Effects of tetrabrominated diphenyl ether and hexabromocyclododecanes in single and complex exposure to hepatoma HepG2 cells

This study was designed to determine cytotoxic effects of PBDE-47 and HBCDs individually or with a mixture of both compounds exposure to Hep G2 cells. The results showed PBDE-47 and HBCDs induced increase of nitric oxide synthase (NOS) activity, release of NO. dissipation of mitochondria membrane potential and cell apoptosis. Exposure to HBCDs induced ROS formation. Moreover, preincubation with PTIO (NO scavanger) and N-acetylcysteine (ROS scavanger) partially reversed cytotoxic effects of these compounds. The possible mechanism is that PBDE-47 and HBCDs could boost generation of NO and/or ROS, impact mitochondria, and result in start-ups of apoptosis program. Cells exposed to mixture of both compounds and each of them showed non-apoptotic rate significant difference, but the combination of them caused more adverse effects on cells. These results Suggest that PBDE-47 and HBCDs in single and complex exposure have the cytotoxic activity of anti-proliferation and induction of apoptosis in tumor cells in vitro. (C) 2008 Elsevier B.V. All rights reserved.

Survivin表达对HepG2细胞高LET射线辐射敏感性的影响

<正>Survivin是1997年发现的凋亡抑制蛋白家族(IAPs)的成员,它特异性的表达于大多数的恶性肿瘤细胞中,而在正常组织中检测不到,具有组织特异性。以前的研究表

重离子辐照对人肝癌HepG2细胞蛋白质组图谱的影响

分别制备经1 Gy C离子辐照和未经辐照人肝癌HepG2细胞的总蛋白样品,采用固相pH梯度双向凝胶电泳技术进行蛋白分离,用ImageMaster 2D双向电泳凝胶图像分析软件分析数字化图谱。结果显示,差异表达的蛋白质点为17个,其中1个仅在未经C离子辐照的HepG2细胞中表达,8个蛋白质点在辐照后的细胞中表达上调,8个蛋白质点在辐照后的细胞中表达下调。建立了重复性较好和分辨率较高的分离HepG2细胞总蛋白的双向电泳技术。实验结果表明,C离子辐照HepG2细胞后其蛋白质组发生了改变。

不同LET辐射对HepG2肝癌细胞的辐射敏感性与周期阻滞的影响

本工作研究不同LET射线辐照对HepG2肝癌细胞辐射敏感性、周期进程和凋亡的影响,为重离子治疗癌症的临床应用积累基础数据。以0、0.5、1、2、4、8Gy剂量的12C6+离子及X射线分别照射处于指数生长期的HepG2细胞,用克隆形成率测定细胞辐射敏感性,通过流式细胞术测定细胞DNA含量以确定各时相细胞的比例及细胞凋亡情况。实验结果显示,12C6+离子辐照所致的HepG2细胞存活率明显低于X射线。随着吸收剂量的增加和修复时间的延长,12C6+离子能导致更显著的细胞S期阻滞、G2/M期阻滞延迟和细胞凋亡。说明与X射线相比,12C6+离子辐照能更有效地杀伤HepG2肝癌细胞并诱导其凋亡。

低剂量电离辐射预处理对高剂量辐射诱导的肝癌细胞hepG2细胞周期阻滞的影响

以人肝癌细胞 hepG2 为研究对象,用流式细胞术测定并分析了低剂量 γ 射线(5cGy)预照射对高剂量照射(3Gy)诱导的细胞周期阻滞的影响。结果显示:(1)低剂量照射可引起 hepG2 细胞在 G2/M 期短暂累积(至照射后 4h);(2)低剂量照射促进 hepG2 细胞的生长;(3)高剂量照射后,hepG2 细胞的 G2期发生阻滞,而 S 期只发生短暂延迟;(4)与单纯高剂量照射相比,低剂量照射预处理后 4h 给予高剂量照射可进一步促进hepG2 细胞在 G2/M 期累积,但预处理后 8h 给予高剂量可促进细胞通过 G2/M 期。实验结果表明,低剂量照射预处理对高剂量照射诱导的细胞周期阻滞的影响,取决于两次照射的时间间隔。

