羽叶铁线莲杂交起源的初步研究

通过野外观察，发现羽叶铁线莲Clematis pinnata Maxim.在形态上相似于短尾铁线莲C. brevicaudata DC.及大叶铁线莲C. heracleifolia DC.，推测羽叶铁线莲为后二者杂交产生。本文从形态学、解剖学、孢粉学、分子生物学等方面寻找证据，为这一推测寻找证据： 1． 形态学 通过野外观察结合标本馆工作，对这三个种的外部形态性状及其变异进行全面的分析，以探讨羽叶铁线莲C. pinnata在形态上与二假定亲本的异同及其产生原因。发现花、叶、习性等性状，在二假定亲本种种内稳定，但种间差异很大，在羽叶铁线莲中，性状变异的幅度正是处于二假定亲本差异之间。 2．解剖学 在光学显微镜及扫描电镜下，观察了这三种铁线莲的叶表皮特征，结果表明：叶片上表皮均不具有气孔器，下表皮气孔器类型均为无规则型;表皮细胞多为不规则形，仅在短尾铁线莲C. brevicaudata的上表皮中为近多边形;上表皮角质膜均具细条纹，下表皮角质膜均具环状或放射状波状嵴。 在扫描电镜下对瘦果形态及宿存花柱进行观察，结果表明：瘦果均密被长柔毛，并有蜡质颗粒状附属物。 在三个种植物之间叶表皮和瘦果的特征均无明显差别，对解释所讨论的问题意义不大。 3．孢粉学 在扫描电镜下对这三种铁线莲的花粉粒进行观察，结果表明：短尾铁线莲的花粉粒具三沟;大叶铁线莲的杂性株中花粉高度败育，说明其杂性株其实即为雌株;羽叶铁线莲的花粉也高度败育，但本种均为两性株，支持本种为杂交种的推测。 4．等位酶研究 利用莽草酸脱氢酶SKD和苹果酸脱氢酶MDH对采自3个居群的羽叶铁线莲大叶铁线莲和短尾铁线莲进行等位酶试验，结果显示在短尾铁线莲与大叶铁线莲中分别出现种内一致的谱带，而羽叶铁线莲则显示出二者杂合的带型。这一结果有力的支持了羽叶铁线莲是由短尾铁线莲和大叶铁线莲杂交产生的推测。 5．居群遗传结构分析 利用随机扩增多态性DNA标记（RAPD）分别检测三个种的遗传多样性和居群遗传结构。15个随机引物对这三个种共160个个体 （短尾铁线莲C. brevicaudata 五个居群73个个体;大叶铁线莲Clematis heracleifolia五个居群75个个体;羽叶铁线莲Clematis pinnata三个居群12个个体。）进行分析，总共得到123个用于分析的条带。我们对这三个种扩增出的条带按照居群进行了聚类分析，结果表明这三个种在聚类树上能够很好的区分开，但是种内居群间没有表现出地理分布式样方面的信息;个体水平上聚类结果表明，百花山采到的7株无法确定的铁线莲幼苗有6株是短尾铁线莲C. brevicaudata另外一株是羽叶铁线莲Clematis pinnata，这说明在幼苗形态上二者差别不大;我们对这三个种分别进行了居群遗传结构的分析，结果表明：短尾铁线莲C. brevicaudata的多态条带比率为90.65％，遗传变异主要分布在居群内，居群间分化较小，而大叶铁线莲Clematis heracleifolia的多态条带比率为90.76％，居群间遗传变异占30.52％，居群间有明显分化。羽叶铁线莲Clematis pinnata的遗传多样性很低，有可能是由于营养繁殖造成的。 6．DNA序列分析 选取叶绿体基因组的trn L－F序列和核基因组的ITS序列进行了测序分析。发现从三个种十个个体得到的trn L－F序列之间几乎没有差异，在640 bp中只得到了3个信息位点。对ITS测序过程中发现短尾铁线莲可直接用PCR产物测序，而对大叶铁线莲和羽叶铁线莲必须进行克隆测序，由于时间关系，我们得到的序列不足以进行进一步分析。 基于以上研究结果，我们初步认为羽叶铁线莲是通过短尾铁线莲和大叶铁线莲的杂交而起源，并根据我们观察到的变异式样对羽叶铁线莲系的一些种类进行了分类学处理。

铁线莲属尾叶铁线莲组的修订－兼论铁线莲属基于花粉形态学证据的系统发育

