素酶RS和0.5%离析酶Y-23组合效果最好，而液体悬浮培养物和固体培养的愈伤组织（在酶解时用锋利的解剖刀片切成1mm左右的块）都能释放出大量原生质体，但悬浮培养物释放出的原生质体状态较好，胞质更浓厚，用KM8p培养基以琼脂糖包埋培养方式培养时得到了较高的（5%左右）分裂频率。 原生质体再生的小愈伤组织经增殖、筛选后可获得胚性愈性组织，将其转移至分化培养基Ⅰ（0.2mg/l 2，4-D，1.0mg/l BAP，0.1mg/l NAA，3%蔗糖，200mg/l水解酩蛋白，146mg／l谷氨酸胺，300m8/l天冬氨酸的MS固体培养基）和Ⅱ（不含2，4-D，其它成份同I）上进行分步分化培养可再生出完整植株，分化频率约为20%。从获得的22棵原生质体再生植株中，随机取4株进行根尖细胞染色体计数表明，它们均为单倍体。

玉米品种更替中光合效率与产量提高的生理生态机制

本文以我国不同年代推出的玉米品种为试验材料，深入研究玉米品种更替中产量提高和光合效率改良的演变特征及生理机制，以及环境胁迫影响各年代玉米品种光合效率及产量的生理机制，在此基础上分析光合改良与产量提高的关系。 对各年代玉米品种花后光合效率的变化及其与产量形成的关系的研究发现：虽然新品种的光合速率在开花前并不比老品种高，但是它们能够迅速扩大叶面积，形成较多的籽粒，为接下来的生长准备了比较大的源和库。花后茎秆的功能由‘库’转为了‘源’，即能够从茎秆中转移一些同化物到籽粒中。而且新品种能够在花后维持较高的光合速率，衰老较慢，光合有效期较长，这样就能够为籽粒灌浆提供较多的新同化产物。因此新品种具有很强的调节光合器官功能和优化分配同化产物的能力，能够使各部位叶片的光合生产，植株的生长和发育以及干物质的分配与再分配都有利于籽粒产量的形成。新品种在花后能够维持较高的光合活性主要是因为它们能够在老品种叶片可逆性衰老的时候维持较高的叶绿素含量和可溶性蛋白质含量，从而未像老品种那样进入不可逆转的衰老阶段。对各年代玉米品种光合特性日变化的研究也发现新品种的光化学效率比较高。老品种光合作用的午间降低是由严重的光抑制引起的。 对于N素缺乏和水分胁迫对各年代玉米品种产量及光合效率的影响机制的研究发现新品种一方面能够在胁迫条件下维持较高的光合速率，另一方面仍能维持较长的光合有效期。即新品种能够在胁迫条件下维持较高的光合生产能力，从而能够形成较大的生物产量和籽粒产量。新品种在缺N情况下能够保持较高的光合活性是因为它们能够维持较高的PEPCase活性、叶绿素含量和可溶性蛋白质含量，也就是说新品种能够在缺N情况下维持叶绿体结构组分的完整性和功能性，从而维持较高的光合效率。而玉米新品种在水分胁迫时能够保持较高的光合活性是因为它们能够在水分胁迫时维持较高的叶片水势，使光合器官的功能得到良好的保护，复水时光合也能够比较迅速和完全的恢复。