Survivin expressions in human hepatoma HepG2 cells exposed to ionizing radiation of different LET

Survivin is a member of the inhibitors of apoptosis (IAP) protein family that interferes with post-mitochondrial events including activation of caspases. To examine the regulation of survivin expression in response to irradiation with different linear energy transfer (LET), human hepatoma HepG2 cells were irradiated in vitro with X-rays and carbon ions. Cellular sensitivities to low- and high-LET radiation were determined by colony formation. Survivin expression at mRNA and protein level were measured with RT-PCR and Western blot analyses, respectively. Radiation-induced cell cycle arrest and apoptosis were investigated with flow cytometry. We found that low-LET X-rays induced dose-dependent increases in survivin expression. After exposure to high-LET carbon ions, survivin expression gradually increased from 0 to 4 Gy, and then declined at 6 Gy. More pronounced survivin expression, stronger G(2)/M phase arrest was observed after exposure to carbon ions in comparison with X-rays at doses from 0 to 4 Gy. These observations indicate that there is a differential survivin expression in response to different LET radiations and the cycle arrest mechanism may be associated with it. In addition, our data on induction of apoptosis are compatible with the assumption that survivin expression induced by low-LET X-rays radiation may play a critical role in inhibiting apoptosis. However, after irradiation with ions, an anti-apoptotic function of survivin is not evident, possibly because of the serious damage produced by densely ionizing radiation.

抑制survivin表达增强人肝癌HepG2细胞对高线性能量转移射线的辐射敏感性；Inhibiting Survivin Expression Increases The Radiosensitivity of Human Hepatoma HepG2 Cells to High-LET Radiation

探讨了肿瘤细胞中survivin的表达对高线性能量转移(LET)射线辐射敏感性的影响.根据Gen Bank提供的survivin序列,合成特异性survivin-siRNA寡核苷酸,转染人肝癌HepG2细胞,抑制survivin的表达.发现siRNA转染后诱导了HepG2细胞G2/M期阻滞,增加了自发性和辐射诱导的细胞凋亡.在高线性能量转移(LET)碳离子辐照后,siRNA转染细胞的克隆存活率明显下降.这些结果表明survivin表达是HepG2细胞产生对高LET射线辐射抗性的关键因素.

Inhibiting Survivin Expression Increases The Radiosensitivity of Human Hepatoma HepG2 Cells to High-LET Radiation

The influence of survivin expression on the radiosensitivity of tumor cells to high linear energy transfer (LET) radiation is investigated. Survivin-specific short-interfering RNA (siRNA) oligonucleotides were synthesized based on the survivin sequence provided by GenBank. Human hepatoma HepG2 cells were transfected with survivin-specific siRNA to inhibit its expressions. It was found that the transfection with surviving-specific siRNA increased the levels of G2/M arrest and the apoptotic rates induced by radiation in HepG2 cells. After exposure to high-LET carbon ions, a reduced clonogenic survival effect was observed in the cells treated with siRNA. These results show that survivin plays a key role in mediating the radioresistance of cells to high-LET radiation.

