大熊猫线粒体DNA的九种限制酶图谱

用9种限制性内切酶分析大熊猫的线粒体DNA(mtDNA)。构建其中5种酶(BamHI 、EcoRI、EcoR V、Ps+I、PvuⅡ)的mtDNA物理图谱。大熊猫mtDNA的分子大小约 为16.4kb, 酶切位点是随机 分布的。图3表2参15

水霉菌总DNA提取方法研究

本实验采用EP管反复冻融和研磨的破壁方式,利用溶菌酶法、CTAB法、改良CTAB法、尿素法、十二烷基硫酸钠(SDS)法等5种方法,分别对5种鱼类致病性水霉菌(寄生水霉、多子水霉、异株水霉及两未定种)的基因组DNA进行提取,并采用紫外分光光度计和ITS区基因(包括5.8SrDNA)PCR扩增对DNA进行了评价。紫外分光光度计检测结果表明,5种方法均可提取到水霉菌DNA,其中改良CTAB法提取的5种水霉菌的DNA产量和质量最高,A260/A280在1.79—1.82之间,浓度为45μg/mL;PCR检测结果表

雌核发育银鲫两个不同品系线粒体DNA比较

于 1 996年 4月在中国科学院水生生物研究所关桥实验场取得银鲫E系 ( 8♀ ,2♂ )和D系 ( 9♀ ,1♂ )的卵巢 (♀ )或肝脏 (♂ )组织 ,分离纯化其线粒体DNA ,以此为材料 ,用 2 5种限制性内切酶分析了银鲫这两个雌核发育系的线粒体DNA ,构建了两系鱼mtDNA的 1 9种酶 41个位点的酶切图谱。统计比较酶切片段的大小 ,发现 5种内切酶 (AvaⅡ ,BamHⅠ ,BglⅠ ,SphⅠ ,XbaⅠ )酶切位点在两个雌核发育系间存在差异。这些多态性 ,既可以作为区分两个雌核发

DNA加合物研究及在环境毒理学中的应用

致癌物在生物体内经解毒系统诱导与生物体内的DNA形成加合物,DNA加合物综合反映了生物体对致癌物的暴露、吸收、分布、代谢以及机体对DNA的修复能力,是致癌物有效作用的量度,与致癌作用直接相关。目前较多用于DNA加合物测定的方法是~(32)P后标记技术。DNA加合物作为一项反映人群暴露于致癌物的指标在肿瘤分子流行病学研究中得到了较好的应用,鱼与哺乳动物一样可活化致癌物形成DNA加合物,由于解毒系统不完善及DNA修复能力差而对致癌物特别敏感,因此鱼及其他水生动物的DNA加合物研究受到重视并且一直引人注目。

Oligonucleotide ligation assay-based DNA chip for multiplex detection of single nucleotide polymorphism

An oligonucleotide ligation assay-based DNA chip has been developed to detect single nucleotide polymorphism. Synthesized nonamers, complementary to the flanking sequences of the mutation sites in target DNA, were immobilized onto glass slides through disulfide bonds on their 5' terminus. Allele-specific pentamers annealed adjacent to the nonamers on the complementary target DNA, containing 5'-phosphate groups and biotin labeled 3'-ends, were mixed with the target DNA in tube. Ligation reactions between nonamers and pentamers were carried out on chips in the presence of T4 DNA ligase. Ligation products were directly visualized on chips through enzyme-linked assay. The effect of G:T mismatch at different positions of pentamers on the ligation were evaluated. The results showed that any mismatch between pentamer and the target DNA could lead to the decrease of ligation, which can be detected easily. The established approach was further used for multiplex detection of mutations in rpoB gene of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates. (C) 2003 Elsevier B.V. All rights reserved.

