植物细胞色素P450对土壤PAHs污染早期诊断研究

以高等植物为试验材料，建立了细胞色素P450含量的测定方法。在此基础上通过对5种植物（小麦、玉米、白菜、萝卜、大豆）的筛选试验，最终选择小麦绿苗和玉米黄化苗作为供试材料，进行土壤菲、芘单一与复合污染条件下，细胞色素P450含量与多环芳烃污染的量-效关系生态毒理诊断研究。同时为比较不同指标对污染物生态毒性敏感性，进行了相同剂量条件下，SOD、POD、CAT活性,高等植物种子发芽与根伸长抑制率与菲、芘单一与复合污染诱导的剂量-效应关系试验研究。 细胞色素P450含量污染诱导研究结果表明，在较低的浓度下，土壤菲、芘单一暴露与小麦和玉米幼苗P450含量具有显著的污染诱导剂量-效应关系，菲、芘复合污染对小麦和玉米的P450产生协同毒性作用。两种植物P450含量对菲、芘污染指示较为敏感。 SOD、POD、CAT活性比较试验结果表明，SOD、POD、CAT活性对菲、芘污染具有响应，但响应敏感性不及植物色素P450，有些不能进行定量诊断，但可用于定性诊断。 发芽率和根伸长抑制率试验比较结果表明，在同样的供试浓度范围内，小麦发芽率和根伸长与对照相当，未出现明显诱导或抑制的响应。植物色素P450含量对菲、芘单一与复合污染的指示作用比植物种子发芽率和根伸长抑制率更为敏感。 植物细胞色素P450这一敏感指标可以作为生物标记物，与化学分析及抗氧化酶系指标结合起来进行土壤PAHs早期诊断。既有助于提高指标的准确性和敏感性，推动形成完善的土壤污染生态毒理诊断方法，还可从生理和分子水平使污染诱发障碍的机理等得到破译。

土壤低浓度PAHs胁迫下赤子爱胜蚓差异表达基因初步筛选

为探索土壤低浓度多环芳烃污染的生态毒性及其对土壤生物的致毒机理，本论文初步研究了菲、芘、荧蒽和苯并[a]芘等四种多环芳烃人工土壤污染在0.1mg.kg-1~10.0mg.kg-1浓度水平对赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）产卵量、体重变化、排卵激素annetocin基因和翻译控制肿瘤蛋白（translationally controlled tumor protein, TCTP）转录水平的影响，发现在相同的低浓度水平下，只有苯并[a]芘对蚯蚓annetocin前体基因和TCTP基因的表达有显著影响，故其对生物体的生殖风险和致癌风险可能最大。另一方面，低浓度苯并[a]芘对蚯蚓体重和产茧量并无显著影响，这表明基因表达水平作为污染生态监测指标比宏观观测指标更灵敏。 为进一步研究土壤PAHs污染的生态毒性效应，在上述研究基础上，我们采用SSH-PCR的方法构建了人工土壤1.0mg.kg-1苯并[a]芘胁迫下的蚯蚓与对照组蚯蚓之间的消减cDNA文库，随机挑取上调文库301个克隆及下调文库283个克隆进行测序，与NCBI蛋白数据库比对结果表明，其中有391个克隆与已知的75种蛋白质基因显著匹配（期望值< 10-5），其余克隆匹配不显著（期望值> 10-5）或找不到匹配蛋白。显著匹配的基因序列包括：一相解毒酶细胞色素P450，二相解毒酶谷胱甘肽硫转移酶，蛋白质合成所需的核糖体蛋白亚基，参与新合成肽链折叠的热休克蛋白，线粒体基因组编码的呼吸链复合酶体亚基，过氧化物还原蛋白，铁蛋白，钙结合蛋白，半胱氨酸蛋白酶等。表明低浓度苯并[a]芘胁迫引起蚯蚓的生理变化是非常复杂的，涉及污染物降解与解毒、抗氧化保护、能量代谢、蛋白质合成、金属离子调节与蛋白质降解等过程。 Real-time PCR检测验证消减文库中部分差异基因对不同剂量BaP胁迫响应结果表明，各检验基因序列受1.0 mg∙kg-1 BaP 胁迫影响均与消减结果一致，且影响程度均高于0.1 mg∙kg-1浓度水平的BaP；其中，在0.1 mg∙kg-1 BaP胁迫下，过氧化物还原酶PRDX和类似Cyp2R1的P450基因表达未见明显变化。其余的HSP70、HSP90、rpL10、COXⅡ、SCBP、Ferritin等基因在0.1 mg∙kg-1 BaP胁迫组蚯蚓中均有检测到预期表达变化，说明虽然从消减文库中获得的基因在一定的污染物浓度范围内均表现浓度效应，但各个基因对污染物的响应浓度不尽相同。 Real-time PCR检测消减文库中部分差异基因对不同PAHs胁迫响应结果表明，1.0 mg∙kg-1 浓度水平的荧蒽、菲、芘和苯并[a]芘对差异表达基因的影响不尽相同，主要有以下三种情况：(1)广谱响应型：蚯蚓线粒体编码的亚基COXⅡ、可溶性钙结合蛋白、铁蛋白等基因对荧蒽、菲、芘及苯并[a]芘的胁迫均有相似的响应；(2)随芳烃环数而变化型：热休克蛋白HSP70和过氧化物还原酶PRDX表现出响应程度随胁迫多环芳烃的环数增加而提高的现象；(3)仅在苯并[a]芘中有响应型：核糖体蛋白亚基L10和细胞色素P450（类似Cyp2R1）基因，在1.0 mg∙kg-1浓度条件下，它们仅受BaP诱导表达，而芘、菲和荧蒽却没有显示诱导作用。 上述结果表明，在土壤中的低浓度的多环芳烃污染胁迫对蚯蚓的影响是多方面的，这些影响至少涉及能量代谢、污染物降解与解毒、蛋白质合成与修复、信号转导、细胞凋亡、排卵生殖、个体发育等多方面的生理功能。目前蚯蚓基因组还未有完整测序，本文论述的多个差异表达基因是首次在蚯蚓中发现的，这些新发现的基因序列在为低浓度PAHs的生态毒性机理研究提供依据的同时，也为以蚯蚓为模式生物的土壤污染生物监测提供了备选的生物分子标记。另一方面，由于蚯蚓基因组未完整测序，本研究构建的消减文库中仍不少未知功能基因，其功能与调控有待进一步研究。

