饲养层FGF2表达量对猕猴胚胎干细胞自我更新及多能性的影响

用转基因和RNA干扰(RNAi)法建立5组不同成纤维细胞生长因子-2(fibroblast growth factor-2,FGF2)表达量的猕猴耳部皮肤成纤维细胞(MESF)系:过表达FGF2组(f1),过表达的阴性对照组(f2),FGF2 RNA干扰组(f3),RNA干扰的阴性对照组(f4)和未作任何处理的对照组(f5).5组MESF的FGF2表达量相对值为f1:f2:f3:f4:f5=4:2:1:2:2;c-fos,TGF-β1,INHBA,Gremlinl在f1中表达量上升,在f3中表达量下降;BMP4,TGF-β2在f1中表达量下降,在f3中表达量上升;表明内源FGF2能够作用于MESF的TGF-β信号通路,引起相关基因表达量的变化.用这砦细胞作为饲养层长期培养(10代)猕猴胚胎干细胞(RhESC),结果在f1上培养的RhESC增殖速度都比对照组快,并且c-fos,TGF-β1,INHBA,Gremlinl,Oct-4,Nanog,Sox2表达量均上升,BMP4表达下调;在f3上培养的RhESC增殖较慢,BMP4表达上调,c-fos,TGF-β1,INHBA,Gremlinl,Oct-4,Nanog,Sox2表达下调.5组MESF上培养的RhESC形成的EB均表达各胚层早期标记基因(marker),说明RhESC的多能性没有受到影响,但表达量有差异,f1上RhESC形成的EB所有marker都低表达.结果表明饲养层的FGF2含量不仅影响自身相关基凶的表达,还对RhESC的自我更新有一定的作用.

1.55 mu m Ge islands resonant-cavity-enhanced detector with high-reflectivity bottom mirror

A 1.55 mum Ge islands resonant-cavity-enhanced (RCE) detector with high-reflectivity bottom mirror was fabricated by a simple method. The bottom mirror was deposited in the hole formed by anisotropically etching in a basic solution from the back side of the sample with the buried SiO2 layer in silicon-on-insulator substrate as the etch-stop layer. Reflectivity spectrum indicates that the mirror deposited in the hole has a reflectivity as high as 99% in the range of 1.2-1.65 mum. The peak responsivity of the RCE detector at 1543.8 nm is 0.028 mA/W and a full width at half maximum of 5 nm is obtained. Compared with the conventional p-i-n photodetector, the responsivity of RCE detector has a nearly threefold enhancement. (C) 2004 American Institute of Physics.

Quantum-confined Stark effect and built-in dipole moment in self-assembled InAs/GaAs quantum dots

Quantum-confined Stark effect and built-in dipole moment in self-assembled InAs/GaAs quantum dots (QDs), which are grown at relative low temperature (460degreesC) and embedded in GaAs p-i-n structure, have been studied by dc-biased electroreflectance. Franz-Keldysh oscillations from the undoped GaAs layer are used to determine the electric field under various bias voltages. Stark shift of -34 meV for the ground-state interband transition of the QDs is observed when the electric field increases from 105 to 308 kV/cm. The separation of the electron and hole states in the growth direction of 0.4 nm, corresponding to the built-in dipole moment of 6.4x10(-29) C m, is determined. It is found that the electron state lies above that of the hole, which is the same as that predicted by theoretical calculations for ideal pyramidal InAs QDs. (C) 2004 American Institute of Physics.