DNA、纳米微粒及其相互作用的扫描探针显微学研究

1．采用改进的蒸发液滴中流体毛细流动法，用于展开和固定适于AFM研究的大环状DNA。对长达148.9 kbp的人类基因组3号染色体上一个完整的酵母染色体DNA分子和pB孙22质粒DNA进行了展开固定研究，长度测定显示偏差小于3.5％，结果优于其它展开线性DNA的方法。对其相应的展开机理进行了初步探讨：利用AFM考察了不同长度的DNA分子在云母基底上的分子级分形图案。实验证明DNA分子级的分形图案与DNA的浓度、长度和其它辅助因素相关。我们认为DLA理论或许更适合描述DNA分子在云母基底上形成不同分形图案的体系。2．我们利用阳离子的桥合作用，将质粒DNA固定并展开在云母基底上制得了DNA网络结构。结合实验数据，对质粒DNA形成的机理和可控的参数：离子种类、离子浓度、网孔大小和网孔高度进行了讨论，提出了相应的模型进行解释。我们在半透明的云母基底以及玻璃和蓝宝石等透明基底上构建了不同结构的DNA网络。结合实验数据，讨论了在各种固体基底上形成DNA网络的影响因素，我们认为，固体基底表面的亲水性对于构建DNA网络起重要作用。我们通过控制乙醇的浓度与温度结合原子力显微镜样品定位技术发现，云母基底上形成DNA膜的DNA分子是否移动与处理DNA样品的乙醇浓度有直接关系。对于纯乙醇溶液无论是高温（6O℃）或常温，均未引起DNA分子的移动（无论是吸附在云母基底上的，还是吸附在DNA分子链上的）；如果用混合有水的乙醇溶液（无论其中水的含量多少），不管是高温（60℃）或常温，都会引起DNA膜结构发生变化，即DNA分子发生了移动。热乙醇水溶液对DNA分子的作用比常温情况下更明显1可能是热力学上的因素导致的。3．通过控制银纳米微粒在云母基底上的聚集行为，而非直接通过化学合成的方法，构建了一种新的银结构一纳米银盘。详细阐述了如何得到这种结构的过程，通过原子力显微镜、紫外可见光光谱和X一射线电子能谱技术等工具对其性质也作了相应的表征。这种由纳米粒子组成的银盘与文献报道的单晶纳米银盘相比具有更大的比表面积，在纳米催化等方面有更广阔的应用前景。通过自聚集方式构建纳米银盘结构的方法，对于人们通常认为在溶液中合成的纳米结构与在各种固体基底上表征的纳米结构是一致的观点提出了新的理解。利用戊二醛试剂与发光的纳米微粒萘酰亚胺通过醛胺加成反应形成酰胺键，组装形成二维发光粒子网络。结合原子力显微镜高度形貌图和光谱数据，发现粒子间形成了两种典型的网络结构即，实心六方堆积和空心六方堆积结构。对此我们提出了相应的模型给予解释。4，利用展开的质粒DNA为模板诱导形成了环状的氯化镁纳米结构。原子力显微镜考察表明，这些纳米结构的高度是6.2±1.3-8.2±1.80nm，长度为1.35±0.18到2.93±0.25um。我们以CTAB包裹18nm纳米金和3.5nm纳米银使之形成带正电荷的外壳，利用。NA磷酸骨架带负电荷特性，通过静电自组装方式形成了金属化的纳米网络结构。通过AFM、UV-vis光谱和XPS谱的表征说明，带正电荷外壳的纳米金和纳米银被DNA模板高度地组装形成有序的二维网络结构。5．利用自制的样品定位系统，重复性地对整个基底范围内的样品实行定位，定位的精确度达400nm。这种方法对于样品旋转角度或取出后进行进一步处理都适用。该定位方法依赖于一台个人电脑，一个样品定位仪，一个CCD相机和一套可视光学系统，用于监测透明或半透明基底如，云母、玻璃、蓝宝石、石英和钦酸银等原子力显微镜广泛使用的基底表面或背面特征。作为对这种定位方法的应用，我们用不同的灯M操作模式，不同的针尖对单个的DNA分子、单个的DNA-蛋白质复合物和DNA网络在样品移动或拿出样品台后进行了定位实验。这种方法的精度和分辨率，对于一般的商用或自制SPM（AFM,STM，sNOM）系统都可以适用。

(1) Barnase、Barstar基因和TA29基因5'区调控顺序的PCR扩增、克隆和测序（2）水稻花粉核蛋白因子与TA29基因5'区调控顺序的相互作用

本文运用PCR技术，分别从烟草和B. amyloliquefaciens的基因组DNA中扩增出了TA29基因5'区调控顺序、Barnase和Barstar基因，克隆后进行序列分析，表明其核苷酸顺序与文献报道的一致，然后进行了初步的融合基因的构建。另外，凝胶滞后实验表明，水稻花粉（含绒毡层组织）细胞核中某种蛋白因子能够与TA29基因5'区调控顺序发生特异的结合。本文还对TA29基因5'区调控顺序及Barnase和Barstar基因的潜在应用价值和存在的问题进行了讨论。

