裸子植物的分类和系统发育研究—松科的分类、地理和种系发生研究，中国红豆杉科、三尖杉科、南洋杉科和银杏科的分类学研究

球果类植物是现存裸子植物中最为繁盛的一群，也是目前组成北温带森林植被的重要成分，我国是球果类植物科属的重要分布、分化或保存中心。对这些科属的分类和系统发育的研究，无疑对北温带的森林植被的研究，以及林业生产均具有重要的理论和实用价值．本研究即是围绕着球果类中的Pinaceae，Taxaceae及Cephalotaxaceae等科展开的研究，内容主要包括以下几方面： 一、在《中国植物志》第七卷的基础上，完成了《FLORA OF CHINA》中裸子植物Ginkgoaceae，Arancariaceae Pinaceae，Taxaceae，和Cephalotaxaceae各科的修订和编写． 建立2个新种、2个新变种、12个新组合、64个新异名、2个新分布，2个新启用名，分类群及其名称的变动和增补，以及增补异名57个。 二、根据植物的地理分布与系统发育统一的原理，在资料分析和实验的基础上，运用表征分析和分支分析研究方法，同时结合化石和地史资料，针对松科的分类、地理分布、以及起源分化和扩散等问题进行了一系列系统的研究，主要结论如下： 1．提出松科分类的新系统，将松科划分为三个亚科：松亚科Subfam．Pinoideae:仅一属Pinus Linn．： 落叶松亚科Subfam．Laricoideae Melchior＆Werderm, emend．N．Li et L.K．Fu：包括四属Larix Mill.，Cathaya Chun&Ku:tng, Picea A Dretr. andPseudotsuga Carr．;冷杉亚科Subfam．Abietoideae Pilger, emend．Frankis:包括五属Abies Mill．，Cedrus Trew, Pseudolarix Gord．，Keteleeria Carr.,and Tsuga Carr． 2．构思和绘出了以地质年代为纵座标的松科系统发育树。 3．进行松科植物分区，将松科划分为6区、4亚区。并分别附有分区图、各区所分布种数的统计表、以及各属目前的地理分布和化石分布图。 4．松科在地质时期曾是一个很庞大的类群，现代松科只是其祖先中少部分喜温性分支的后裔，其兴旺与温带成份的出现关系密切，可能是一类衍生类群． 5．松科的起源时间虽然可追溯到侏罗纪甚至三迭纪，但现代松科各属的出现时间大约是在早白垩纪至第三纪之间。 6．松科各属可能并非起源于同一时间和地点。松属可能是现存的、最早分化出来的类群，于侏罗纪至早白垩纪间起源于欧美古陆;其它属则到晚白垩纪至第三纪早期（有1-2属至中期）才陆续从其祖先复合体中分化出来。 7．现代松科的早期扩散可能存在着以下三条主要的迁陡路线，即：欧美路线、欧亚路线和古白令路线．