土壤低剂量PAHs污染生态毒理诊断指标研究

本文探讨了蚯蚓细胞色素P450作为生物标记物诊断土壤低剂量PAHs污染的可行性，主要以蚯蚓P450含量和AHH活性二项指标为主，开展“土壤低剂量PAHs污染敏感生态毒理诊断指标研究”，并结合其它分子毒理诊断指标，通过指示敏感性比较，最终建立土壤低剂量PAHs污染早期诊断的敏感生物标记指标或指标组合，为土壤污染早期诊断奠定基础。 蚯蚓P450含量测定方法研究表明，在强化预处理的基础上，通过微粒体增溶、物理分离和解剖后内脏直接测定等去干扰手段均可实现P450含量的测定。通过三种方法的比较，最终确定内脏直接测定法为最佳方法。在此基础上，对CO通气量进一步优化，确保P450含量的准确定性和定量。 低剂量PAHs胁迫下蚯蚓细胞色素P450响应研究表明，P450含量和AHH活性两指标随暴露时间的增加总体上表现为“先诱导后抑制”的响应规律，且响应因PAHs的不同而存在差异，对芘的指示效应最强，荧蒽次之，菲最弱，与其毒性大小相关。其中，AHH对PAHs的指示作用优于P450含量，两指标的响应情况显示了它们作为生物标记物的可行性。为增强污染诊断的灵敏性和有效性，可将蚯蚓P450含量和特异性同工酶活性联合，彼此互为补充，共同应用于土壤污染生态毒理诊断中。 低剂量PAHs胁迫下，参比指标的响应情况与P450相比结果显示，P450含量和AHH活性的指示效应最明显；SOD和POD活性的指示次之；GST和CAT活性虽表现出指示效应，但并不是对三种PAHs都具有指示效果；MDA含量对低剂量PAHs的指示性最差。不同指标对污染物的指示敏感性存在差异，因而在进行土壤污染生态毒理诊断时，应选用多指标联合，彼此相互补充，以适应不同污染状况下的污染诊断。酶活性对毒物暴露的响应在时间上是一个动态变化过程，单一时段的暴露结果可能不足以揭示污染物的毒性效应，选择多时段检测对污染暴露的灵敏指示尤为重要。 应用蚯蚓生化指标对沈阳污灌区土壤进行毒性诊断，结果表明P450、AHH、GST、POD和CAT五个指标通过不同时段的检测均可对供试土壤显示出指示效应；而SOD和MDA两指标均出现“漏诊”现象。同实验室条件下低剂量污染情况相比，P450含量和POD的指示效果在两种情况下均较好；AHH、SOD在实验室条件下的指示更为优越；而GST、CAT和MDA更适合于污染物复杂的实际土壤诊断。研究结果从实际应用的角度再一次证实，任何一种指标若采用单时段的检测均存在其污染诊断的“盲区”。在进行实际环境污染诊断时，采用多指标和多时段检测是不可或缺的。

