中国明对虾病原检测新方法及酚氧化酶通路相关基因的研究

对虾病害在世界范围内肆虐，给水产养殖和沿海农村经济造成了重大损失。在水产养殖的实践中快速检测水产动物的病害并及时采取隔离等措施对于控制病害尤为重要，其中关键的环节就是快速检测出病害，并在对虾免疫机制上寻找对虾疾病防治的有效方法。研究表明当对虾等甲壳动物受到外界病原刺激时，极微量的微生物多糖就可以激活proPO系统。激活过程中涉及和产生一系列活性物质，如黑色素、酚氧化酶原激活因子（PPA）、模式识别蛋白（BGBP、PGBP、LGBP、LBP）及其膜上受体和A2巨球蛋白等，它们可通过多种方式参与防御反应，包括提供调理素，促进血细胞吞噬作用，形成结节或包囊以及介导凝集和凝固，产生杀菌物质并且黑色素化。黑色素常常在节肢动物的体表形成黑色斑点，形成的色素沉着对机体起到保护作用。所以，酚氧化酶原激活的级联反应是节肢动物免疫的关键因素。本论文研究开发了以环等温介导技术（LAMP）为基础的检测对虾白斑病毒（WSSV）和鳗弧菌（V. anguillarum）的快速检测方法。并从对虾对病害的免疫机制为切入点，从中国明对虾体内克隆了酚氧化酶原（PrpPO）和丝氨酸蛋白酶FcSP3这两个免疫系统中重要的基因，分析了它们的分子结构特征，组织分布及应答鳗弧菌病原刺激的表达变化模式。 建立的对虾常见病害对虾白班病毒（WSSV）和鳗弧菌（V. anguillarum）的LAMP检测方法，经过实验比对和Blast检索，发现本研究中使用的引物，比已经报导的LAMP方法或者PCR方法具有更宽的检测范围（更低的假阴性）。检测WSSV的LAMP方法使用病毒的VP28基因设计引物，而鳗弧菌的检测方法使用empA基因设计引物。在方法中，首次提出加入UNG酶和dUTP的措施来预防污染，在实际检测中非常有效。LAMP方法与PCR检测方法的灵敏性比较也进行了研究，二者灵敏性相当。 依据中国明对虾血液cDNA文库提供的部分片段信息，结合SMART-RACE技术，克隆了酚氧化酶原（PrpPO）基因，通过序列比对分析发现，PrpPO基因cDNA全长为3040 bp，其中开放阅读框2061 bp，编码686个氨基酸，其中推测的信号肽为12个氨基酸。推测的序列与斑节对虾（P. monodon）同源性为93%,与短钩对虾（P. semisulcatus.）同源性为92%。real time RT-PCR实验结果表明， ProPO在血细胞中的相对表达量最高，肝胰脏中表达量最低。弧菌刺激实验中注射弧菌，刺激了血细胞和淋巴器官中的ProPO mRNA显著增加，说明在血细胞和淋巴器官中存在快速反应的ProPO通路。而ProPO mRNA量在淋巴器官中在时间上早于血液中升至最高，说明该动物在在病原刚开始入侵的时候先有淋巴器官发挥主要的免疫作用，随着时间推移血细胞便变成主要的免疫器官。 根据中国明对虾肝胰脏cDNA文库提供EST信息，经过SMART-RACE克隆了一个丝氨酸蛋白酶FcSP3基因，通过序列比对分析发现，该丝氨酸蛋白酶基因cDNA全长为1622 bp，其中开放阅读框1431 bp，编码477个氨基酸，其中推测的信号肽为22个氨基酸。推测的序列与疟蚊的丝氨酸蛋白酶（A. gambiae）同源性为33%,与丽蝇蛹集金小蜂的酚氧化酶原激活因子（N. vitripennis）同源性为32%，与东北大黑鳃金龟的酚氧化酶原激活因子（H. diomphalia）同源性为34%。淋巴器官中PPAⅡ表达量约为血液中表达量的47560倍，肝胰脏中的FCSP3表达量为血细胞表达量的6226倍。鳗弧菌注射对虾后，淋巴器官中刺激组和对照组FcSP3的mRNA量在刺激后6小时显著降低，但是刺激组的表达量明显高于对照组。刺激组的血细胞与肝胰脏中FcSP3 mRNA的相对表达量增高。而病原刺激后的血液与肝胰脏中的FcSP3 mRNA的增长趋势也在时间上先与ProPO mRNA。这说明FcSP3对ProPO有正调控的作用，但这个调控有一个时间差，并且在不同组织中有不同的调控效率。