不同FGF-2表达量的饲养层对猕猴和兔胚胎干细胞的增殖和自我更新的影响

胚胎干细胞（ESC）培养是ESC研究的基础，饲养层的选择是ESC培养的一个重要方面。本实验曾对不同的猕猴饲养层进行研究，显示能够更好的支持猕猴ESC生长的饲养层FGF-2表达量也较高。FGF-2，又名bFGF（碱性成纤维生长因子），是ESC生长所需的重要因子，但其中的分子机制现在并未完全了解。本文一方面对ESC相关研究进展进行了综述，另一方面对以下内容进行了研究：用转基因和RNA干（RNAi）扰的方法建立不同FGF-2的表达量猕猴耳部皮肤细胞（MESF）系五组：过表达FGF-2（f1），过表达的阴性对照组（f2），FGF-2 RNA干扰组（f3），RNA干扰的阴性对照组（f4）以及未作任何处理的对照组（f5），这五组MESF的FGF-2表达量相对值为f1：f2：f3：f4：f5＝4：2：1：2：2；c-fos，TGF-β1，INHBA，Gremlin1在f1中表达量上升，在f3中表达量下降；BMP4，TGF-β2在f1中表达量下降，在f3中表达量上升；表明内源FGF-2能够作用于MESF的TGF-β信号通路，引起相关基因表达量的变化。用这些细胞作为饲养层分别培养两种ESC（猕猴ESC，R366. 4和兔ESC，RFESC） ，连续培养了10代，其中在f1上培养的两种ESC增殖速度都比对照组快，并且c-fos，TGF-β1，INHBA，Gremlin1，OCT-4，Nanog，Sox2表达量均上升，BMP4表达下调；在f3上培养的猕猴ESC增殖较慢，BMP4表达上调，c-fos，TGF-β1，INHBA，Gremlin1，OCT-4，Nanog，Sox2表达下调；f3上的兔ESC没有变化。表明ESC中的TGF-β信号通路也受到调节。五组猕猴和兔的ESC形成的EB均表达各胚层早期标记基因(marker)，但表达量有差异，f1上ESC形成的EB所有marker都低表达。实验结果表明饲养层中的FGF-2含量高低不仅影响自身相关基因的表达，还对ESC的增殖和维持自我更新有一定的作用。

兔胚胎干细胞分离建系及鉴定以及胚胎干细胞自我更新机制研究

人胚胎干细胞（ESC）的成功分离培养，吸引大批人对干细胞生物学的关注，特 别是ESC 在再生医学及人类早期胚胎发育研究的潜在价值。然而在人ESC 临床应用 之前需要找到合适的动物模型进行大量的预实验研究，从而评价其应用的安全性、有 效性及存活效率。因此，从其它物种建立稳定而可用的ESC 系也是必不可少的。ESC 能无限地自我更新并保持多潜能性，但控制其自我更新的分子机制现在仍然知之甚少 且物种间存在差异，了解ESC 的自我更新有利于提高建系率、改善培养体系及定向 分化体系。本文一方面对ESC 分离培养及自我更新机制的研究进展进行了综述，另 一方面对以下几个方面的内容进行了研究：1）建立了4 株稳定的兔ESC 系，能在体 外进行长期的培养并保持ESC 的多潜能Markers 及正常的XY 或XX 核型，具有碱性 磷酸酶活性、表达Oct-4、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60 及TRA-1-81。与人 和小鼠ESC 相似，兔ESC 表达多潜能基因（Oct-4、Nanog、Sox-2 及UTF-1），并表 达了与ESC 自我更新相关的信号通路（FGF、TGFβ及WNT）的许多基因。从形态 来说，兔ESC 与灵长类ESC 相似，但兔ESC 具有较快的增殖能力，与小鼠ESC 相类 似。在体外及体内兔ESC 均能分化成代表原始三胚层的各种细胞类型及组织。2) 从 受体抑制实验及生长因子的联合加入可以得出结论FGF 及TGF 信号通路对维持兔 ESC 的多潜能性发挥着重要的作用，这样的结果与人ESC 相类似。也表明FGF、TGF β及WNT 信号通路在兔ESC 的自我更新中都起着作用，而且他们之间可能形成了信 号调控网络，相互之间有着正负反馈作用。FGF2+Activin A 或TGFβ1+Noggin 的无 饲养层无血清培养体系不仅能显著抑制兔ESC 的分化，且能维持其长期的自我更新。 但与小鼠不同，TGFβ信号通路能影响其增殖能力，而对其多潜能性的维持并没有作 用。这就更说明了兔比小鼠更适宜成为人类疾病临床治疗之前的模型动物。3）四种 猕猴细胞系（MOF、MESF、MFG 和CMESF）可作为饲养层比MEFs（小鼠饲养层 细胞）更好或同等好支持猕猴ESC 的生长，保持其自我更新能力和分化的多能性。 而卵泡颗粒上皮样细胞（MFGE）不能支持猕猴ESC 的自我更新。进一步的研究表明 饲养层支持ESC 生长能力的差异可能是由于基因表达种类以及表达量上的差异而导 致的。