银杉的遗传多样性及系统位置的研究一兼论松科的分子系统学

银杉属Cathaya是我国著名植物学家陈焕镛和匡可任建立的松科单型属，该属是否成立及该属在松科中的系统位置至今仍众说不一。银杉Cathazyaargyro phylla是银杉属的唯一幸存种，被誉为第三纪的活化石，并被列为我国一级保护的濒危植物，也是世界植物红皮书所列少数几种濒危裸子植物之一，保护区虽已设立数个，但该物种的濒危原因仍为未解之谜。本文针对上述问题开展了松科植物的分子系统学研究，探讨了银杉属的系统位置及松科的属间关系，并通过遗传多样性的研究探讨了银杉的濒危机制及保护策略。 1．松科的分子系统学研究 为选取合适的分子标记，本文先探讨了ITS-1在松科等裸子植物中的系统学价值。对1 6种裸子植物（其中含松科10属12种）的ITS-1的扩增结果如下：ITS-1在裸子植物属闻存在极大的长度变异(约600-2600bp)，因而不适用于属级以上的系统学研究;在同属种中，ITs-1的长度虽较一致，但与被子植物的ITS-1相比，裸子植物的ITS-1太长(如在松属中超过2600bp)，难以进行大规模研究。银杉属ITS-1的扩增产物中，一个片段的长度与松属ITS-1的长度相当，另一个片段的长度与云杉属ITS-l的长度相当，这三属间的关系值得进一步研究。此外，在松科植物ITS-1的研究中必须注意真菌“污染”这一问题。 由于ITS不适用于裸子植物属间关系的研究，因而本文运用rbcL-accD基因片段及trnK基因的PCR-RFLP分析探讨银杉属的系统位置及松科的属间关系。rbcL和trnK虽然都是叶绿体基因，但位于trnK内含子区的natK基因与rbcL基因在所受的选择压及进化速率上相差甚远，通过这两个基因研究结果的比较有助于评价系统树的可靠性。此外，考虑到松科的10个属中有9个属的rbcL基因序列已被测定，我们补测了银杉属的rbcL基因序列，进而对松科10个属的rbcL基因序列进行了全面分析。PCR -RFLP分析及rbcL基因的序列分析结果如下： A. PCR扩增的松科rbcL-accD基因片段均长约2550bp，属间没有明显的长度变异，1 8种限制性内切酶的单酶切及7种组合双酶切共获得86个酶切位点，其中54个为变异位点。PAUP和MEGA软件分析均表明：银杉属、松属、黄杉属和落叶松属构成一个单系群，且银杉属与松属的关系似乎近于它与另外二属的关系，但这一结果来得到bootstrap分析的较强支持;黄杉属近缘于落叶松属;冷杉属近缘于油杉属。 B．PCR扩增出的松科trnK基因均长约2557bp，在属间也没有明显的长度变异。16种限制性内切酶的单酶切及7种组合双酶切共获得92个酶切位点，其中68个为变异位点。变异位点中的35个具有系统发育信息，其中28个位于matK基因上。分布于整个trnK基因上的informative位点和仅分布于matK基因上的informative位点分别用于PAUP(version 3.1.1)分析，且PAUP分析中分别用Wagner简约法和Dollo筒约法构建系统树。总体看来，Wager简约树和Dono简约树的结构基本一致（Cedrus的位置除外）：Abies、Keteleeria、Tsuga和Pseudolarix分为一支，且这一支在所有的简约树中均得到分辨;Pseudotsuga近缘于Larix,而Abkes相对近缘于Keteleeria; Cathaya与Ables-Keteleeria-Pseudolarix-Tsuga这一支的关系较远，它与松科的其它属聚在一起，但b∞tstrap分析也不支持它与任何一个属有很近的关 系，说明Cathaya是比较孤立的一个属。Cedrus的位置较特殊，在Wagner简约树中它位于松属以外的其它8个属的基部（因松属为外类群），而在Dollo筒约树中它位于Al}ies-Kete~eer uz-Pseudo/zr/x- Tsuga达一支的基部，并且它与这一支的关系得到了bootstrap分析的较强支持。 C．银杉的rbeL基因长1425bp，其序列与松科其它9个属的rbcL基因序列均有较大差异，从遗传距离(Mega软件中的P-distance)上看，银杉属作为一个属是无可非议的。PAUp和Mega软件分析均表现：Abies、Keteleeria、Pseudolter和Tsuga分为一支，且Cathaya与这一支的关系较远;Pseuaiotsuga近缘于Larix,且这二属间的关系得到了bootstrap分析的强烈支持;Abies近缘于Keteleeria，Pseudolarix近缘于Tsuga，且这两支也得到了bootstrap分析的较强支持;Cathaya与Pinus聚为一支，但支持强度不高。Cetirus的位置与trnK基因的PCR-RFLP分析结果极为相似。 根据rbcL-accD基因片段及trnK基因的PCR-RFLP分析以及rbcL基因的序列分析可以得出如下结论：<1> Cathaya作为一个属不仅是成立的，而且是一个较为孤立的属，将它置于其它任何属内都是不正确的，该属与Abies-Keteleer ia-Pseudolarx-Tsuga这一支的关系较远，相对而言Cathaya与Pinus的关系可能稍近一些。<2>松科主要分为两大支：一支含Abies、KeteZeera、Pseudolarx和Tsuga，该支中Abies近缘于KetelaeriaPseudolarix近缘于Tsuga;另一支含Pseudotsuga、Larix、Cathaya、Pinus和Picete，该支中Pseudotsuga明显近缘于Larix;Cedrus可能更近于Abies-Keteleeria-Pseudolarix-Tsuga这一支。 2．银杉的遗传多样性研究 本研究运用随机扩增多态DNA(RAPD)方法对银杉的1 1 3个个体（分别采自现存全部4个居群：金佛山、花坪、大瑶山和八西山)进行了遗传多样性检测。21个1O-mer的寡核苷酸引物共检测11个位点，其中42个位点是多态的，占37%，这一多态位点百分率仅为裸子植物多态位点百分率平均值的一半左右，说明银杉的遗传多样性水平很低。对多态位点的分析发现银杉屠群内发生了十分严重的遗传漂变，因而导致屠群间的强烈分化。AMOVA分析表明：银杉的遗传变异中，34.7%的变异存在于居群闻，这一数值是裸子植物GST平均值(6。8%)的5倍多;在金佛山屠群中，17%的遗传变异存在于亚居群间，这一数值也是裸子植物GsT平均值的两倍多。银杉的这一居群遗传结构与其它裸子植物的居群遗传结构截然不同。此外，我们提出了度量遗传多样性水平的分化指数概念及其计算方法，并发现遗传多样性水平的高低与生境的复杂程度有一定的相关性。 银杉的遗传多样性水平很低，其适应幅必然很窄，且由于严重的遗传漂变导致居群间的强烈分化，使基因流受阻，进而产生严重的近交，近交又使银杉的适应能力进一步下降，并使极为有限的遗传多样性进一步丧失，这种恶性循环会导致银杉濒危程度的加剧，甚至绝灭。 鉴于银杉独特的居群遗传结构，即有相当大一部分遗传变异存在于居群之间，取样保护时，不仅要在每个居群中取足够多的个体，而且要在尽可能多的居群中取样。就原地保护而言，由于每个居群和亚居群都有独特的基因型，因而都具有保护价值。另外，人工加强居群间的基因流（如人工授粉）对提高银杉各居群的适应能力肯定是有益的。

