MutS蛋白识别DNA错配机制的研究

DNA生物合成过程中DNA聚合酶会错误的掺入一些碱基而导致错配，这些错配的碱基如果不能被及时地更正将会引起机体广泛的突变。DNA错配修复系统正是基于这样一种需要而产生的，它能够切除含有错配的DNA片段并重新合成出一段正确的DNA，因此对于维持基因组的稳定性具有重要的意义。 大肠杆菌DNA错配修复系统包含11种蛋白活性，并可分为起始、切割和修复三个阶段。起始阶段的第一个步骤是错配识别，这一功能是由一种叫作MutS的蛋白来完成的，它能够特异性的识别并且结合到错配上，然后引发下游一系列的修复反应。为了更深入的理解MutS蛋白识别镶嵌在随机DNA序列中的错配的机制，我们纯化了MutS及其突变体蛋白，构建了一个2279 bp的在1/4位置带有G/T错配的DNA片段和一个具有同样长度与序列的完全配对的DNA片段，然后在原子力显微镜下观察MutS及突变体蛋白与这两种DNA底物的作用方式。结果表明MutS蛋白不但能与错配的DNA结合也能与完全配对的DNA结合，而且MutS蛋白能够诱导这两种DNA底物形成一种形似a字母的环状结构，在这种结构中MutS蛋白位于两条DNA臂的交叉处。我们发现这些环状结构是在MutS蛋白寻找错配的过程中形成的，因为随着时间推移越来越多的错配位点会被MutS蛋白占据。这些结果表明MutS蛋白非特异性的结合到DNA上，然后诱导DNA形成a环状结构，并且凭借a环结构的形成对DNA的两条臂同时进行扫描以便寻找出错配的碱基对。根据以上结果我们推测a环模式是MutS蛋白寻找错配的一种机制。这些研究也为用单分子的手段研究蛋白与DNA的相互作用提供了一种可行的方法。

DNA错配修复基因mutS的高效表达及表达产物活性鉴定

将DNA错配修复基因mutS(2 5 6kb)克隆于分泌型原核表达载体pET32a(+)上 ,以N端融合 6个组氨酸的形式在E .coliAD494(DE3)中进行了IPTG诱导表达。SDS PAGE分析证实有一与预期分子量相应的诱导表达条带 ,其表达量占全菌蛋白质的 35 %左右 ,且表达蛋白以可溶形式存在。利用固定化金属离子 (Ni2 +)配体亲和层析柱纯化目的蛋白 ,其纯度为 90 %以上。与含有错配碱基DNA双链的结合反应证明该蛋白具有特异性识别、结合含有错配碱基DNA双链的生物活性

镉胁迫对拟南芥幼苗错配修复相关基因表达及突变的影响

土壤重金属污染是影响农业可持续发展和生态环境的重要问题，而通过生物标记物方式对污染土壤进行早期诊断已成为环境科学领域的研究热点。本文以M&S营养液为培养介质，以拟南芥为供试材料，以错配修复基因MutS 2 homolog (atMSH2)，atMSH3，atMSH7，细胞增殖核抗原1 和2 (atPCNA1和atPCNA2)为检测目的基因，分别采用半定量反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术、克隆及测序技术研究了Cd在不同胁迫水平（0，0.125，0.25，1.0，3.0 mg•L-1 ）上对上述错配修复相关基因表达和atMSH2基因突变的影响，并与拟南芥幼苗形态、生理指标的毒性效应进行比较分析，筛选出对Cd污染胁迫敏感的生物标记物。主要结果如下： 1. 不同浓度（0，0.125，0.25，1.0，3.0 mg•L-1 ）Cd处理7天后，拟南芥幼苗叶片数、地上部鲜重变化与对照相比差异均不显著；而根长随Cd胁迫强度的增加明显降低； 2. 不同浓度（0，0.125，0.25，1.0，3.0 mg•L-1 ）Cd处理7天后，叶绿素含量变化与对照相比差异均不显著； 地上部可溶性蛋白含量随Cd浓度的增加变化明显，0.125 mg•L-1 Cd处理下，地上部可溶性蛋白含量显著增加，而在0.25，1.0和3.0 mg•L-1 Cd时降低，但仍高于对照； 3. 地上部atMSH2，atPCNA1，atPCNA2基因表达量的变化与Cd胁迫浓度呈明显的倒U字型关系，分别在0.125mg•L-1，0.25mg•L-1和0.125mg•L-1 Cd时达到最大值。地上部可溶性蛋白含量变化趋势与atMSH2，atPCNA1，atPCNA2基因表达量的变化相似，均可作为对Cd污染胁迫敏感的潜在生物标记物。 4. 对不同浓度（0，0.125，0.25，1.0，3.0 mg•L-1 ）Cd处理7天后，拟南芥atMSH2基因PCR后的扩增产物进行回收、纯化、克隆和测序。测序结果表明，0.25 mg•L-1 Cd处理拟南芥atMSH2基因在第8个和第9个外显子之间的内含子有一个碱基转换；在1.0 mg•L-1 Cd处理下，拟南芥在第10个外显子有一个碱基转换。