survivin表达对重离子诱导人肝癌HepG2细胞生物学效应的影响

放射治疗是肿瘤三大治疗手段之一（手术治疗、放疗、化疗），如何提高肿瘤细胞的放射敏感性一直是科研人员关注的研究方向。电离辐射导致细胞死亡的主要方式是细胞凋亡，然而肿瘤细胞内往往细胞凋亡信号通路异常，降低了治疗效果。其中细胞内高水平表达的细胞凋亡抑制蛋白（Inhibitor of Apoptosis Protein，IAP）抑制了caspase分子的活性，而caspase分子正是细胞凋亡的执行分子。因此科学家们通过各种手段尤其是RNA干涉的方法以抑制肿瘤细胞内细胞凋亡抑制蛋白的表达及蛋白活性来达到提高肿瘤治疗效果的目的。 Survivin是凋亡抑制蛋白家族的一员，该蛋白在大多数恶性肿瘤中高表达，而在正常组织中检测不到，因此具有组织特异性。Survivin参与肿瘤细胞分化并抑制肿瘤细胞凋亡，它的高表达被证明与很多恶性肿瘤对放射治疗中产生的辐射抗性相关。本文主要研究了不同LET射线辐照下人肝癌HepG2细胞 survivin的表达及其表达对重离子诱导的生物学效应的影响。首先，我们使用不同LET的碳离子束和X射线辐照HepG2细胞，采用标准克隆形成法确定其辐射敏感性，利用流式细胞技术（FCM）检测辐射后细胞周期分布，RT-PCR和western blotting检测survivin的表达。结果显示，人肝HepG2癌细胞经不同LET射线照射，survivin表达是不同的。与低LET的X射线相比，高LET碳离子诱导的细胞损伤和周期阻滞更明显，从而诱导了更强烈的survivin表达。 接着，根据Genbank提供的survivin序列，合成特异性survivin-siRNA寡核苷酸，转染HepG2细胞，抑制survivin的表达。我们发现siRNA转染后诱导了细胞G2/M期阻滞，增加了自发性和辐射诱导的细胞凋亡。在碳离子辐照后，siRNA细胞克隆存活率明显下降。这些结果显示survivin表达是细胞产生高LET辐射抗性的关键因素。最后，我们初步探讨了在细胞凋亡过程中，survivin基因的作用机制。发现抑制survivin表达，对离子束辐射诱导的Bcl-2和Bax表达没有明显的影响。Survivin表达直接抑制了caspase-3和-9的活性，从而抑制了细胞凋亡。以上的实验结果表明：不同LET射线辐照细胞后survivin出现差异表达，与X射线相比，高LET重离子诱导的HepG2细胞中survivin表达更明显，以survivin为靶基因的siRNA技术应用于HepG2细胞，可以极大提高该细胞对重离子辐射的敏感性。本论文研究为临床应用重离子束治疗癌症提供了非常有用的基础数据，同时也为重离子束放射治疗联合基因治疗提供了新的思路

Ascofuranone增加HepG2细胞LDLR报告基因表达的生物活性的研究

以控制LDLR基因表达的调控元件SRE为靶位点 ,使用含有荧光素酶报告基因的转染人肝细胞系HepG2筛选模型高通量筛选微生物来源的能够增加低密度脂蛋白受体 (LDLR)基因表达的具有潜在的降胆固醇作用的生物活性物质。在筛选过程中 ,通过对一株真菌产生的化合物ascofuranone的研究发现该化合物对测活用细胞株的LDLR荧光素酶报告基因的表达有中等强度的激活作用 ,其SC150 为 40 .4μmol/L。Ascofuranone激活LDLR基因表达这一新的生物活性的发现为深入研究该化合物的降血脂作用提供了新的重要启示