玉米高产优质生产中若干生理生态问题的研究

玉米（Zea mays L.）是我国十分重要粮食、饲料和工业原料作物，种植区域覆盖我国大部分农业区。随着玉米品种改良和新栽培技术的应用，我国玉米产量大幅度增加。自1950s以来，我国玉米产量递增幅度为126kg/hm2/yr。在玉米产量提高过程中，单叶光合作用与产量之间存在什么样的关系？当代玉米品种的品质和养分利用效率如何？高密度种植条件下是否存在“根系拥挤”及如何调控等。为探讨上述科学问题，本研究选择中国北方常见的大田玉米品种，在高肥力自然光照条件下，探讨玉米高产优质栽培过程中生理生态特征的变化趋势，以指导科学育种和栽培。主要研究结果如下： 　　1）光合与产量的演变我国 1950s、1970s、1990s等不同年代推广的玉米品种中，当代品种叶片光合速率高且高值持续期长，光合色素叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素等的含量高且持续时间长，与光合有关的蒸腾速率（E.）、细胞间隙CO2浓度（Ci.）、气孔导度（gs）等也有较大改良，中下部叶片尤其明显;在生育后期，当代品种具有更高的光合优势。老品种饱和光合速率(Psat)在灌浆期下降，并非RuBPCase 和PEPCase的活性降低，而是由于叶绿素含量和可溶性蛋白含量的降低。在花后期间，由于PS2功能的下降，造成了光合能力下降，而现代品种的PS2 功能在衰老前一致保持旺盛状态。 　　老品种光合特征对缺氮的反应表现更敏感。花后缺氮光合作用下降是非气孔限制的，因为气孔导度和胞间CO2浓度没有发生明显的变化。其主要原因是缺素造成老品种叶片早衰，叶绿素含量、可溶性蛋白含量、PEP羧化酶活性下降。现代品种表现较强的抗衰老能力，其N素利用效用高于老品种。我国玉米产量的大幅度提高在很大程度上应归功于叶片光合性能的改良。 　　随玉米品种更替，群体光合速率增强，群体光合衰减率降低，呼吸消耗所占总光合的百分率下降。灌浆期当代品种中下部叶片的群体光合速率明显高于老品种。种植密度是影响玉米群体光合速率的主要因素，在高中低三种密度条件下，当代品种均有较高的群体光合速率，表现出耐密性强、适应性广、源足库大、产量高的特点。 　　2）高油玉米的产量受到叶源大小和叶源活力的双重限制在 1.5 株/m2密度下，与普通玉米相比较，高油玉米单株籽粒产量显著低于普通玉米，产量构成中穗粒数差异不显著，千粒重较低（P＜0.01）;两类型玉米的单株库容量相当，高油玉米籽粒灌浆速率小，籽粒充实度低，单粒重对叶源相对减少（剪叶）或相对增多（疏库）的反应比普通玉米更为敏感，其产量受到同化产物供应（叶源）相对不足的限制。高油玉米授粉后的叶面积、叶面积持续期小，叶片含氮量和光合速率较低，说明高油玉米的产量受到叶源活力（光合速率）小和叶源数量少的双重限制。 　　3）我国北方玉米品种的个体产量潜力、氮素利用效率及籽粒与秸秆粗蛋白质含量在充分发挥个体生产潜力的低密度条件下，我国北方1990s 以来大面积种植的50个玉米主栽品种中，个体产量潜力和氮素利用效率高度正相关(P=0.01)，而子粒千粒重与NUE 呈显著性负相关(P=0.002)。对玉米产量和氮素利用效率进行分层聚类，可将北方玉米品种划分为高产高NUE 型、低产低NUE 型和中间型，高产高NUE 型玉米品种相对较少，仅占24%。籽粒粗蛋白质含量（CPC）与秸秆CPC 相关性不显著（P＞0.05）。对籽粒和秸秆的CPC 进行分层聚类，将北方玉米品种划分为籽粒高秸秆低型、籽粒与秸秆双低型和籽粒与秸秆双高型，CPC 双高型品种相对较少，仅占20%。 　　4）玉米根系拥挤效应对产量影响的生理生态机制及其调控随玉米品种更替根系的空间分布呈“横向紧缩，纵向延伸”的特点。当代三类型玉米根系分布特性与株型、穗型相关。紧凑型品种根系分布深，下层根系所占比率大，适合密植，群体产量潜力大;平展大穗型品种根量多，分布较浅，在低密度下可获得较高的个体生产力，但不适合密植，群体产量潜力小。 　　“根系拥挤”显著影响玉米产量，减小根系横向伸展空间，下层土壤中的根系分配比率增多。在地上部充分生长条件下，紧凑型品种横向空间为30-50cm即可满足要求，平展型品种大于50cm;紧凑型品种对纵向空间受限制的反应更为敏感，平展型品种对横向空间受限制的反应更为敏感。“根系拥挤”影响根系活性、分布、氮素吸收利用和花后光合与14C同化物的分配。 　　在根系受限制条件下，增施肥料产量提高，根系总重增加，增加了根系在深层土壤（60-100cm）中的根系比率，显著增加了根系的TTC 还原量、SOD、CAT、POD活性。土壤加沙，根量减少，但根系TTC 还原量增加、产量提高，提高幅度以大穗型品种更为显著。 　　随种植密度增加耕层根系密度与群体产量同步增大，各类品种均在最高根系密度下获得最高产量。根系负荷的籽粒产量潜力三类型品种存在极大差异，在一定范围内增大种植密度，根系伸展空间减小，群体产量提高，紧凑大穗型品种产量最高，品种的耐密性是限制根系负荷籽粒产量潜力的主导因素。因此，培育株型紧凑、耐密性强、大穗玉米良种，采取有效的调控措施是玉米进一步高产的主攻方向。 　　5）我国夏玉米高产田的培创理论研究与实践相结合，2005 年在我国华北地区的山东莱州培创出籽粒实产21 042.9kg/hm2 （ 14% 含水量， 实收面积=45.7m×15.9m=726.63m2）的夏玉米高产纪录。主要采用以增加密度为保障的“群体结构性挖潜”和以提高整齐度为保障的“个体功能性挖潜”途径，生理生态指标包括：选用紧凑抗倒耐密植品种DH3719，种植密度102 030 株/hm2，收获密度98 610 株/hm2，花后具有较长的叶面积高值持续期，达60d以上，叶面积指数最大为6.53，收获2.59。上部叶片光合值对外界光强度变化敏感，其光合峰值出现时间提前，而后迅速衰减;中部叶片光合值的降低较慢，下部叶片变幅最小，可能是长期处于争光环境表现出的生态适应性。粒叶比0.32，经济系数0.542，单株产量216g，千粒重375.1g。