铁线莲属尾叶铁线莲组是该属中记录种类最多的类群，主要分布在亚洲亚热带至温带地区，少数种类分布至亚洲及非洲的热带地区。由于缺乏野外观察和标本不够丰富等原因，有些种类的分类处理尚不能令人满意，应予修订。尾叶铁线莲组的组下分类系统以及与近缘组之间的系统关系也存在争议，还需深入研究。本文作者经过大量的标本馆工作和全面的文献考证，结合野外观察，对该组植物进行了分类学修订，同时通过基于形态性状的分支系统学和花粉形态研究对尾叶铁线莲组及铁线莲属的系统发育进行了探讨，结果如下： 1.分类修订 通过对国内外近20 个标本馆的5000 余份馆藏标本研究，结合全面的文献考证和广泛的野外观察，发现花丝形态、花药毛被状况、药隔是否凸起、萼片外侧附的属物等性状较为稳定，是分亚组的主要依据。而复叶类型、花序形态及花梗毛被状况、萼片颜色等性状为较好的分种性状。 本文在考证了近140 个种及种下等级的分类学名称后，确认尾叶铁线莲组植物共有37 种20 变种，共分为5 个亚组，另有4 种7 变种暂存疑;2 种、2 变种降为新异名;新组合6 个，其中5 个为改级新组合;发表新亚组1 个;发现中国新纪录变种1 个;纠正了以前研究者工作中对C. aethusifolia var. latisecta 的鉴定错误;初步澄清了C. jingdungensis 及C. jinzhaiensis 的一些名实混乱;指出了前人工作中的一些拼写错误;统一了植物的中文名称，并新拟了15 个分类群的中文名称;给出了各个种的形态描述、地理分布图以及分亚组和分种检索表。 2.分支系统学 在分类修订基础上选取了35 个形态性状，对尾叶铁线莲组的37 个种，和尾叶铁线莲组的近缘组Sect. Bebaeanthera 中的2 个种，以C. alternata 为外类群，利用系统发育分系软件PAUP 4.0 beta 10 对数据矩阵进行分析。共得到182 棵最简约树，树长为182 步，一致性指数（CI）=0.385，保持性指数（RI）=0.685。结果显示：尾叶铁线莲组为一并系类群，Sect. Bebaeanthera 中的两个种：C. pseudopogonandra 和C. barbellata 与Subsect. Otophorae 亲缘关系更为接近，应并入尾叶铁线莲组中;Subsect. Otophorae 与Subsect. Grandiflorae 各自聚为两大支，从分支图基部与其他类群分开，为本组早期分化出的类群;Subsect. Acutangulae 与Subsect. Connatae 中具有红色花的C. lasiandra 和C. dasyandra 近缘;分布于东亚北部地区的Subsect. Aethusifoliae 与分布于我国横断山区的C.rehderiana 和分布于印度的C. roylei 近缘;根据分支系统学分析的结果，对尾叶铁线莲组组下分类系统进行了调整，建立了新亚组Subsect. Otophorae。 3.花粉形态 在扫描电镜下研究了铁线莲属148 种12 变种和锡兰莲属3 个种的花粉形态特征，并在透射电镜下研究了部分种类的花粉外壁结构。 结果表明：铁线莲属花粉粒一般为近球形、球形或扁球形。具三沟的花粉赤道面观为椭圆形或近圆形，极面观为三裂圆形，大小为14.8-32.1 μm ×14.2-28.7 μm;具散沟或散孔的花粉（全为球形）直径大小为14.8-36.6 μm。花粉具三沟、散沟或散孔。在三沟类型中常伴有不同比例的散沟花粉。萌发沟狭长或稍宽，有整齐或不整齐下陷的边缘，沟膜上有颗粒状纹饰或刺状纹饰;萌发孔一般圆形或不规则形，分布不规则。外壁由薄到较厚，厚度为0.8-2.5 μm，外层稍厚于内层。在透射电镜下本属花粉外壁具备被子植物花粉典型的外壁层次，即外壁内层和外壁外层。外壁内层为一层均匀的质密的无结构的层次。外壁外层由3 层组成：覆盖层，柱状层，和基层。覆盖层上均匀分布有小刺状纹饰和小穿孔。 锡兰莲属花粉粒为圆球形，其直径大小为14.9-18.8 μm。具散孔。萌发孔一般圆形，分布不规则，孔膜上有颗粒状纹饰或刺状纹饰。外壁厚度为0.8-1.8 μm，外层稍厚于内层。覆盖层上均匀分布有小刺状纹饰和小穿孔。 根据花粉形态在花粉粒大小、萌发孔的类型和外壁纹饰方面的差异将两个属的花粉分为6 个类型，其中类型1 再分为两个亚型。在这些花粉类型中，类型1 为三沟花粉，类型3 为三沟至散沟花粉，其余类型为散孔花粉。类型1 的亚型 1b 在铁线莲属中分布最广，18 个组中有13 个组具有这种类型的花粉，是铁线莲属中最原始的花粉类型，其他类型和亚型均由此亚型直接或间接演化而来。 推测这两属花粉形态特征的演化趋势为：1. 萌发孔. 三沟→（散沟）→散孔。 2. 花粉粒大小. 小（散孔，直径14.9-18.8 μm）←中等（三沟，24.2 μm ×24.8 μm） →大（散孔，直径28.9-36.5 μm）。3. 表面纹饰. 小刺不明显、分布密集→小刺明显、分布稀疏。 铁线莲属及锡兰莲属花粉形态特征对于这两个属植物的区分以及铁线莲属下组间系统发育关系的探讨具有重要意义。锡兰莲属与铁线莲属中的Sect. Naraveliopsis 亲缘关系紧密;铁线莲属内具有散沟、散孔花粉类型的Sect. Naraveliopsis、Sect. Viticella、Sect. Tubulosa、Sect. Viorna (sensu Tamura 1995)为铁线莲属中的进化类群; Sect. Tubulosa 与Sect. Campanella 亲缘关系较远，而与Sect. Clematis 近缘。