紧密连接分子Symplekin 在肝脏疾病中表达及调控机制的研究

肝细胞癌是世界上多发的肿瘤之一，在中国及东南亚地区尤为多见，其死亡率高且预后差。肝癌具有多种发病原因且伴有多种肿瘤相关基因的分子突变。细胞连接分子（紧密连接、粘着连接、桥粒）在维护细胞极性及上皮细胞屏障方面起着重要作用，其表达异常与恶性肿瘤发生、发展有很大相关性。Symplekin 是新近发现的紧密连接相关分子，紧密连接分子 Symplekin 是多定位与多功能的蛋白，除参与上皮细胞紧密连接的形成外，Symplekin 还参与RNA 3’端腺苷酸化的过程，并且具有调节细胞增殖的作用。我们前期工作发现Symplekin 在癌前病变、恶性病变的肝细胞中明显降低，可能参与肝细胞的恶性转化。研究紧密连接分子Symplekin 在肝脏疾病中表达及调控机制对于阐明肝癌发生的机理及对于肝癌的预防和治疗具有十分重要的意义。多种分子调控机制导致基因表达水平的降低，如：基因启动子区域的超甲基化现象，基因核心启动子区域的碱基缺失，炎症相关因子TNF-alpha 和/或 INF-gamma导致基因表达水平的下降以及microRNAs对于靶基因的下调作用。因此，本研究利用Bisulfite restriction PCR、半定量PCR、q-RT-PCR、Western-blot等方法检测Symplekin在肝硬化、肝癌及多种癌细胞系中表达水平改变，及其在肝癌及肝癌细胞系中表达降低的机理——启动子区域发生 CpG岛的甲基化；启动子区域缺失；细胞因子TNF-alpha 和 IFN-gamma 对Symplekin 表达水平的影响；MicroRNAs在癌细胞系中与Symplekin的相对表达情况。实验结果显示（1）Symplekin 在肝硬化和肝癌组织中mRNA 表达水平呈下降趋势， Symplekin 在癌细胞系如肝癌细胞系（ HepG2 、HuH-7 ）、肺癌细胞系（GLC,Spca-1,Ncih446,801D）、宫颈癌细胞系（Hela）、乳腺癌细胞系（Mcf-7）中表达均下降。（2）利用细胞因子TNF-alpha、INF-gamma 同时处理HepG2 细胞系，Symplekin mRNA、蛋白均表达下降。（3）应用q-RT-PCR 检测5 个细胞系中Symplekin、Mir-124 的相对表达量，发现Mir-124 和Symplekin 表达量变化有相反趋势。（4）应用bisulfite restriction PCR 对13 例肝癌组织、10 例肝硬化组织、4 例正常肝组织以及肝癌细胞系HepG2 、Huh7 启动子区域甲基化状态进行检测，发现Symplekin 启动子区域都无甲基化现象；（5）同时，对8 例肝癌组织、10 例正常肝组织、5 例上皮细胞系及6 例白血病细胞系启动子区域缺失进行检测，发现Symplekin 启动子区域确实有碱基缺失，但其在肝癌组织、肝硬化组织、正常肝组织间没有统计学意义。实验结果提示Symplekin 很可能在肝细胞的恶性转化中起着重要的作用，此外 Symplekin 表达下降可能不仅参与肝癌发生且与其它肿瘤的发生具有相关性。推测在肝炎、肝硬化中，Symplekin 的下降可能会导致紧密连接功能下降，肝胆管上皮屏障功能降低， CB(结合胆红素)返流入血中，可能也是造成黄疸形成的原因之一。在肝脏疾病炎症反应过程中，细胞因子可能会协同作用影响Symplekin 的表达。Mir-124 有可能直接负调控Symplekin 的表达从而导致其表达降低。而Symplekin 启动子区域甲基化或缺失与肝癌发生无相关性。结论：（1）Symplekin 在大部分肝炎、肝硬化、肝癌组织中mRNA 表达水平呈下降趋势，这表明Symplekin 很可能在肝细胞的恶性转化中起着重要的作用。（2）Symplekin 在癌细胞系如肝癌细胞系（HepG2,HuH-7）肺癌细胞系（GLC,Spca-1,Ncih446,801D）、宫颈癌细胞系（Hela）、乳腺癌细胞系（Mcf-7）中表达均下降，这提示Symplekin 表达下降可能不仅参与肝癌发生而且参与其它肿瘤的发生。（3）Symplekin 启动子区域甲基化或缺失在肝癌、肝硬化及正常肝组织之间无显著性差异，表明在肝癌发生时Symplekin 的表达下降可能与启动子DNA 甲基化和缺失无关。（4）体外实验表明炎症细胞因子TNF-alpha 与INF-gamma 的协同参可能是体内Symplekin 表达及调控的机制之一。（5）Mir-124 对于Symplekin 的负调控作用也可能是体内Symplekin 表达及调控的机制之一。炎症细胞因子TNF-alpha 与INF-gamma 及Mir-124 可能在肝脏疾病及肝癌发生过程中起着重要作用。