夏玉米不同生育期对干旱胁迫的响应与适应机制

干旱化问题将在全球环境变化下进一步加剧，并可能严重影响玉米。玉米是我国主要粮食和最重要的饲料作物，其重要性日益突出。水分是制约玉米产量的关键因子。为此，本研究利用大型活动遮雨棚对玉米进行了出苗后全程水分控制试验，研究大田条件下玉米不同生育期对不同土壤水分（包括水分充足well-watered, WW;适度干旱moderately stressed,MS;和严重干旱severely stressed,SS）的响应及适应机制。研究结果表明： 在吐丝和籽粒形成期，Ms对叶片相对含水量和相对电导率的影响没有达到显著或极显著水平，而SS则极其显著地降低叶片相对含水量和增加质膜透性。并且干旱胁迫下，夏玉米生育进程中保护酶SOD、POD和CAT活性基本呈现一致下降的态势，膜脂过氧化作用增强。短期干旱胁迫对SOD）和POD（在第十三叶期）保护酶有一定的激发效应，但此效应维持不长，其后骤降。 干旱会引起叶绿素a，b含量及总叶绿素含量的减少。MS下营养阶段的叶绿素含量没有明显变化，但随着MS的延续，叶绿素含量在生殖阶段显著降低。而SS的叶绿素含量最初就呈现降低并逐渐扩大。另外，在干旱胁迫下叶净光合速率(PN)和蒸腾速率(E)的降低因干旱强度和时间以及发育阶段而异，而且Ss所引起的不利影响更为凸现。SS显著降低营养和生殖阶段的水分利用效率( WUE)，然而MS基本导致前中期WUE增加，后期则减少。 土壤干旱胁迫下，绿色LAI明显降低，特别是生殖时期最高穗位叶面积显著降低：地上部生物量积累在各生育期均为减少。而且，干旱显著减少各生育期的根干重，但MS对第十八叶期(V18)的根干重有短期的促进作用。干旱胁迫下，根冠比在不同生育时期有增有减。MS对第十七叶期(V17)的叶面积、抽雄吐丝出现、叶片展开、最终叶片数以及收获指数影响不大，但其却显著减少各阶段株高、叶面积（第十七叶期除外）、茎粗和生物量积累。随着MS的延续，产量性状诸如穗粒数、百粒重均为降低，而SS对各生育阶段所有生长特性、产量性状及收获指数的影响都较MS更为不利。 生育前期遭遇干旱，可使叶片展开明显迟缓，并且最终叶片数减少。尤其SS减少最终叶片数1～2片，并且延迟抽雄4—5 d，吐丝4—5 d，从而可能导致成熟期推迟。 植物器官的营养吸收动态在短期干旱作用和长期作用之间有所不同。而且P和K元素的积累方式也有别。基本上，干旱胁迫显著降低植物器官在不同生育期的全P和K元素的吸收，尽管后期一些器官诸如叶、鞘和茎等的吸收有所增加，特别是干旱严重影响了根的吸收能力，而且SS较MS对全P.K吸收影响更甚。总之，干旱所导致的生物量减少与植物器官的全P、K吸收的减少是相伴而生的。 与WW相比较，MS和SS的产量两年内分别降低了20,4%—26,1%和59.2%～84.5%，穗粒数分别降低了12.1%～19.7%和39,8%～88.1%，以及百粒重分别降低了2.1%~2.7%和17.7%—46,9%。研究进一步表明，干旱胁迫对多数玉米籽粒的营养品质有利。与WW相较而言，N含量、可溶性总糖、可溶性还原糖、Zn. Ca. Cu. Mg和Mn元素在MS下分别提高了5.9%，39-0%，97.5%，12.1%，4.4%，7.5%，6.1%和2.9%，而在SS下则分别提高了8.6%，99.3%，300.0%，27.8%，24.0%，1 5.3%，9.8%和7.9%。但是，一些玉米籽粒的营养品质诸如淀粉、P和K含量却受到干旱胁迫的不利影响，与WW相比较，MS使籽粒淀粉、P和K含量分别降低了8.3%．12.6%和3.7%，而SS则分别降低了33.3%, 14.6%和18.6%。粗脂肪含量则表现有所不同，与WW比较而言，MS对之有利，2年平均增加9.2%，而SS对之不利，2年平均减少11.3%。 总之，玉米生理生态特征、地上部各部分干物质生产、根系生长、营养吸收、产量性状、营养品质对干旱胁迫的响应和适应不仅依赖于干旱的严重程度（包括强度和时间），而且也依赖于玉米发育阶段。本研究认为，在半湿润地区水分缺乏的条件下，有限灌溉（最低土壤相对含水量55%士5%）在营养阶段抽雄前实施可行。