毛茛科铁线莲属长瓣铁线莲组的分类学修订

毛茛科（Ranunculaceae ）铁线莲属(Clematis L.)长瓣铁线莲组(Sect. Atragene) 植物全世界约有14－18 种，我国约有6 种，广泛分布于北温带的高山上。该组植物由于外部形态变异大，种间或种下划分十分困难，目前已发表的种及种下分类群名称多达130 余个，名称使用较为混乱，组内系统关系尚存争议。本文通过文献考证、标本研究、野外观察及形态性状统计分析的综合研究，对长瓣铁线莲组进行了全面的分类学修订，结果如下： 1、性状分析 深入研究了1000 余号该组植物标本的形态性状变异式样、范围及其相关性，发现复叶类型、小叶大小、萼片毛被和质地、萼片脉突出与否、退化雄蕊长度等是较为稳定的分种性状。生长习性、萼片颜色、萼片边缘是否具短绒毛带、退化雄蕊形状等对种下划分具有重要的意义。 2、分类学处理 1）根据该组植物的萼片和退化雄蕊的特征和演化趋势，建立了5 个新系：Ser. 1. Occidentales、Ser. 2. Alpinae、Ser. 3. Koreanae 、Ser.4. Tomentosae 和Ser. 5. Macropetalae 。 2）对长期以来分类上争议很大，且分类十分困难的类群作出以下新的处理：把C. sibirica 和C. ochotensis 作为C. alpina 的亚种；把日本的C. fusijamana 和C. fauriei 降级为半钟铁线莲C. alpina ssp. ochotensis 的变种；把伊犁铁线莲C. iliensis 降级为西伯利亚铁线莲C. alpina ssp. sibirica 的变种；把C. chiisanensis 降级为朝鲜铁线莲C. koreana 的变种；把紫红花长瓣铁线莲C. macropetala var. punicoflora 和石生长瓣铁线莲C. macropetala var. rupestris 处理为长瓣铁线莲C. macropetala 的异名；把C. dianae 归并入白色长瓣铁线莲C. macropetala var. albiflora；支持长白铁线莲C. nobilis 作为一个独立的种。此外，还新指定了5 个名称的后选模式；纠正了前人对中国C. subtriternata 的鉴定错误。 3）确认该组植物有9 种2 亚种和9 变种（包括3 新等级），给出了各个分类群详细的文献引证、描述、生境、地理分布、标本引证和外部形态图，并编写了组下分系和分种检索表。认为亚洲东北部是本组植物分布的多样性中心。 3、形态性状演化趋势和各系的亲缘关系 探讨了该组植物形态性状演化的趋势和新建立的5 个系的亲缘关系，提出：退化雄蕊可能由外部雄蕊演化而来，并沿两条路线演化发展：其一是退化雄蕊伸长，与萼片近等长或长于萼片，顶端渐狭，呈披针形；其二是退化雄蕊不伸长，与雄蕊近等长，上部加宽，顶端由钝形、圆形发展至微凹，呈匙形。萼片演化的趋势可能由质地薄到质地厚，萼片脉由不凸出到3 条脉凸出。由此推测北美洲类群Ser. Occidentales 可能是本组的原始类群；Ser. Macropetalae 可能是退化雄蕊在第一条演化路线上最进化的类群；Ser. Alpinae 和Ser. Koreanae 之间亲缘关系较近；Ser. Tomentosae 的系统位置尚未确定。

烟草NtFAD2基因的沉默及功能研究