唾液酸转移酶Ⅰ（ST6GalⅠ）及甲胎蛋白（AFP）上肝癌特异糖链在肝细胞肝癌细胞系和肝病患者血液中的表达

肝癌（HCC）是一种重要的恶性肿瘤，具有高发病率和不良预后的特点，在中国有很多的肝癌患者。早期发现和精确区分肝癌与其他肝病，对于肝癌的临床诊断治疗有十分重要的作用。由于肝脏所处位置较深，以及检测仪器和手段的限制，肝癌的早期诊断相对困难，所以比较好的血清学标记物应用于早期区分肝癌和其他肝病显得尤为重要。目前应用较多的标记物是甲胎蛋白AFP。由于单独的AFP其敏感性和特异性并不高，更为理想的检测手段正在研究中。 Beta-galactoside alpha-2,6-sialyltransferase Ⅰ(ST6GalⅠ)是唾液酸转移酶家族中的一员，主要调控蛋白的唾液酸化。有研究发现ST6Gal在肝癌中表达升高，而且随着肝实体瘤的恶化而可能被释放到外周血中。所以血液中的ST6GalⅠ水平可能是一种有潜力的肝癌指标。另外，有研究显示，AFP的糖链结构在肝癌和其他肝病中是不同的，如果能用AFP上肝癌特异糖链作为检测目标，联合已有的检测体系，可能有助于早期精确诊断肝癌。 目的：我们选择ST6Gal Ⅰ和AFP上肝癌特异糖链TF（Thomsen-Friedenreich）抗原，H2血型抗原，Lewis Y血型抗原作为主要的研究内容，通过对其在肝癌细胞系和肝病血液中的表达研究，探讨其应用于肝癌早期诊断的可能。 方法：1）用合成的ST6Gal Ⅰ多肽免疫兔子，制备抗ST6Gal Ⅰ多克隆抗体；2）通过免疫细胞化学，ELISA和western blot等方法对制作的兔多克隆抗体进行效价分析；3）通过western blot方法对肝癌、肝硬化和正常人的血浆和血清中ST6Gal表达进行研究；4）通过免疫沉淀的方法对肝癌细胞系和肝癌血浆中AFP上肝癌特异糖链进行研究。 结果：1）制备的兔抗人ST多克隆抗血清，效价可达1:400000，能够通过 免疫细胞化学和western blot检测到肝癌细胞系中的ST6GalⅠ；2）所选的3例肝癌血浆和2例肝癌血清中都有ST6GalⅠ阳性，在所选的2例肝硬化血浆和2例肝硬化血清中，分别只有1例有ST6GalⅠ的阳性，在3例正常人血浆中有2例有ST6GalⅠ阳性；3）AFP上肝癌特异的糖链TF抗原、H2抗原、Lewis Y抗原可以通过免疫沉淀的方法在肝癌病人血浆和肝癌细胞系HepG2中检出。 结论：制备的兔抗人ST6GalⅠ多克隆抗体具有较高效价，并可以检测到自然状态和变性状态的目标蛋白，可以应用于ST6GalⅠ的研究；通过western blotting对肝病血液的检测，发现在肝癌、肝硬化和正常人血液中的ST6GalⅠ的表达有差异，为ST6GalⅠ作为一种肿瘤标记物进行血清学检测提供了可能的前提；免疫沉淀的结果，证实了在肝癌病人的AFP上有TF、H2、LewisY等糖链的存在，为AFP上肝癌特异糖链作一种区分肝癌和其他良性肝病的标记物提供了证据。

