棉花抗虫基因工程研究

本文通过根农杆菌（Agrobacterium tumfaciens）介导法分别将Signal和KDEL修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂（Cowpea trypsin inhibitor, CpTI）基因、豌豆外源凝集素（Pea lectin, P-Lec）和大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂（Soybean Kunitz typsin inhibitor, SKTI）双价抗虫基因、雪花莲外源凝集素（Galanthus nivals agglutinin, GNA）基因以及高效复合启动子OM控制的苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis, B.t.）杀虫毒蛋白基因导入了陆地棉（Gossypium hirsutum L.）栽培品种新陆早1号、新陆中2号、晋棉7号、冀合321、辽9和晋棉12号，并获得了大批转基因再生植株。 实验中对影响棉花转化和再生的一些条件进行了研究，从根农杆菌培养、棉花无菌苗的制备、转化操作和共培养等方面对转化条件进行了探讨;从激素配化、植物表达载体、外植体类型、基因型等方面对抗性愈伤组织的诱导进行了摸索;从激素、从碳源、培养容器、pH值、抗褐化剂及固化剂的选择等方面对影响植株再生的条件进行了优化。 本文开创性地采用嫁接代替移栽，从而极大地提高了转化植株定植成活率，缩短了缓苗时间并增加了转化植株当代的繁殖系数。 在建立了一套较为高效的陆地棉转化及再生系统基础上，本文还进行了其它转化方式和转化体系的初步探讨。利用棉花幼嫩种子无菌苗下胚轴作为外植体，通过改变愈伤组织诱导培养基配方面提高胚性愈伤组织的诱导频率，进而得到更多的体细胞胚状和再生植株，缩短再生周期;尝试用胚性愈伤组织作为外植体的根农杆菌介导法转化，确定了一些与转化有关的条件;建立了一套棉花茎尖培养程序，为运用基因枪法轰击棉花茎尖分生组织或用根农杆菌直接转化茎尖分生组织，以克服根农杆菌转化棉花时体胚发生的基因型局限开辟了一条新途径。 本文还建立了一种快速鉴定转化植株后代的方法。这一简便方法还有助于进行转基因棉纯合系的筛选以及外源基因的遗传稳定性研究。 转基因植株经Npt-II ELISA、PCR、PCR Southern 检测证明外源抗虫基因CpTI、SKTI、P-lec、GNA以及B.t.基因已存在于转化植株基因组内。修饰的CpTI转基因植株抗棉铃虫（Heliothis armigera Hubner）试验结果表明，其杀虫效果显著优于前期未修饰的CpTI转化植株。P－lec和SKTI双价转基因植株抗棉铃虫试验结果表明，转基因植株对棉铃虫幼虫具有较强的杀虫活力。 目前，已获得转以上抗虫基因棉花T1代植株。为今后进一步将植物基因工程技术应用于棉花遗传改良打下了基础。

陆地棉抗虫基因工程研究

以陆地棉（Gossypium hirsutum L.）栽培品种新陆早4号、系550、冀资492、衡无89-30、邯93-2、冀资123等为材料，进行了组织培养及植株再生研究，建立了一套陆地棉体细胞植株再生速成体系。通过调整激素种类与比例以及改善培养条件，降低了畸形胚发生频率（从80%降为41%），并可将畸形苗转化为正常苗（转化率约为78%）;通过水培和嫁接，结合试管扦插、扩繁技术，解决了棉花生根及移栽难题，为农杆菌介导法转化棉花奠定了基础。 用绿色荧光蛋白基因（gfp）作为报告基因，构建了pBGb1m（含Bt和gfp二价基因）、pBGbf（含Bt-gfp融合基因）和pBGbfg（含Bt-gfp融合基因和gna基因）等三种植物表达载体。通过农杆菌介导法转化烟草，转基因再生植株经过荧光、虫试、PCR、Southern blot和Western blot等检测，表明三种植物表达载体能够在转基因植物中有效表达，同时，绿色荧光蛋白（GFP）的检测表现出了简便、经济、快速、可靠等优点，为大量棉花转基因苗的检测提供了一种有效方法。 采用花粉管通道法将携带细胞间隙定位信号肽的Bt基因的pBin438-S1m质粒导入棉花品种冀资492，经过田间卡那霉素筛选、虫试、PCR、PCR-Southern blot和Southern blot检测，证明Bt基因已整合至棉花基因组中，而且可能是以单拷贝形式插入。 同时，通过农杆菌介导法将三种植物表达载体（pBGb1m、pBGbf和pBGbfg）转化陆地棉栽培品种新陆早4号、冀资492、衡无89-30和邯93-2等材料，获得了大量转化再生棉株。经过PCR和PCR-Southern blot检测，转基因阳性植株为转为再生植株总数的89.45%。目前，虫试、Southern blot及Western blot正在进行之中。