~(12)C~(6+)离子束诱导HeLa细胞DNA损伤效应

本文研究了HeLa细胞经过12C6+离子束辐照之后的DNA损伤效应,及辐照后p53激活的分子机制。运用中性单细胞电泳技术,检测了HeLa细胞经过4Gy 12C6+离子束辐照间隔0、3、6和12h之后DNA的损伤情况,及0.5、1、2和4Gy 12C6+离子束辐照后即时的DNA损伤情况。同时运用细胞生长实时监测仪监测了HeLa细胞在经过0、0.5和1Gy 12C6+离子束辐照之后的生长变化,并运用AO/EB双染检测了辐照细胞24h后的凋亡情况。另外,利用8mmol/L的咖啡因[抑制ATM(ataxia-telangiectasia,mutated)和ATR(ATM and Rad3-related kinase)]和20μmol/L的wortmannin[抑制ATM和DNA-PK(DNA-dependent protein kinase)]处理HeLa细胞后再进行1Gy 12C6+离子束辐照,通过westernblot检测p53的表达。结果显示,12C6+离子束辐照可造成HeLa细胞的DNA损伤,损伤随剂量升高而升高但随测定间隔时间降低,诱导HeLa细胞发生凋亡;而且辐照后p53表达升高。结果证明12C6+离子束辐照可造成HeLa细胞的DNA损伤并诱导损伤修复及凋亡等效应,损伤效应相关因子p53被激活,并且激活依赖于ATM。

镉胁迫对蚕豆幼苗基因组DNA多态性的影响

采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术检测镉(Cd)胁迫对蚕豆幼苗根尖DNA多态性的影响。结果表明,不同浓度(2·5、5和15mg·L-1)镉处理7d后,蚕豆幼苗根伸长及根系中可溶性蛋白质含量均受到了抑制。选用12条寡核苷酸引物(10bp)对蚕豆幼苗根尖细胞中基因组DNA进行RAPD扩增,其中有6个引物产生特异性PCR产物。对照组蚕豆幼苗根尖基因组DNA的RAPD图谱中可分辨出86条RAPD谱带,其分子量为200~2520bp。处理组与对照组RAPD图谱之间存在明显差异,且与镉浓度之间存在剂量-效应关系。这些结果表明,镉影响蚕豆幼苗根尖细胞中基因组模板的稳定性,故利用RAPD技术获得的DNA多态性变化可作为检测镉遗传毒性效应的生物标记物。

抗癌药与DNA相互作用的电喷雾质谱研究

为了进一步阐明抗癌药与DNA结合的序列选择性和结合本质,用电喷雾质谱方法研究了抗癌药与DNA的相互作用,这些药物包括小沟结合剂(偏端霉素A,DM和纺锤霉素,NP)和嵌入剂(米托蒽醌,MT)。DM与AT富有的DNA主要形成2∶1的特异性复合物,NP只形成1∶1的特异性复合物;MT倾向与GC富有的DNA特异性结合。另外,DM与带5个A/T碱基小沟长度的DNA几乎以2∶1结合,而与带3个A/T碱基的DNA未见结合,而NP与带4个A/T碱基的DNA结合能力最强。MT还与6-mer DNA形成了1∶1特异性复合物。竞争结合实验证明,DM和NP与AT富有的DNA的键合顺序为NP>DM。这些结果为深入研究抗癌药物的作用机制和改进目标药物结构提供了依据。

Energetic basis of molecular recognition in a DNA aptamer

The thermal stability and ligand binding properties of the L-argininamide-binding DNA aptamer (5'-GATCGAAACGTAGCGCCTTCGATC3') were studied by spectroscopic and calorimetric methods. Differential calorimetric studies showed that the uncomplexed aptamer melted in a two-state reaction with a melting temperature T-m = 50.2 +/- 0.2 degrees C and a folding enthalpy Delta H degrees(fold) = -49.0 +/- 2.1 kcal mol(-1). These values agree with values of T-m = 49.6 degrees C and Delta H degrees(fold) = -51.2 kcal mol(-1) predicted for a simple hairpin structure. Melting of the uncomplexed aptamer was dependent upon salt concentration, but independent of strand concentration. The T of aptamer melting was found to increase as L-argininamide concentrations increased. Analysis of circular dichroism titration data using a single-site binding model resulted in the determination of a binding free energy Delta G degrees(bind) = -5.1 kcal mol(-1). Isothermal titration calorimetry studies revealed an exothermic binding reaction with Delta H degrees(bind) = -8.7 kcal mol(-1). Combination of enthalpy and free energy produce ail unfavorable entropy of -T Delta S degrees = +3.6 kcal mol(-1). A molar heat capacity change of -116 cal mol(-1) K-1 was determined from calorimetric measurements at four temperatures over the range of 15-40 degrees C. Molecular dynamics simulations were used to explore the structures of the unligated and ligated aptamer structures.