唾液酸转移酶Ⅰ（ST6GalⅠ）及甲胎蛋白（AFP）上肝癌特异糖链在肝细胞肝癌细胞系和肝病患者血液中的表达

肝癌（HCC）是一种重要的恶性肿瘤，具有高发病率和不良预后的特点，在中国有很多的肝癌患者。早期发现和精确区分肝癌与其他肝病，对于肝癌的临床诊断治疗有十分重要的作用。由于肝脏所处位置较深，以及检测仪器和手段的限制，肝癌的早期诊断相对困难，所以比较好的血清学标记物应用于早期区分肝癌和其他肝病显得尤为重要。目前应用较多的标记物是甲胎蛋白AFP。由于单独的AFP其敏感性和特异性并不高，更为理想的检测手段正在研究中。 Beta-galactoside alpha-2,6-sialyltransferase Ⅰ(ST6GalⅠ)是唾液酸转移酶家族中的一员，主要调控蛋白的唾液酸化。有研究发现ST6Gal在肝癌中表达升高，而且随着肝实体瘤的恶化而可能被释放到外周血中。所以血液中的ST6GalⅠ水平可能是一种有潜力的肝癌指标。另外，有研究显示，AFP的糖链结构在肝癌和其他肝病中是不同的，如果能用AFP上肝癌特异糖链作为检测目标，联合已有的检测体系，可能有助于早期精确诊断肝癌。 目的：我们选择ST6Gal Ⅰ和AFP上肝癌特异糖链TF（Thomsen-Friedenreich）抗原，H2血型抗原，Lewis Y血型抗原作为主要的研究内容，通过对其在肝癌细胞系和肝病血液中的表达研究，探讨其应用于肝癌早期诊断的可能。 方法：1）用合成的ST6Gal Ⅰ多肽免疫兔子，制备抗ST6Gal Ⅰ多克隆抗体；2）通过免疫细胞化学，ELISA和western blot等方法对制作的兔多克隆抗体进行效价分析；3）通过western blot方法对肝癌、肝硬化和正常人的血浆和血清中ST6Gal表达进行研究；4）通过免疫沉淀的方法对肝癌细胞系和肝癌血浆中AFP上肝癌特异糖链进行研究。 结果：1）制备的兔抗人ST多克隆抗血清，效价可达1:400000，能够通过免疫细胞化学和western blot检测到肝癌细胞系中的ST6GalⅠ；2）所选的3例肝癌血浆和2例肝癌血清中都有ST6GalⅠ阳性，在所选的2例肝硬化血浆和2例肝硬化血清中，分别只有1例有ST6GalⅠ的阳性，在3例正常人血浆中有2例有ST6GalⅠ阳性；3）AFP上肝癌特异的糖链TF抗原、H2抗原、Lewis Y抗原可以通过免疫沉淀的方法在肝癌病人血浆和肝癌细胞系HepG2中检出。 结论：制备的兔抗人ST6GalⅠ多克隆抗体具有较高效价，并可以检测到自然状态和变性状态的目标蛋白，可以应用于ST6GalⅠ的研究；通过western blotting对肝病血液的检测，发现在肝癌、肝硬化和正常人血液中的ST6GalⅠ的表达有差异，为ST6GalⅠ作为一种肿瘤标记物进行血清学检测提供了可能的前提；免疫沉淀的结果，证实了在肝癌病人的AFP上有TF、H2、LewisY等糖链的存在，为AFP上肝癌特异糖链作一种区分肝癌和其他良性肝病的标记物提供了证据。