棉花抗黄萎病基因工程研究和防卫反应相关基因的克隆

系统获得性抗性(Systematic acquired resistance, SAR)是植物抵御病原菌侵染的最有效手段，利用基因工程技术导入SAR信号发生过程中的关键基因后，植物的SAR基因表达量提高并且对病原菌侵染的反应速度加快，因此植物的抗病性得以增强，与传统的抗病基因工程技术相比它对病原菌没有专一性，许多学者称之为广谱抗病基因工程，该领域已成为目前抗病基因工程研究的热点和前沿。 NDR1和NPR1基因在植物的SAR发生中起着重要的作用，前者功能定位在ROS(reactive oxygen species)的激活和随后的水杨酸(SA)诱导合成之间，突变株病原菌诱导后SA合成能力降低，SAR发生减弱，目前还没有对该基因进行过量表达分析的报道;后者功能定位在SAR信号转导级联反应之中的SA积累和随后的SAR基因表达之间。该突变株在病原菌侵染时不产生病程相关蛋白(PRs)，表现为感病，而对照抗病;过量表达该基因的转基因拟南芥对多种病原菌的侵染产生抗性，PR1等PRs蛋白的表达量也提高，异源表达该基因的水稻对白叶枯病的抗性也提高。本研究利用RT-PCR方法从拟南芥中克隆了这两种基因，序列分析表明拟南芥Wassilewskija生态型的NDR1基因与Columbia生态型相比，共有7处碱基不同，引起编码氨基酸变化4处，而NPR1基因与报道的Wassilewskija生态型来源的NPR1基因完全相同。 我们构建了35S启动子驱动的NDR1和NPR1基因的植物组成型高效表达载体，利用农杆菌介导法转化烟草，PCR和Southern鉴定外源基因已经整合到植物基因组中。抗病性分析显示过量表达NDR1和NPR1基因的烟草对晚疫病和赤星病的抗性都有明显提高，说明这两个基因的在其它植物中异源表达后，都能提高植物对多种病原菌的抗性。 本论文提出了利用这两个基因来培育抗黄萎病棉花的设想，一方面为解决这个“世纪性”难题积累新的资料，另一方面也为其它作物的抗病基因工程提供新的经验。利用35S启动子驱动的NDR1和NPR1基因的植物组成型表达载体分别对陆地棉品种石远321进行花粉管通道法转化。同时，还探讨了这两个基因在棉花中的共转化实验，希望它们的“协同增效”能进一步提高棉花的抗病性。对其中2001年夏天在南京注射所获得的5,000粒种子在三亚进行100 g/ml卡那霉素筛选，初步鉴定分别获得转NDR1和NPR1基因株系26和24棵，PCR进一步鉴定其中分别有12和7棵为转基因阳性，转基因频率分别为0.50％和0.27％，目前利用营养钵蘸根法对其二代进行抗枯、黄萎病鉴定，结果显示有转基因植株对枯、黄萎病的抗性都明显增强，进一步的鉴定正在进行中。2002年初海南注射分别获得转NDR1和NPR1基因以及共转化种子22,000、10,500和12,500粒种子，2002年夏在中国农科院植保所黄萎菌病圃筛选抗黄萎病单株，并利用100 g/ml卡那霉素初步筛选出了一批抗性植株，每种转基因株系随机挑选5株进行PCR鉴定，结果显示为阳性。进一步的抗黄萎病鉴定和筛选以及分子分析正在进行中。 同时，本文还探讨了病原菌诱导型启动子在广谱抗病基因工程应用的可能性。根据烟草的Pr1-a启动子已知序列设计引物，PCR扩增启动子序列后,构建病原菌诱导型NPR1基因植物表达载体，并对棉花进行转化，获得种子11,500粒，利用同上的筛选方法，获得了一致的结果，目前抗黄萎病鉴定、分子检测以及生物学分析正在进行中。 最后，鉴于抗生素标记在转基因植物的应用引起了许多“安全性”争论的事实，还构建了无筛选标记的表达载体对抗虫棉进行转化，这样在生产上可以直接获得抗虫棉抗黄萎病棉花新材料，也为其它作物抗病基因工程积累经验。 本研究还提出了一种较为有效的提取高质量棉花总RNA的方法，与原来一些棉花RNA纯化方法相比，该方法所用都为常规试剂，易于重复，质量高。并且利用获得的总RNA构建了黄萎菌激发子诱导的cDNA文库，滴度测定为1╳107pfμ/μg，插入片段大小在5 00~2 000 bp范围内。 鉴于NPR1基因研究的重要性，本研究还利用简并引物PCR技术从海岛棉和陆地棉的基因组中都分离到了NPR1基因的同源片段，大小都为208 bp，与拟南芥NPR1基因的相应部分的同源性分别为66％和65％，它们之间的同源性为87％，目前该基因的全长正在分离鉴定中。 多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIPs)在植物的防御反应中起着重要的作用，通过分析已知20余种pgip基因序列的保守区，设计简并引物，PCR扩增海岛棉（Gossypium barbadense）7124 cDNA文库，得到一条长561 bp的片段，序列测定后分析确认为pgip基因的一部分。根据此序列和棉花病原菌诱导的cDNA文库载体中已知部分设计RACE引物，扩增后，5’和3’RACE分别得到666bp和906 bp的片段。序列分析表明它具有完整的编码框，产物为330 aa的蛋白质。序列分析该蛋白具有10个串联的LRR(leucine-rich repeat)区，与柑桔(Citrus)和枳(Poncirus)的pgip基因的同源性分别为69.2%和68.7%。进一步PCR扩增得到该基因的全长阅读框，并且获得了相应的基因组片段，序列分析发现该基因没有内含子。这是从棉属植物中克隆的第一个pgip基因。