油酰磷脂酰胆碱去饱和酶（FAD2）是一种重要的植物脂肪酸去饱和酶，位于内质网中，催化油酸生成亚油酸。亚油酸等多不饱和脂肪酸含量过高的植物油脂不稳定，易氧化，不易贮藏，而且氧化产物对人体有害。因此油脂改良的一个重要目的是提高种子油脂的油酸含量，降低多不饱和脂肪酸含量。另外，关于FAD2的结构、功能和表达调控等问题目前还不清楚，有待深入研究。近年发展起来的RNAi技术可有效地沉默目标基因，研究植物FAD2基因沉默后膜脂和油脂的变化及温度对基因沉默的影响，有助于深入理解FAD2酶的功能、表达调控方式和有效地利用基因沉默技术改变膜脂组成、提高植物油脂品质。本研究的主要目的是，首先采用RNAi技术抑制烟草FAD2基因（NtFAD2）的表达以降低NtFAD2酶活性，得到膜脂不饱和度改变的烟草转基因株系。然后研究NtFAD2基因沉默后脂肪酸去饱和过程的变化及其机理，以及温度对NtFAD2基因沉默的影响。研究中首先用PCR方法克隆烟草NtFAD2基因，用其编码区的一个片段构建表达发卡RNA的沉默结构，用农杆菌介导的方法转化烟草，从第一代转基因植株中筛选出油酸含量高的突变体。然后对其中一个转基因株系S61进行脂肪酸分析，发现叶片总脂和质体外单脂PC和PE中的油酸含量大幅度增加。此外，NtFAD2基因沉默对叶片甘油脂的影响有多效性，即质体内的单脂油酸含量也有显著增加，有些单脂中软脂酸含量有所下降。烟草NtFAD2基因沉默后，在叶片和种子中油酸含量变化最大，说明NtFAD2基因在不同器官中的沉默效果不同：沉默结构对NtFAD2酶活性较高的器官抑制程度更大，内源基因没有表现均一的沉默效果。沉默植株的多种组织中NtFAD2基因的mRNA降解程度相似，说明油酸含量与NtFAD2转录本的丰度没有直接关系。 植物脂肪酸的不饱和程度受温度调控，因此研究FAD2基因沉默株系的油酸含量受温度影响情况及其调控规律对RNAi技术在油脂改良方面的实际应用具有十分重要的意义。研究结果表明，随着生长温度的下降，野生烟草叶片膜脂油酸含量降低，多不饱和脂肪酸含量随之增加;转基因烟草中油酸和多不饱和脂肪酸有相似的变化趋势，但是变化幅度远远大于野生烟草。低温下转基因烟草叶片油酸含量之所以大幅度下降，其中一个重要原因是被抑制的NtFAD2酶受低温的调节而活性升高。然而研究发现，与常温条件下相比，低温下转基因烟草NtFAD2基因的mRNA丰度不变，说明低温没有影响沉默结构对NtFAD2基因的mRNA的降解。低温环境下NtFAD2基因沉默植株的多不饱和脂肪酸含量有所回升可能是植物对低温的一种适应性响应。转基因烟草种子油脂的油酸含量也受温度影响：常温下表现高油酸性状，低温下油酸含量下降。因此种植这种高油酸品系时，需要考虑温度的影响。如果在适宜的地域和季节种植，避免转基因植株开花结实时遭遇持续低温，就可以利用转基因植株的遗传优势，生产富含油酸的优质植物油。

九寨沟景区旅游活动扰动形成的退化地段植被恢复试验初报

日益增强的旅游活动干扰已成为九寨沟世界自然遗产的有效保护与持续管理不可回避的问题，也已成为当前区域生态保护与经济发展的焦点问题之一。评估乡土植物种的基本特征、质量、种子休眠程度以及萌发能力；筛选适宜的植被恢复乡土物种并选择有效植被恢复技术措施是开展植被恢复试验的重要前提和保障。本文以九寨沟世界自然遗产为例,通过对景区乡土植物种子基本特征的测定以及采用乡土物种作为植被恢复技术试验与恢复技术筛选的试验物种，在景区旅游干扰区的三种生境类型：原始针叶林、混交林和边坡，根据不同的影响因素设计试验，从而探索适宜的恢复措施和植被恢复物种。初步结论如下： 1． 本文研究的28种乡土植物中，17种测定的物种活力较高(>72%)，均具有作为恢复物种的潜力。但28种种子中75%的发芽率为0%。大部分种子存在一定程度的休眠，包括甘肃山楂、称花藤、疏花槭、陇东海棠、球花荚迷、巴东小檗、蔷薇、宝兴栒子、光泽栒子、光枝柳叶忍冬、甘青铁线莲、毛果铁线莲、宽叶旌节花、糙叶五加和独活。因而种子存在深度休眠是乡土物种自然更新和植被恢复的主要障碍，需要根据种子的形态生理特征，寻求打破乡土植物种子休眠的有效方法，提高种子发芽率。 2．低温层积只显著提高了蔷薇、毛果铁线莲、宽叶旌节花和假升麻3种种子的发芽率，也相对较早地提高了陇东海棠、鲜黄小檗和独活的萌发。对于其它物种的种子，低温层积没能有效打破休眠提高发芽率。综合分析结果表明九寨沟28种林下或林缘乡土植物中窄叶鲜卑花、毛果铁线莲、宽叶旌节花、假升麻、陇东海棠、鲜黄小檗和独活等12种可直播或通过低温层积处理后直播用于旅游干扰退化地段的植被恢复中，而其它的种类尚需进一步寻求打破休眠的措施以提高种子发芽能力。 3．在原始林生境下，七筋菇、巴东小檗、耳叶风毛菊、长叶毛花忍冬及独活5种乡土植物种子的出苗能力不高，因此目前急需提出有关提高种子出苗的方法措施。在相同的处理条件下，不同物种出苗数存在着较大的差异，相比而言，巴东小檗、耳叶风毛菊和长叶毛花忍冬种子出苗与幼苗存活较高，对于其环境适应能力较强，因此它们更适宜采用播种的方式应用于九寨沟原始林践踏地段地表的植被恢复实践；而七筋菇和独活在室内和自然气候条件下萌发都很困难，在植被恢复过程中，可考虑采用其它播种方式。