弧菌琼胶酶和丝氨酸蛋白酶的筛选、分析以及免疫应用

从山东黄岛海水养殖场分离到一株弧菌V134，从中克隆得到琼胶酶基因agaV，并将其在大肠杆菌中表达，纯化得到重组的琼胶酶AgaV。酶活分析发现该琼胶酶的最适温度在40℃左右，对pH比较敏感，pH 7.0时具有最高的琼胶裂解活性。对AgaV进行了两种应用性探索：（1）利用AgaV从琼脂糖凝胶中回收DNA，回收效率可达90%以上；（2）利用agaV作为报告基因构建了捕获分泌序列的载体pBU，并用其从革兰氏阳性细菌（G+菌）和革兰氏阴性细菌（G-菌）中筛选出了一系列分泌蛋白。将利用pBU从一株哈维氏弧菌T4中筛选出的6个分泌蛋白分别进行基因克隆、蛋白表达纯化和牙鲆免疫实验，发现其中一个蛋白，命名为DegQVh，具有免疫保护效应，其免疫保护率（RPS）可达64%。为了提高DegQVh的免疫保护效应，将AgaV的分泌结构域与DegQVh融合，构成融合抗原AgaV－DegQVh。利用大肠杆菌作为载体菌构建了AgaV－DegQVh融合抗原递呈系统，用其作为疫苗进行免疫，发现其RPS可达到95%。酶活分析表明DegQVh在50℃、pH 8.0时具有最高的活性。突变分析表明83位的组氨酸、113位的天冬氨酸和188位的丝氨酸以及两个PDZ结构域是DegQVh活性所必需的。表达分析发现degQVh表达受温度和细胞浓度调控，并且其上游有一个受E调控的启动子。进一步的分析发现DegQVh能够与大肠杆菌的DegP功能互补。

哈氏弧菌种特异性分子标记的发现及其在哈氏弧菌快速诊断和免疫防治中的应用

哈氏弧菌是危害水产养殖业发展的重要病原菌之一，因而其免疫防治研究具有重要意义。论文发现了一个新的、编码未知功能蛋白的基因vhhP2，该基因只存在于哈氏弧菌中，具有很高的种特异性。根据此特点，建立了一种vhhP2 -PCR检测方法，并证明该方法可以快速准确地从动物血液、组织以及环境样品中检测哈氏弧菌。同时，对VhhP2进行了免疫原性检测，发现VhhP2作为亚单位疫苗具有良好的免疫保护效应。为了克服常规亚单位疫苗的缺点以及进一步提高VhhP2的免疫效应，利用表面展示技术将VhhP2蛋白定位到鱼类共生菌细胞表面，制成活体疫苗。免疫结果表明，这种表面展示型VhhP2能够大幅提高牙鲆对哈氏弧菌的抵抗能力。论文还利用VhhP2蛋白的分泌功能，将VhhP2与一株迟缓爱德华氏菌的免疫保护性抗原蛋白重组融合，制成交叉保护疫苗，并证明其对哈氏弧菌和迟缓爱德华氏菌均有一定的免疫作用。