玉米新老品种生理生态特征与竞争力差异研究

本文以中国不同年代主要的玉米品种为试验材料，深入研究了玉米品种更替过程中新老品种的生理生态特征和竞争力差异，分析了差异形成的原因并进行了理论探讨。 玉米新老品种竞争力差异的研究采用了单作和混作两种方式，设高低两个密度。生长过程中全面测量了生物量、形态、生理和群体指标，运用了生长分析的方法来研究竞争，整合了各水平参数来解释竞争结果，并用本研究数据检验了生长冗余理论。 玉米新老品种对比研究发现新品种的生理生态特征普遍优于老品种。这些优势不仅体现在较高的生物量积累、较大的籽粒库容和较强的再分配能力上，而且体现在高的叶面积指数、衰老过程中仍维持较高的叶绿素含量、可溶性蛋白含量和光合效率上，同时新品种的群体特性还具有更低的感病率和更少的无效分蘖。玉米新老品种竞争结果表明在混作条件下，相对总产量这一指标反映出新老品种间明显的互利效应，且这种效应随发育阶段而降低。新品种对老品种的相对竞争力则随着发育阶段波动，并且密度和发育阶段两因子对品种竞争力的影响有明显的相互作用。相对于新品种，老品种的确存在叶片和根系的生长冗余部分，但老品种并没有在混作竞争中获得明显的竞争优势，即玉米品种选育并不完全符合生长冗余理论，因此在理解植物竞争力方面仍需要其他层面更深入的探讨。 同时，玉米品种选育不完全符合生长冗余理论的结论在农学实践上并非毫无价值。因为新品种总生物量的提高，不仅增加了籽粒产量，而且增加了秸秆产量，提供了更多可利用的生物质资源。相对于仅仅关注粮食产量，综合利用中国农村巨大的生物质资源具有更重要的生态意义。

一氧化氮（NO）在硝酸盐调节玉米根伸长中的作用

植物根系大小和形态是决定植物吸氮能力的重要因素，而植物根系生长发育与土壤中营养元素的分布及其有效性密切相关，尤其是硝酸盐。然而目前关于硝酸盐调节植物根系生长的生理机制仍不清楚。一氧化氮（NO）是一种重要的气体信号分子，参与植物体内多种生理生化过程，包括调节根的生长发育。本研究以玉米自交系478为材料，采用营养液培养法，探讨了NO在硝酸盐调节玉米根系生长中的作用。主要结果和结论如下： 玉米幼苗在不同硝酸盐水平下生长7天后，主根伸长随着硝酸盐浓度的升高而下降;与0.01 mM硝酸盐处理下的玉米主根伸长相比，0.1 mM和1 mM硝酸盐处理对玉米主根伸长分别抑制了30%和36%。随着硝酸盐浓度的增加，玉米主根根尖过氧化氢（H2O2）含量表现出降低的趋势，而抗氧化酶，如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）的活性则表现出增加的趋势。外源供应过氧化氢对低浓度硝酸盐（0.01 mM）和高浓度硝酸盐（10 mM）处理下的玉米根伸长都没有影响，这表明了根尖过氧化氢含量的下降不是高浓度硝酸盐抑制玉米主根伸长的原因。 NO供体硝普钠（SNP）能够缓解高浓度硝酸盐对玉米主根伸长的抑制，而对低浓度硝酸盐处理下的主根伸长没有影响，而且NO清除剂亚甲基兰（MB）和NO合成酶抑制剂Nω-硝基-L-精氨酸（L-NNA）显著抑制了低浓度硝酸盐处理下的玉米主根伸长，而对高浓度硝酸盐处理下的玉米主根伸长没有影响。用NO特异性荧光染料4,5-二氨基乙酰乙酸荧光素(DAF-2DA)检测结果表明：高浓度硝酸盐显著降低玉米根尖NO含量。而玉米根中的硝酸还原酶活性随硝酸盐浓度的增加而增加。以上结果说明，高浓度硝酸盐抑制玉米主根伸长可能是与根尖NO合成酶的下调所导致的内源NO含量的降低有关。 另外，外源生长素（IAA）能缓解高浓度硝酸盐对玉米主根伸长的抑制，同时，也增加了高浓度硝酸盐处理下玉米根中内源NO含量，而对低浓度硝酸盐处理下的玉米根中内源NO没有影响。因此推测，根尖生长素的下降导致内源NO含量的降低可能是高浓度硝酸盐抑制玉米主根伸长的原因。