基于错配修复系统的基因突变检测生物芯片研究

许多人类疾病和微生物抗药性的产生都是由基因组中单个碱基的替换、插入或缺失等基因突变引起的。因此，迫切需要发展快速、高通量基因突变检测方法来实现对基因疾病和细菌抗药性的早期诊断。本研究针对匕述需求发展了纂于DN八错配修复系统的墓因突变检测生物芯片方法。根据DNA错配修复MtltS蛋白结构与功能上的高度保守性，通过PCR从E.coli K-12基因组中扩一增出DNA错配修复基因，甩石（2.56kb）。通过基因水平的分子操纵，构建了Trx-His6-MutS（THM）、Trx-His6-Linker peptide-Muts（THLM）、Trx-His6-GFP-Linker peptide-MutS（THGLM）和Trx-His6-Linker peptide-Strep-tagll-Linker peptide-MutS（THLSLM）的融合基因并在大肠杆菌中进行了IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析表明均有一与预期分子量相应的诱导表达条带出现，其表达量占菌体蛋白的30％左右，且以可溶形式存在。融合蛋白中Trx和His6亲和肤能增加表达蛋白的可溶性及便于蛋白的纯化。连接肤的加入增大了融合蛋白各个成分之间的距离，减少空间位阻，使各个蛋白能够较大程度地保持其原有的生物活性。MLltS融合蛋白的生物活性鉴定结果表明：它们既能识别、结合含有错配碱基的DNA双链，又保留了其它融合成分的生物活性。利用融合蛋白THLSLM中的Strep-tagII与Streptavidin相互作用的天然特性，使融合蛋白THLSLM在StrePtavidin修饰过的芯片基质上自动布阵沉积，制作成蛋白质芯片来识别、结合样品中含有错配或未配刘碱基的DNA双链。THGLM、THLM-Cy3和THLSLM能够使MutS蛋白显示不同的标记信号，通过它们识别并结合固定在DNA芯片基质上的基因片段来发展基因突变检测DNA芯片方法。利用基于MutS的蛋白质芯片和DNA芯片方法对含有不同错配类型、不同长度的DNA片段和错配序列背景对错配结合的影响做了深入研究，证明了MutS介导的基因突变检测生物芯片方法的可行性。基于MutS蛋白的鳌因突变检测生物芯片方法借用了生物系统本身的DNA错配修复（Mismatch Repair，MMR）机制。DNA错配修复过程是许多修复蛋白之间的相互作用共同完成的，其中蛋白MutS、MutL和MutH在肠道细菌例如大肠杆菌的甲基定向错配修复中起决定作用。这些修复蛋白的相关研究也引起了越来越多学者的关注，但对于MutL蛋白的体外生物功能一直存在争议，从而限制了该蛋白的应用研究。本研究利用基因的体外拼接技术构建了融合蛋白Trx-Hi56-Linker peptide-MutL（THLL）、Trx-His6-GFP-Linker peptide-MutL（THGLL）和Trx-His6-Linker peptide-Strep-tagII-Linker peptide-MutL（THLSLL）。非变性凝胶电泳鉴定MutL融合蛋白体外生物功能结果表明：THLL、THGLL和THLsLL都能增加融合蛋白Trx-His6-Linker peptide-MutS（THLM）与含有错配碱基DNA双链的结合，但受ATP浓度变化的影响很大。通过融合蛋白THGLL中绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）的荧光信号或THLSLL中Strep-tagII的特性并利用酶学反应来指示该蛋白的存在，发展了体外研究DNA错配修复蛋白MtuS和MutL之间相互作用的简便方法。本研究以构建的MutS融合蛋白为分子识别元件发展了基因突变检测生物芯片并利用构建的MutL融合蛋白发展了体外研究DNA错配修复蛋白MLuS和MutL之间相互作用的简便方法。建立的融合分子系统方法也为研究其它的蛋白质或生物大分子之间的相互作用提供了一个技术平台。此外，本研究构建的融合蛋白THGLL及其 DNA错配修复蛋白与GFP的融合构想还可用来进行DNA错配修复基因产物的表达与基因突变频率和人类肿瘤恶性程度的相关性研究。

DNA错配修复系统研究进展

DNA错配修复 (mismatchrepair ,MMR)系统广泛存在于生物体中 .从原核生物大肠杆菌到真核生物及人类 ,MMR系统有不同的组成成分和修复机制 .人体内MMR基因缺陷会造成基因组的不稳定并诱发遗传性非息肉型直肠癌以及其他自发性肿瘤 .大肠杆菌MMR系统中的MutS蛋白可特异识别错配或未配对碱基 ,目前已经发展了多种基于MutS蛋白的基因突变 /多态性检测技术 .

MutL融合蛋白的高效表达及其伴侣功能研究(英文)

DNA错配修复蛋白MutL和其它的修复蛋白相互作用来共同完成大肠杆菌甲基介导的错配修复过程 .为研究修复蛋白MutL的体外生物功能构建了融合蛋白Trx His6 Linkerpeptide MutL(THLL)的表达载体并使其高效表达及易于纯化 .mutL基因片段是以E .coliK 12基因组为模板经PCR扩增获得 ,并通过基因的体外拼接成功构建了融合蛋白THLL表达载体pET32a linkerpeptide mutL .重组菌株E .coliAD4 94 (DE3) pET32a linkerpeptide mutL经过IPTG的诱导表达了融合蛋白THLL .收集菌体细胞、超声波破碎后离心取上清进行SDS PAGE分析 ,结果表明有一与预期分子量(84kD)相应的诱导表达条带出现 ,其表达量约占全细胞蛋白的 30 %且以可溶形式存在 .利用固定化金属离子 (Ni2 +)配体亲和层析柱纯化融合蛋白THLL ,其纯度达到 90 % .通过非变性凝胶电泳分析 ,对融合蛋白THLL在DNA错配修复过程中的分子伴侣生物功能进行了系统研究 .结果表明 ,THLL能增加融合蛋白Trx His6 Linkerpeptide MutS (THLS)与含有错配碱基DNA双链的结合 ,但受ATP的浓度变化影响很大