雪松属的分子系统发育与生物地理学

南北纬四十度之间的山区在冰期时为很多植物提供了避难所，因而受到生物地理学研究者的广泛关注。地中海地区和青藏高原（东南部）均是全球生物多样性热点地区，很多生物类群间断分布于这两个地区，研究这种间断分布格局的形成过程具有重要理论意义。雪松属（Cedrus）含有四个关系密切的种，间断分布于地中海地区和喜马拉雅西部。在本研究中，我们从父性遗传的叶绿体和母性遗传的线粒体基因组中选取了八个DNA片段，通过序列分析重建雪松属所有物种的系统发育关系，并探讨该属生物地理格局的形成过程。主要研究结果如下： 所有分析的DNA片段中均未发现种内变异。5个叶绿体片段的合并分析、3个线粒体片段的合并分析以及所有8个细胞质DNA片段的联合分析均只得到一棵最简约树，而且不同分析得到的树图结构高度一致。雪松属分为喜马拉雅（C. deodara）和地中海两支;在地中海雪松支系中，北非雪松（C. atlantica）构成一个亚支，地中海东部的黎巴嫩雪松（C. libani）和塞浦路斯雪松（C. brevifolia）形成另一亚支，两个亚支间为姐妹群关系，并已发生较大的遗传分化。该结果与细胞和生化等研究结果一致。 雪松属的可靠化石发现于哈萨克斯坦西部的渐新世地层、欧洲西南部的中新世地层、欧洲东南部的上新世地层以及撒哈拉的早更新世地层，这种化石分布暗示雪松属可能是在欧亚大陆的高纬度地区起源的。自第三纪开始，全球由广泛的高温气候演变为具有大面积陆地冰盖的寒冷气候，这种气候变化促进了生物群的演替和分化。我们对雪松属的系统发育研究表明：该属植物可能在欧亚大陆高纬度地区起源后，因气候变冷而南迁，并通过隔离分化形成环地中海－喜马拉雅间断分布格局。结合青藏高原和地中海地区的气候和地质历史，我们推测雪松属在中新世以后才分布到喜马拉雅地区，并很可能在第三纪末才迁移到北非。