而在边坡和混交林生境试验结果表明，供试物种无萌发和出苗现象，这可能跟外界环境条件、干扰和种子命运有关。 4． 本研究中腐殖质、松土和苔藓覆盖处理措施均未能提高物种出苗，且对样方内植被结构以及物种丰富度也无显著影响，其中的影响因素也是多方面的，因此还需进一步研究探索。但腐殖质对幼苗存活能力方面有一定的积极作用。 The increasing tourism disturbance is an unavoidable issue to effective conservation and sustaind tourist management of Jiuzhaigou Nature Reserve. It has become one of the focal problems of regional ecological protect and economic development. Assessing the traits, quality, seed dormancy and germination of native seed and choosing the suitable species and ways for vegetation restoration were the important precondition and guarantee before vegetation restoration. In this paper, as an example to Jiuzhaigou world nature heritage, through the estimation to the basic characteristics of native seeds and the use of native species for the test of vegetation restoration and the choosing of vegetation restoration techniques, in three different habitats being disturbed, including the primitive forest, mixed forest and side slope. According to different factors, designing experiments in order to explore the appropriate measures and species of vegetation restoration . Our results are as follows: 1． There are 77% seeds of the 28 species with high viability(>72%), which had the potential possibility of being restoration species. The germination of 75% of the seed was 0%.Most of the seed was dormant, So dormancy of seed was the barrier for natural regeneration and vegetation restoration, Further research is needed on investigating the other more effective methods to release seed dormancy of these native species in the future. 2． Cold stratification did not release seed dormancy of most species. In our study, there are only 3 species including Clematis peterae var. trichocarpa, Stachyurus chinensis and Aruncus sylvester (P<0.05) with germination percentage increased by cold stratification. By comprehensive analysis, the result shows: In 28 