土壤中PAHs的光催化降解动力学及机制研究

本文以土壤为介质，以三环的菲（Phe）、四环的芘（Pyr）和五环的苯并[a]芘（BaP）为目标污染物，研究了紫外灯照射下土壤中多环芳烃（PAHs）的降解，并以半导体纳米TiO2和Fe2O3为催化剂研究了土壤中PAHs的催化降解，对光降解及光催化降解的动力学进行了研究，在室内条件下考察了土壤条件和环境因子对光降解及光催化降解PAHs的影响；研究了太阳光照条件下土壤pH值对光降解和催化降解的影响和腐殖酸对光降解的影响；初步探讨了纳米TiO2催化光降解土壤中PAHs的机制。 研究结果表明：土壤中PAHs的紫外光降解符合一级动力学模型，土壤中PAHs光降解与土壤厚度呈显著负相关，土壤粒径对紫外光解PAHs有显著影响，温度从20 ℃升高到30 ℃，光解速率逐渐增加，在PAHs污染土壤的光降解中腐殖酸起敏化作用，随着紫外辐射强度的增加，光降解速率加快。 纳米TiO2和Fe2O3均能促进土壤中PAHs的紫外光降解，PAHs光催化降解符合一级动力学模型，在酸性和碱性土壤条件下，光催化降解PAHs的速率均高于中性，在不同光质条件下，TiO2 、Fe2O3催化光降解PAHs的速率发生变化，随着紫外辐射强度的增加，光催化降解速率常数增加，半衰期减少；腐殖酸促进TiO2 、Fe2O3催化土壤中PAHs的光降解，腐殖酸在这个过程中起着敏化作用。 在太阳光照射下酸性和碱性土壤中PAHs的降解快于中性，PAHs污染土壤中在加入腐殖酸后光降解速率加快，在酸性条件下催化降解最快，在碱性和中性条件下相差不大。 土壤中PAHs存在着PAH的光致电离、电子向O2的转移的两种降解途径；在有催化剂TiO2条件下，由于催化剂在光照后形成的电子-空穴能够氧化还原污染物，PAH的光致电离、电子向O2的转移的引起的降解，共同促进了土壤中PAHs的光催化降解。

土壤中PAHs和矿物油污染的生物修复调控研究

通过室内模拟和室外盆栽实验方法。进行了污染土壤中多环芳烃（PAHs）和矿物油生物修复调控研究；表面活性剂吐温－80对土壤多环芳烃生物修复作用研究及植物根际对土壤多环芳烃和矿物油的生物修复研究。结果如下：1、，对土壤PAHs（萘、芴、厄稀、菲、蒽、芘、苯（a)蒽和屈）生物修复调控研究表明，温度对PAHs降解影响最大，湿度其次，表面活性剂作为调控因素，对PAHs降解的影响最小，然而，研究发现，当TW－80的浓度在200－500ppm时，PAHs降解率最高，说明表面活性剂对土壤PAHs降解有调控作用。2、表面活性剂对土壤PAHs生物修复作用研究表明，TW－80能显著增加土壤PAHs降解率，30天内降解率达90％，比对照高30％。但是，土壤中TW－80浓度过高对微生物活性有抑制作用。研究还发现，含吐温－80的土壤中的大量微生物菌群，经鉴定，优势真菌为常见青霉、嚅形青霉、淡紫青霉和顶孢头孢霉。3、苜蓿草植物土壤对PAHs生物修复调控研究表明，在旱地好氧条件下，植物可加快土壤PAHs的降解，120天后，11种多环芳烃（萘、芴、厄稀、菲、蒽、萤蒽、芘、苯（a）蒽、屈、苯（a）萤蒽和苯（k）萤蒽））的总降解率96.3%。而30天后将植物去除，，降解率为94.4％。土壤有机肥对PAHs的降解有影响，土壤有机肥含量与PAH降解率增加成正比，但降解主要对较低分子量PAH起作用。有机肥对PAH降解的作用也被在高浓度PAHs污染土壤生物修复所证实。此外，将从油和PAH污染土壤中分离出来的真菌加入到苜蓿草土壤中，PAH降解率明显提高。但对无植物对照土壤作用不明显。4、苜蓿草土壤中矿物油的生物修复调控研究表明，在旱地好氧条件下，植物明显影响土壤矿物油的降解。经过120天，矿物油的降解率78.7％。比对照提高18％。实验还表明，增加土壤有机肥和特性降解真菌能明显促进矿物油降解。5、水稻土壤PAH生物降解调控研究表明，在淹水厌氧条件下，土壤PAH降解受到明显抑制，120天后，11种多环芳烃总降解率平均值为50％，本明显低于苜蓿草土壤。但研究还表明，增加土壤有机肥，可提高水稻的生物量，同时也提高PAH的降解率。投加特性降解真菌，有使PAH的降解率提高的趋势，特性降解细菌对提高PAH降解率无效。6、水稻土壤中矿物油生物降解搞控研究表明，在淹水厌氧条件下，经过120天后，矿物油降解率平均值为54.7％，明显低于旱地好氧土壤－植物系统。土壤的厌氧条件是导致降解速度低的主要原因。7、通过测定吸呼作用发现，苜蓿旱土壤的呼吸作用一般大于水稻土壤，表明好氧好氧条件下的微生物活性大于厌氧条件。此外，增加土壤有机质土壤呼吸强度出现猛增，表明有机质对土壤呼吸强度有明显影响。苜蓿草土壤的呼吸强度一般都高于无植物对照土壤，说明植物对土壤微生物的增强有作用。8、通过以上实验结果进行R值计算表明，对苜蓿草土壤，矿物油和PAH降解的主要调控因子是有机肥和污染物浓度。对水稻土壤，有机肥起重要作用。对无植物对照土壤，主要调控因子是浓度其次是有机肥。