棉纤维发育相关基因的克隆和鉴定

棉纤维是棉花子房内的胚珠外珠被上的一种单细胞表皮毛.为了解胚珠表皮细胞发育启动为棉纤维的分子控制机制,我们用同源克隆的方法,从棉纤维发育早期的幼嫩子房和胚珠中克隆到了72个棉花MYB基因.序列分析的结果表明它们属于MYB转录因子家族的55个成员,其中有一个MYB蛋白-GhMYB9的氨基酸序列与控制拟南芥单细胞表皮毛的发育启动基因GL1和WER高度同源.它们之间的序列一致性,不仅表现在保守区-DNA结合区,而且也表现在5’和3’的非保守区内.根据序列相似功能相似的原理,我们推测GhMYB9很可能是控制棉纤维发育启动的一个MYB基因.对GhMYB9的Southern杂交结果表明,该基因在棉花基因组中是单拷贝基因;对它的Northern表达分析可知,该基因在花前5天的子房、花前3天的胚珠、花期及花后3天的胚珠中都有表达,但在花前3天的棉纤维发育启动期（我们的扫描电镜结果）高表达.此外,还构建了一个陆地棉可转化人工染色体TAC文库,并通过PCR的方法从中筛选到了含有GhMYB9的TAC克隆.这些结果为进一步对GhMYB9做功能分析、揭示棉纤维发育启动的分子机制奠定了了事实上的基础.

变水处理与短期遮荫对作物水分利用效率的影响

变水处理与短期遮荫对棉花水分利用效率的影响研究表明 ,在充分供水 -水分胁迫 -复水的变水处理过程中 ,短期遮荫使净光合速率、蒸腾速率、水分利用效率降低 ;光照 -遮荫 -光照期间 ,总的水分利用效率以水分胁迫的最高 ,充分供水的次之 ,复水处理最低 ,其中遮荫 40 %的水分利用效率高于遮荫 75%的处理 .回归分析表明 ,水分利用效率与光合速率表现出极显著正相关 ,两者回归直线的斜率随水分胁迫而增大 ,而水分利用效率与蒸腾速率的关系较弱 ,多数处理两者相关达不到显著水平

土壤水分与短期遮光对棉花光合及其气孔响应的影响

以陆地棉 (Gossypium hirsutum L.Zhongmain No.2 3)为供试材料 ,探讨了在充分供水-水分胁迫 -复水的处理过程中 ,短期不同遮光水平对棉花光合特性及其气孔响应的影响。结果表明 ,在水分处理过程中 ,所有不同遮光水平的棉花叶片对短期遮光具有相似的基本响应规律 :短期遮光使净光合速率迅速降低 ,气孔导度减少 ,但减少速率缓慢 ;遮阳网去掉后 ,叶片气孔重新开放速率和光合恢复被延迟。水分胁迫期间 ,所有遮光处理的水分利用效率均最高 ,但净光合速率均较低 ,光合及其气孔响应受到严重限制 ,遮光 75%受到的影响大于遮光 40 %的处理。复水后水分胁迫带来的残留影响仍然存在 ,结果使水分利用效率在整个水分处理过程中最低 ,遮光 75%的处理尤为明显。上述表明 ,土壤水分与短期遮光对棉花光合及其气孔响应的影响十分显著