树鼩原代肝细胞培养体系和乙型肝炎病毒体外感染模型的建立

乙型肝炎病毒（Hepatitis Virus type B, HBV）感染是一种严重威胁人类健康的世界性问题。由于HBV感染具有宿主和组织特异性，长期以来一直缺乏有效的体外感染模型，严重制约了HBV感染机制和治疗药物的研究。树鼩（Tree Shrews, Tupaia Belangeri）与人和灵长类亲缘关系较为接近，作为小动物模型在乙型肝炎研究中备受关注。但由于各种原因的限制，HBV树鼩感染模型仍处于“国际公认但实际短缺，国内首创但实际空缺”的状况。因此，复建和优化HBV树鼩体内外感染模型成为我们长期研究方向所必备的前提基础和开端。而树鼩原代肝细胞的分离和培养则是建立HBV体外感染模型的关键的第一步。我们通过与机械分离法的直接比较，验证了两步灌注法在树鼩肝细胞分离中的优越性。进而发现，在分离后的体外培养过程中，二甲基亚砜不仅能够促进和维持原代肝细胞的分化，而且能够显著地抑制纤维状细胞群的出现。同时，肝细胞生长因子（HGF）和表皮生长因子（EGF）能够促进肝细胞在体外长期存活。在此优化的条件下，原代培养可持续4-5周，并且较多的细胞聚集形成类似肝窦结构的形态，从而成功地复制和改进了树鼩原代肝细胞培养体系，为建立HBV体外感染模型提供了基础。与此同时，我们采集了2种来源的HBV，即以乙肝病人血清和HepG2.2.15细胞培养上清为来源。我们采用蔗糖浓度梯度离心法以纯化病人血清病毒，能较好地将HBV颗粒和亚病毒颗粒区分开来。在收集HepG2.2.15细胞株来源的病毒时，我们详细研究了HepG2.2.15细胞的生长曲线和病毒产量曲线，找到病毒产量与细胞生长状态之间的联系，确定了最佳收集病毒时间，并通过放大培养条件，大量收集HepG2.2.15细胞的培养上清。我们采用浓缩和未浓缩的HepG2.2.15病毒、纯化的血清病毒等3种方式制备的病毒感染树鼩原代肝细胞，通过不同水平的指标来检测感染结果。首先，细胞内HBVx基因mRNA的检测结果表明，3种来源的病毒都可以感染树鼩原代肝细胞。同时，细胞上清中分泌的病毒颗粒及病毒蛋白的检测结果表明，HepG2.2.15病毒感染树鼩原代肝细胞的效果比血清病毒的感染效果好。免疫荧光的检测结果进一步证实了HepG2.2.15病毒能够感染树鼩原代肝细胞。因此，在我们的实验中，树鼩原代肝细胞对2种来源和不同制备方式的病毒均具有易感性，且以未浓缩的HepG2.2.15上清病毒感染力优于血清病毒。综上所述，我们现有的结果验证了树鼩原代肝细胞对HBV具有易感性。就感染效率而言，尽管感染效率依赖于病毒滴度及其感染力，我们在病毒细胞比例为0.02:1的条件下，仍能确认易感性，并获得了与国际同类研究相当的感染效率。就本研究的应用前景而言，我们所建立的HBV体外感染模型，能够作为实验室的通用平台，用以来研究HBV的感染机制和抗病毒药物的筛选与评价。

