人胚胎干细胞建系及向神经细胞定向分化的研究

研究和利用人胚胎干细胞(hES)细胞已成为生命科学领域的核心问题之一。当前hES 细胞研究主要集中在hES 的建系和维持其不分化状态；提高hES 细胞定向分化为特定 细胞的比例；ES 细胞自我更新和分化的机制等方面。本论文一方面概述了hES 细胞相 关领域的研究进展；另一方面建立了不同培养体系条件下3 株hES 细胞，并在此基础 上利用G5 和肝生长因子（HGF）诱导hES 细胞定向分化成高纯度的NPs。主要结论如 下：1) 建立人卵体外受精和胚胎培养体系。获得了15 个囊胚，采用了免疫外科法分离 内细胞团，运用含血清以及不含血清的培养体系，在ICR 小鼠胚胎成纤维饲养层上分 别建立了YKh-1、YKh-2 和YKh-3 3 株人胚胎干细胞系，生长良好，核型正常。ES 细 胞表达碱性磷酸酶活性、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81 和Oct-4，但不表达 SSEA-1； ES 细胞在体外能够分化为属于外胚层、中胚层和内胚层的各种分化细胞， 在SCID 小鼠体内能形成畸胎瘤，畸胎瘤包括了所有三个胚层来源的细胞类型。证实了 ES 细胞系的多向分化潜能。2) 对比含血清以及无血清的培养体系的hES 细胞系的特征， 观察了其集落形态、生长速度、分化能力。结果表明，在含血清培养体系的Yhk-2，其 集落形态较致密，含2-3 个核的细胞较多，细胞倍增时间为43.9±5.7h；而在无血清培 养体系的Yhk-3，其集落形态较铺展，细胞较小而圆，倍增时间为34.8±3.8h。细胞免疫 染色和PCR 结果表明，二者在体外都能分化为三个胚层来源的多种细胞，但比例有所 差异。提示二者在向三个胚层来源的细胞的分化能力上有所不同。 3) 以所建立的hES 细胞系为模型，采用HGF 和G5 作为诱导因子添加到神经诱导培养基中，诱导hES 细 胞分化成高纯度的NPs。单独的HGF 或G5 仅能诱导ES 细胞分化成70.9± 5.0%和 72.9±7.2%NPs，而联用HGF 和G5 使NPs 的比率达到91.2±11.2%，进一步纯化后获得 98±3.2%的NPs。获得的NPs 能分化成三个谱系神经细胞，亚克隆实验也进一步证明采 用HGF+G5 获得的单个NPs 具有神经干细胞的特性，也能在体外分化成三个谱系的神 经细胞。用SHH 处理NPs，获得的分化细胞表达不同脑区标志，表明所得到NPs 具有 对脑区信号发生反应，进一步分化为不同脑区神经元细胞的能力。 本实验建立了具有自主知识产权的中国人源胚胎干细胞系，建立了ES 细胞的含血 清以及无血清的培养体系和向神经前体细胞定向分化系统，得到高比例的神经前体细 胞，为进一步研究利用人胚胎干细胞打下良好的基础。