undergrowth native seeds, Sibiraea angustata, Clematis peterae var. trichocarpa, Stachyurus chinensis, Aruncus Sylvester, Malus kansuensis, Berberis diaphana,and Heracleum hemsleyanum could be used to vegetation restoration by sowing directly or sowing after cold stratification in degenerate gland being disturbed by turism, and othes seed of 28 were needed to search other methods to release seed dormancy for advancing the ability of germination. 3．In the habitat of primitive forest, the ability of emergence of the native species Clintonia udensis, Berberis henryana, Saussurea neofranchetii, Lonicera trichosantha var.xerocalyx and Heracleum hemsleyanum was low, so it is urgently needed to search about the methods of advancing emergence. In the sametreatment, the number of emergence of different species was very different. Relatively speaking, the emergence and seedling survival of the species Berberis henryana, Saussurea neofranchetii and Lonicera trichosantha var.xerocalyx was higher, and the adaptability of the species was better, so they were more suitable for vegetation restoration on trampling-induced degraded patches of primitive forest in Jiuzhaigou; But the germination of Clintonia udensis and Heracleum hemsleyanum was both difficult in laboratory and natural conditions, so it could be considered to apply other sowing methods. However, the result showed that: applied species didn’t germinate or emergent in the habitat of side slope and mixed forest, which could be related to external environment conditions, interference and the fate of the seed. 4．In this study, humus, scatification and bryophyte cover measures didn’t advance the emergence of the species or the structure of vegetation and richness in plot significantly, the impact factors of which were many, therefore further research is needed . However, humus had a certain positive effect on the ability of seedling survival.