姚虻成功从宿主获得血餐的分子机制初探

在长期的吸血进化过程中，吸血节肢动物在唾液腺中形成了一系列有助于适应吸 血生存的活性物质，这些物质包括血管舒张分子、血小板聚集抑制分子、抗凝血分子 和其它相互作用的分子。此外，为了得到洁净的血液和防止在吸血过程中被病原微生 物感染，吸血节肢动物在其唾液腺中形成了许多防御物质以保护自身和宿主，这些物 质包括抗菌肽和蛋白酶抑制剂等。因此，研究吸血节肢动物的唾液腺重要活性物质和 转录体组学有助于弄清其吸血机制。 姚虻（Tabancus yao Macquart）是我国特有的牛虻，其雌性在产卵前需要吸食大 型哺乳动物的血液以促使卵的发育。我们希望通过对姚虻唾液腺重要活性物质和转录 体组学的研究揭示姚虻成功从宿主获得血餐的分子机制，找到具有药用前景的活性物 质和为控制该虫及其传播的疾病的提供理论基础。 首先，我们对其唾液腺匀浆物活性进行了系统分析，发现姚虻唾液腺匀浆物具有 如下活性：有抗金黄色葡萄球菌活性，并且对大肠杆菌、白色念球菌和枯草杆菌都有 效；能够抑制ADP 诱导的洗涤和富血浆血小板的聚集；能够凝集兔红细胞、能够抑制 丝氨酸蛋白酶对小肽底物的水解、具有对纤维蛋白原的水解活性（金属蛋白酶）、具 有过敏原活性、能够促进肥大细胞脱粒和组氨释放；反复检测而没有发现的活性如下： 磷脂酶A2(PLA2)活性、溶血活性、血浆凝固活性、体外抗补体、血管生长促进与抑制 活性、对小鼠脾细胞因子分泌的促进和抑制活性、抗肿瘤细胞HepG2 的生长活性。 以来源姚虻唾液腺的mRNA为材料，我们成功构建了丰度为1ｘ106的姚虻唾液腺 cDNA文库。通过对400个随机克隆的测序，我们得到了编码23种保守蛋白，44种分泌 蛋白和5种功能未知的蛋白。44种分泌蛋白中比较重要的分别是：20种抗原5相关蛋白、 2种α淀粉酶、2种麦芽糖酶、2种attactins抗菌蛋白以及血管舒张肽、过氧化物酶、 抗菌肽、透明质酸酶、mucin样蛋白和脯氨酸丰富蛋白。另外，一些不知道功能的分 泌肽也被发现,这其中包括四个与Hybomitra bimaculata的分泌肽相似性达47-82%的 多肽，这些信息有助于我们发现牛虻唾液腺活性物质和加快从知道部分氨基酸序列的 蛋白的鉴定速度，加快对姚虻从宿主获得血餐的分子机制的诠释速度。 通过分子筛、高压液相色谱等程序，我们从姚虻唾液腺中得到了一个由55 个氨 基酸组成，分子量为6 kDa，含有3 对二硫键的Kunitz 型丝氨基酸蛋白酶抑制剂TYTI。 该抑制剂与Anemonia sulcata 的蛋白酶抑制剂AsKC3 和SA5II 的成熟肽部分的同源 性达66%；并且该抑制剂，对热相对稳定；对凝乳酶、弹性蛋白酶、凝血酶、胰酶等 都有抑制作用，对胰酶的抑制常数为2.586ｘ10-4M 。 通过分子筛、高压液相色谱等程序，我们从姚虻唾液腺中得到了一分子量为7 kDa，由65 个氨基酸组成且含有3 对二硫键的防御素Taymin，它与长角血蜱的防御素的相 似性达43%，但它的第二个半胱氨酸比长角血蜱的半胱氨酸靠前一个氨基酸。该抗菌 肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和白色念球菌的最小抑菌浓度分别是: 160、80、140 和120μg/mL。 通过与分离丝氨酸蛋白酶抑制剂相同的生化分离手段,从姚虻唾液腺中得到一种 红细胞凝集素样活性物质TYML1，其能凝集原始和经胰酶、链霉蛋白酶和弹性蛋白酶 处理的A、B、O 和AB 血型的人、兔、绵羊、大鼠、小鼠、鹌鹑的红细胞, 对链霉蛋 白酶处理的鹌鹑红细胞的凝集效价比正常下降了8 倍；对热、酸、碱处理和蛋白酶降 解稳定；具有Ca2+依赖性，活性能为半乳糖胺和胎球蛋白所完全抑制。 通过分子筛、阴离子交换、高压液相色谱等程序，我们从姚虻唾液腺中分离得到 了一分子量为26 kDa,由234 个氨基酸组成，含有10 个半胱氨酸的血小板聚集抑制剂 Macquaritin-2,它与报道的所有血小板聚集抑制剂均不具有同源性，但是与双翅目昆 虫唾液腺过敏原却有一定的同源性(25%-33%),对其血小板聚集抑制活性研究发现:其 能抑制胰酶、花生四烯酸、Stejnulxin、TMVA、ADP、U46619 等激动剂诱导的血小板 聚集；血小板膜结合试验表明:其能与血小板细胞膜结合,故该血小板聚集抑制剂可能 通过作用血小板上的受体来阻止激动剂诱导血小板聚集。 通过分子筛、阳离子交换、高压液相色谱等程序，我们从姚虻唾液腺中分离得到 分子量为24-30 kDa 的两个血小板聚集抑制剂Macquaritin-3 和Macquaritin-1，它 们的N 端16 个氨基酸分别是V N Y C R L P C R G C D Y H V 和 V A V D Y L G L P G R G Y H V。通过PCR, Macquaritin-3 的核苷酸序列被得到，其推导蛋白的成熟区 和信号肽分别含有232 和23 个氨基酸。利用根据Macquaritin-1 的N 端氨基酸设计 的简并引物扩到含有V A V D Y L G L P 序列的两组核苷酸序列。它们与报道的所有 血小板聚集抑制剂均不具有同源性，但是其与双翅目昆虫的唾液腺抗原5 相关蛋白却 有一定的同源性。将所有血小板抑制剂及其相关序列和通过cDNA 文库筛选得到的抗 原5 相关序列进行分析,发现它们有很高的相似性,这种相似性介于33.3%-93.0%间, 且大部分高于50%。另外，两个血小板聚集抑制剂和一个可能的血小板抑制剂分别处 于这些抗原5 相关蛋白进化树的三个簇中。因此，我们推测这些过抗原5 相关蛋白可 能都具有血小板抑制剂活性。