DNA与生物碱类化合物非共价作用的负离子电喷雾质谱研究(Ⅰ)

目前 ,临床上使用的许多抗病毒药物均是通过与 DNA,RNA发生相互作用破坏其结构 ,进而影响基因调控与表达的功能 ,表现出抗病毒活性 [1,2 ] .因此 ,核酸与药物分子相互作用的研究对阐述抗病毒药物的作用机理 ,以及对药物的体外筛选都具有重要的意义 .电喷雾电离质谱作为一种软电离手段 ,可将溶液中生物分子与药物分子的非共价复合物转为气相进行分析 ,再现其生理状态 ,使其成为分子水平上进行药物筛选的最佳方法 [3～ 6 ] 和在分子水平上筛选中药抗病毒活性成分的理想工具 .本文选择合成了与 SARS病毒相关的 DNA片段作为抗病毒药物筛选的靶分子 ,用电喷雾质谱技术 ,通过对靶分子与 5种生物碱的非共价复合作用 ,探讨了生物质谱方法用于药物筛选的可行性 .1　实验部分1 .1　材料及样品制备　 DNA分子系人工合成 ,由 1 5个碱基组成 ,分子量为 470 4 ,结构为 GGTAA-GATGGAGAGC( 1 5 - mer) ;腺苷 ( Adenosine,Mw=2 67)、鸟苷 ( Guanosine,Mw=2 83)和胞苷 ( Cyti-dine,Mw=2 4 3)购自 Sigma公司 ;小檗碱、...

溶液pH对硫堇与DNA相互作用方式的影响

用电化学和光谱方法研究了溶液pH对硫堇(TH)与小牛胸腺脱氧核糖核酸(CT-DNA)相互作用方式的影响。电化学测量结果表明,在pH 7.2的磷酸盐缓冲溶液中,TH与CT-DNA之间的作用方式以嵌入结合为主,在pH6.5的磷酸盐缓冲溶液中,TH与CT-DNA之间的作用方式既存在嵌入结合也存在静电作用。荧光光谱测量结果表明,TH与DNA结合后其荧光发生猝灭,通过Stern-Volmer方程计算得到pH 6.5时TH-DNA体系的猝灭常数高于pH 7.2时的值,表明在pH 6.5的溶液中两者相互作用更强。圆二色谱(CD)实验结果也证实了这一结论。

锗-132的稀土配合物对5'-腺嘌呤及5’-脱氧腺嘌呤核苷酸的水解断裂作用

核酸是重要的生命物质,对核酸序列的选择性切割是当前基因工程的关键问题.在生理条件及非酶存在下,核酸非常稳定(磷酸二酯键在pH 7,25℃时的半衰期为2亿年,因此,近年来研究的人工酶是通过氧化脱氧核糖来切断DNA的,而有关选择性水解断裂核酸的报道则很少,主要困难是缺乏高效的“分子剪刀”,有关稀土对核酸断裂的研究报道尚不多见.作者曾报道了除Ce(Ⅳ)外,其他稀土对5’-腺嘌呤核苷酸(5’-AMP)及5’-鸟嘌呤核苷酸(5’-GMP)均无明显水解作用,并且过去报道的体系为碱性介质,此时稀土以氢氧化物沉淀形式存在为非均相体系,其应用局限性非常大,因此,寻求可溶性的稀土水解核酸体系就显得非常重要.本文用核磁共振(NMR)和化学法研究了Yb-Ge-132和Pr-Ge-132配合物对5’-AMP及5’-dAMP的断裂作用,指出Yb-Ge-132和Pr-Ge-132使5’-AMP水解为腺苷(A)及无机磷,使5’-dAMP水解为脱氧腺苷(dA)及无机磷,其断裂机制为水解断裂,这对于研究稀土与核酸的作用,寻找新的核酸均相水解体系都具有非常重要的意义.