人胚胎干细胞建系及向神经细胞定向分化的研究

研究和利用人胚胎干细胞(hES)细胞已成为生命科学领域的核心问题之一。当前hES 细胞研究主要集中在hES 的建系和维持其不分化状态；提高hES 细胞定向分化为特定 细胞的比例；ES 细胞自我更新和分化的机制等方面。本论文一方面概述了hES 细胞相 关领域的研究进展；另一方面建立了不同培养体系条件下3 株hES 细胞，并在此基础 上利用G5 和肝生长因子（HGF）诱导hES 细胞定向分化成高纯度的NPs。主要结论如 下：1) 建立人卵体外受精和胚胎培养体系。获得了15 个囊胚，采用了免疫外科法分离 内细胞团，运用含血清以及不含血清的培养体系，在ICR 小鼠胚胎成纤维饲养层上分 别建立了YKh-1、YKh-2 和YKh-3 3 株人胚胎干细胞系，生长良好，核型正常。ES 细 胞表达碱性磷酸酶活性、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81 和Oct-4，但不表达 SSEA-1； ES 细胞在体外能够分化为属于外胚层、中胚层和内胚层的各种分化细胞， 在SCID 小鼠体内能形成畸胎瘤，畸胎瘤包括了所有三个胚层来源的细胞类型。证实了 ES 细胞系的多向分化潜能。2) 对比含血清以及无血清的培养体系的hES 细胞系的特征， 观察了其集落形态、生长速度、分化能力。结果表明，在含血清培养体系的Yhk-2，其 集落形态较致密，含2-3 个核的细胞较多，细胞倍增时间为43.9±5.7h；而在无血清培 养体系的Yhk-3，其集落形态较铺展，细胞较小而圆，倍增时间为34.8±3.8h。细胞免疫 染色和PCR 结果表明，二者在体外都能分化为三个胚层来源的多种细胞，但比例有所 差异。提示二者在向三个胚层来源的细胞的分化能力上有所不同。 3) 以所建立的hES 细胞系为模型，采用HGF 和G5 作为诱导因子添加到神经诱导培养基中，诱导hES 细 胞分化成高纯度的NPs。单独的HGF 或G5 仅能诱导ES 细胞分化成70.9± 5.0%和 72.9±7.2%NPs，而联用HGF 和G5 使NPs 的比率达到91.2±11.2%，进一步纯化后获得 98±3.2%的NPs。获得的NPs 能分化成三个谱系神经细胞，亚克隆实验也进一步证明采 用HGF+G5 获得的单个NPs 具有神经干细胞的特性，也能在体外分化成三个谱系的神 经细胞。用SHH 处理NPs，获得的分化细胞表达不同脑区标志，表明所得到NPs 具有 对脑区信号发生反应，进一步分化为不同脑区神经元细胞的能力。 本实验建立了具有自主知识产权的中国人源胚胎干细胞系，建立了ES 细胞的含血 清以及无血清的培养体系和向神经前体细胞定向分化系统，得到高比例的神经前体细 胞，为进一步研究利用人胚胎干细胞打下良好的基础。