AIDS 免疫治疗相关腺病毒载体的构建

艾滋病（AIDS）是人类免疫缺陷病毒（HIV）感染后引起的一种严重危害人类健 康的致死性传染病。抗HIV 药物挽救和延长了很多HIV 感染者的生命，提高了其生活 质量，但是仍然不能治愈AIDS 和预防传播。最终有效控制HIV 传播和感染的方法可能 仍将依赖于HIV 疫苗的应用。HIV 感染对感染者以及社会造成的灾难性后果使得发展 一个有效的艾滋病疫苗变得尤为紧迫和重要。 负载HIV-1 抗原的DC 回输到HIV-1 感染者体内可以诱导产生较强的抗HIV-1 细 胞免疫反应，这种免疫反应理论上和临床试验都表明治疗AIDS 有效，而且对HARRT 治疗能够产生很好的协同作用。我们拟用感染了重组腺病毒的DC，回输到HIV-1 感染 者体内，期望可以较好地控制病毒复制和阻止感染。为此，本研究我们制备了重组腺病 毒vAd-gp140、vAd-tat 和vAd-gp140-tat，为后续研究奠定基础。 结构蛋白Env 是激发抗体反应的抗原，由于Env 全长有较大细胞毒性，本文采用 了截短的gp140 分子，删除了gp41 的胞内段，降低了gp140 蛋白的细胞毒性。同时保 留了gp41 的跨膜区，表达的蛋白可被正确地锚定在细胞表面，提高蛋白的免疫原性。 将gp140 分子克隆到复制缺陷型的腺病毒载体中，用Wester Blotting 方法检测到gp140 在293 细胞中的表达。 有效的抗 HIV-1 的疫苗应该能够同时激发针对多种亚型病毒株的细胞和体液免疫 反应。早期病毒蛋白激发的CTL 应答在控制病毒载量上更为有效，而且Tat 蛋白的重 要免疫抗原表位和功能区域在不同HIV-1 病毒株之间是高度保守的。Tat 蛋白的多种生 物学功能使得它成为较强的免疫原、共抗原和佐剂，激发T 细胞抗原表位的Th1 型反 应和CTL 反应，扩大体内T 细胞识别的抗原表位谱，提高T 细胞特异性免疫反应。本 文扩增了HIV-1ⅢB 的tat 基因，克隆到复制缺陷性的腺病毒中，构建了重组腺病毒 vAd-tat，并在293 细胞中表达了分子量大小为15kDa 的蛋白。早期蛋白和结构蛋白的联合免疫能够全面地控制病毒复制，在动物实验中一定程度 上保护了猴子。我们将已得到表达的gp140 和tat 基因进行融合表达。利用融合PCR 技 术，扩增gp140 和tat 的融合基因，构建携有HIV-1 gp140-tat 融合基因的重组腺病毒 vAd-gp140-tat。gp140-tat 在293 细胞中的融合表达还需要进一步验证。 下一步的工作是将构建好的重组腺病毒感染DC，检测外源基因在DC 中的表达水 平，对DC 表面分子表型的影响以及对DC 功能的影响。

西夫韦肽和盐肤木提取物体外抗HIV 活性及机制研究

本论文主要由3 个相对独立的部分组成: 西夫韦肽抗HIV 活性机制研究及其 联合用药和耐药性研究，盐肤木提取物及其化合物抗HIV 活性机制研究和精子 顶体反应抑制剂AGB 抗HIV 活性及机制研究。 HIV 侵入抑制剂是抗HIV 药物研发的热点。该类抑制剂靶定在病毒复制周 期早期，为HARRT 疗法提供了更多新的药物组合，且该类抑制剂对临床中已产 生的耐药毒株也有较好的抑制作用。目前FDA 批准上市的侵入抑制剂仅有T-20， 急需开发新一类的HIV-1 侵入抑制剂。西夫韦肽是由36 个氨基酸组成的多肽， 我们对西夫韦肽进行了一系列体外抗HIV 药效学的实验来研究西夫韦肽体外抗 HIV 活性以及作用机制。实验结果表明西夫韦肽对多种HIV 宿主细胞毒性小， 可以有效抑制HIV-1IIIB 诱导的C8166 细胞的病变效应，EC50 值仅为7.8ng/ml ， TI 值大于 384,615;在不同的检测方法中，西夫韦肽均表现出了比T-20 更好的抑 制活性，EC50 值低了13-42 倍。在对HIV-1 临床分离株、耐药株、两株HIV-2 毒株和SIVmac239 的抑制活性研究表明西夫韦肽也可以很好地抑制 HIV-1 临床株 HIV-1KM018 的复制，EC50 值低至4.4ng/ml，对耐药株HIV-174V、HIV-2 和 SIVmac239 的复制也均有较好的抑制作用。 在机制研究中，我们发现西夫韦肽极有效地抑制HIV-1慢性感染H9细胞与 正常C8166细胞间的融合作用，EC50 低至0.4ng/ml，表明西夫韦肽可以以极低的 浓度有效抑制HIV进入宿主细胞。用GST-pull down 实验进一步验证了西夫韦肽 和T-20可以很好地与HR1结合而不能与HR2结合，作用机制就是特异地与gp41的 HR1结合从而抑制了6-Helix的形成，阻断了HIV的融合过程。由于HIV的高变异 性，单一药物治疗容易产生耐药性，最终导致治疗失败。因此在新药开发中进行 药物与作用靶不同的已上市药物体外联合用药和耐药性研究是非常必要的，将对 临床应用有指导意义，我们的实验结果表明西夫韦肽与AZT联合用药体外抗HIV-1作用较单独用药好，不同检测方法联合用药比单独使用西夫韦肽的效果好 8.3-9.4倍；耐药性研究表明其体外诱导耐药性产生的时间与T-20相仿，与T-20有 交叉耐药。 我国传统的中医药是个巨大的宝库，有丰富的临床经验，中医药治疗艾滋病 有着一定的潜力。从我国国情出发，利用中医药的独特性及经济性，开发传统的 具有我国特色的艾滋病治疗天然药物成为AIDS 防治工作的当务之急。盐肤木是 中国的本土植物，在我国民间用作传统医药有着悠久的历史。盐肤木茎提取物尤 其是石油醚提取部分RC-1 具有较好的抗HIV 活性，且作用于病毒复制周期的后 期，从中分离得到的化合物1、2、4、5 和6 都是RC-1 的活性成份；盐肤木茎 提取物乙酸乙酯提取物RC-2 中也有较好的抗HIV 作用，其中的化合物8、9、 10 和13 是抗HIV 的活性成分，且作用机制各不相同，这些有效化合物的抗HIV 机制值得进一步的研究。 杀微生物剂是一种局部用药于阴道或宫颈的药物制剂，由女性自主控制防止 性传播疾病病原体包括HIV 的感染，是近年来的研究热点之一。AGB(4`-乙酰胺 苯基 4-胍基苯甲酸酯)是顶体酶的抑制剂，我们的实验表明AGB 有很好的杀精 子作用，还具有体外抗HIV-1 的作用，作用机制主要是阻断HIV-1 进入细胞。