海湾扇贝超氧化物歧化酶家族基因结构、表达和多态性分析

海湾扇贝Argopecten irradian Lamarck于1982年从美国引种到中国，由于具有较快的生长速度和很高的经济效益，海湾扇贝成为中国最主要的养殖贝类之一。近年来海湾扇贝养殖遇到了死亡率高等问题，深入开展海湾扇贝功能基因的研究，尤其是免疫相关基因及其机制研究并在此基础上寻找扇贝疾病防治的有效方法对海湾扇贝的健康养殖十分重要。 对于贝类免疫系统来说，其血细胞在先天性免疫防御中起着重要的作用。当受到外界病原侵染时，贝类血细胞的一个重要免疫反应就是吞噬作用。在吞噬病原过程中，受到病原侵染的贝类还会产生其他多种免疫反应，这些免疫反应将消耗大量的能量（ATP），产能的呼吸链会加速运转，由此也会引发与呼吸链相耦联的活性氧（ROS）的大量产生。这些活性氧具有极强的反应特性，能破坏病原微生物的结构和功能分子，实现对入侵病原的杀灭。利用活性氧对被吞噬的病原进行杀灭，这是吞噬作用消除病原抵御侵染的重要机制。但由于活性氧分子反应的非特异性，它们也会破坏宿主机体细胞内的功能蛋白分子、不饱和脂肪酸分子和核酸等，对细胞造成严重的伤害，进而导致机体生理机能的损伤和免疫系统的破坏。所以，及时消除病原感染机体内过量产生的ROS，维持相关细胞的正常代谢，对提高机体抵抗力和免疫力具有重要的作用。O2-是生物体内产生的第一种活性氧分子，其他的活性氧分子也是由它衍生而来，消除过量O2-是消除过量活性氧危害的第一步也是关键一步。生物体内，超氧化物歧化酶（SOD）是催化O2-发生歧化反应，消除O2-的关键酶。 首先，本文通过RACE方法获得了海湾扇贝SOD家族全部三种基因的cDNA全长并对其进行了序列的生物信息学分析，海湾扇贝AiCuZnSOD全长cDNA为1047个碱基，其中开放阅读框为459个碱基，编码152个氨基酸，与栉孔扇贝Chlamys farreri的CuZnSOD相似度为77.5%，与长牡蛎Crassostrea gigas的相似度为75%，与人的相似度为74.7%。AiMnSOD全长cDNA为1207个碱基，其中开放阅读框为678个碱基，编码226个氨基酸，序列比对结果发现AiMnSOD的氨基酸序列与虾夷扇贝Mizuhopecten yessoensis和皱纹盘鲍Haliotis discus hannai的相似度分别为85%和78.4%，与哺乳动物相似度也在68%~72%之间。AiECSOD全长cDNA为893个碱基，其中开放阅读框为657个碱基，编码218个氨基酸。AiECSOD与其它物种ECSOD相似度比较低。与线虫Brugia pahangi的相似度为27.9%，与疟蚊Anopheles gambiae的相似度为31.4%，与斑马鱼Danio rerio的相似度为27.8%，与人的相似度也只有28.6%，与同是贝类的长牡蛎ECSOD也只有28.1%的相似性。主要原因是AiECSOD的信号肽和肝磷脂结合区域在各物种中无同源性。 其次，采用qRT-PCR（quantitative real time PCR）方法分析三种SOD基因在不同组织中的表达情况，结果表明三种SOD基因的组织表达有所差异。AiCuZnSOD基因在鳃中表达水平最高，其次是血细胞和性腺，在外套膜、闭壳肌和肝胰脏表达水平较低。AiMnSOD基因在鳃中表达水平最高，其次是外套膜，在血细胞、性腺，而在肝胰脏和闭壳肌表达较弱。AiECSOD基因在血细胞中表达水平最高，其次是肝胰脏，在鳃、闭壳肌表达水平较低，而性腺和外套膜没有检测到。同时，采用qRT-PCR对鳗弧菌Vibrio angullarum感染后海湾扇贝血细胞中三种SOD基因mRNA表达变化进行了检测。AiCuZnSOD表达量在各个时间段没有显著差异(P > 0.05)。AiMnSOD的表达量在1.5 h时略有下降，在3 h时达到最高表达量，是空白组（0h）的3倍(P < 0.01)，从6 h到24 h表达量逐渐下降，24 h时表达量是空白组的1.6倍，24 h到48 h又稍有升高。AiECSOD的表达量在1.5 h时有所下降，是空白组的0.3倍（P < 0.05)，随后逐渐升高，在12 h时达到最高表达量，是空白组（0h）的4.5倍（P < 0.01），从24 h到48 h表达量逐渐下降并恢复到空白组的水平。在对照组，各个时间点没有显著差异（P > 0.05）。在鳗弧菌感染后，海湾扇贝三种SOD的表达并不一致，且差异比较显著。AiCuZnSOD被认为是构成性表达基因，其受外界刺激的影响最小，AiMnSOD和AiECSOD受刺激后表达上调比较明显。 第三，采用Genome-walking的方法得到了海湾扇贝三种SOD基因的基因组全长和近端启动子序列并对其进行了相关分析。AiCuZnSOD的基因组序列全长为4279bp，包含有4个外显子和3个内含子。AiMnSOD的基因组序列全长为10692bp，包含有4个外显子和3个内含子。AiECSOD的基因组序列全长为5276bp，包含有5个外显子和4个内含子。三种基因外显子和内含子的结合处序列遵循-AT/GT-原则。我们把海湾扇贝SOD家族的三个基因的近端启动子进行了比较分析。发现三种SOD在靠近起始密码子的位置都有Oct-1结合位点。三种SOD共有的转录位点有：Oct-1、C/EBPalp、Oct2.1、Sp-1和GATA-1。AiCuZnSOD和AiMnSOD共有的转录位点有：ICSBP、Ftz、TATA-box、C/EBPbeta和Antp。AiCuZnSOD和AiECSOD共有的转录位点有：AP-1和NFκB。AiMnSOD和AiECSOD共有的转录位点有：GR和ER。AiCuZnSOD独有的位点有：SRF、YY-1和NF-1。AiMnSOD独有的位点有：HNF-1、Hb、MEB、NF-muE1、Pit-1a和Eve。AiECSOD独有的位点有：CREB、RATA-alph、Kruppel-like和AP-3。 此外，通过构建原核表达载体，本研究对AiCuZnSOD和AiECSOD基因进行了体外重组表达，并对纯化的重组蛋白进行了酶活分析。酶活分析表明，重组AiCuZnSOD蛋白有较高的酶活和稳定性。 最后，我们对海湾扇贝三种SOD基因的部分区域，包括启动子、编码区，部分内含子区域进行了SNP检测，并对SOD基因部分SNP位点多态性和鳗弧菌敏感性进行了相关分析。三种SOD基因中，我们共发现了59个SNP位点，其中AiECSOD的SNP位点最多，特别是在启动子区，AiCuZnSOD和AiMnSOD多态性较低。其中AiCuZnSOD启动子区的-1739 T-C 位点的基因型和等位基因，AiECSOD启动子区的-498 A-T和-267 G-A等位基因频率，AiECSOD的第一个外显子38 Thr-Lys的多态性在敏感和抗菌群体中存在显著差异（P < 0.05）。