TRIM5α基因的分子进化及AIDS 免疫治疗相关腺病毒载体的构建

本文包括两方面的研究工作。第一部分对TRIM5α基因在灵长类动物中的分 子进化进行了详尽的研究，希望能从分子进化的角度认识该基因在灵长类动物抵 抗病毒感染尤其是在限制HIV-1 感染过程中所起的作用，并希望能够从中寻找适 合用于AIDS 基因治疗的基因。第二部分构建了艾滋病治疗性DC 疫苗相关的腺 病毒载体，包括表达HIV-1 gp120 基因、表达HIV-1 gp41 基因、表达HSP70 基 因以及仅表达绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒，为利用HIV-1 抗原刺激的DC 免 疫治疗AIDS 的研究奠定了基础。 在长期的HIV-1 和AIDS 研究中，人们发现很多种旧大陆猴不能被HIV-1 感 染，而旧大陆猴中的平顶猴却对HIV-1 有易感性，并且对SIV 的感染也表现出较 其它旧大陆猴更为严重的症状，TRIM5α基因的发现解释了这一“历史之谜”。人 们发现旧大陆猴的TRIM5α基因具有很强的抗HIV-1 的功能，是旧大陆猴抵抗 HIV-1 感染必须的免疫因子；并且进一步证明TRIM5α是灵长类动物中普遍存在 的、具有抗多种逆转录病毒功能的天然免疫因子。我们通过对TRIM5α基因在灵 长类动物中的分子进化研究发现，证明该基因在进化过程中表现出很强的达尔文 正向选择作用，尤其是其负责识别逆转录病毒衣壳蛋白的SPRY 结构域。TRIM5 α基因表现出的正向选择很可能是灵长类动物在长期的进化过程中反复被病毒 感染的选择压力造成的，这也从另一个方面证明TRIM5α基因是一个普遍存在的、 具有抗病毒功能的天然免疫因子。对不同灵长类动物的TRIM5α基因序列分析发 现，该基因的序列变化很大，这可能是不同灵长类动物被HIV-1 感染后表现不同 症状的原因；基于密码子的中性检测证明，TRIM5α基因SPRY 结构域上第347、 354、552 位氨基酸表现出很强的正向选择，说明这些位点可能与其抗病毒功能 关系紧密。另外，我们发现平顶猴的TRIM5α基因与CypA 基因以一种新的方式 融合，这种融合方式不同于鹰猴中该基因与CypA 基因的融合，而且与具有较强抗HIV-1 功能的恒河猴的TRIM5α基因比较，平顶猴的TRIM5α基因在几个与其 抗病毒功能紧密相关的位点上的氨基酸也发生了变化，这可能是其被HIV-1 和 SIV 感染后表现出较其它旧大陆猴更为严重症状的原因。 将经过HIV-1 抗原刺激的DC 回输到HIV-1 感染者体内可以诱导产生较强的 抗HIV-1 细胞免疫反应，这种免疫反应理论上可以治疗AIDS，而且对HARRT 治 疗能够产生很好的协同作用；HSP70 蛋白可以提高DC 对抗原的加工和呈递。为 了检测经HIV-1 抗原刺激的DC 免疫治疗AIDS 的实际效果，同时检验通过HSP70 增强DC 对HIV-1 抗原的加工和呈递功能，发现并解决这一治疗方案存在的问题， 我们首先从HIV-1 的基因组及带有HSP70 基因的质粒上克隆了gp120、gp41 和 HSP70 基因，测序及序列分析证明所克隆的基因没有发生影响表达的突变。然后 我们分别构建了表达有关基因的重组腺病毒载体。在荧光显微镜下可以观察到感 染后的细胞内绿色荧光蛋白报告基因的表达，证明成功构建了四种重组腺病毒， 而PCR 扩增也证明在其中三种重组腺病毒的基因组上确实分别带有gp120、gp41、 HSP70 基因。同时我们还构建了不表达外源基因的重组腺病毒，作为未来实验中 的对照载体。未来的研究工作包括目的基因表达检测，重组腺病毒感染DC 及腺 病毒感染DC 功能分析等。