Isolation and identification of bacteria associated with the surfaces of several algal species

We conducted this study to assess the diversity of bacteria associated with the surfaces of algae based on 16S rDNA sequence analyses. Twelve strains of bacteria were obtained from the surfaces of the following four species of algae: Gracilaria textorii, Ulva pertusa, Laminaria japonica, and Polysiphonia urceolata. The isolated strains of bacteria can be divided into two groups: Halomonas and Vibrio, in physiology, biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analyses. The phylogenetic tree constructed based on 16S rDNA sequences of the isolates shows four obvious clusters, Halomonas venusta, Vibrio tasmaniensis, Vibrio lentus, and Vibrio splendidus. Isolates from the surface of P. urceolata are more abundant and diverse, of which strains P9 and P28 have a 16S rDNA sequence very similar (97.5%-99.8%) to that of V. splendidus. On the contrary, the isolates from the surfaces of G textorii, U. pertusa and L. japonica are quite simple and distribute on different branches of the phylogenetic tree. In overall, the results of this study indicate that the genetic relationships among the isolates are quite close and display a certain level of host species specificity, and alga-associated bacteria species are algal species specific.

Toxin-screening and identification of bacteria isolated from highly toxic marine gastropod Nassarius semiplicatus

Bacteria isolated from a highly toxic sample of gastropod Nassarius semiplicatus in Lianyungang, Jiangsu Province in July 2007, were studied to probe into the relationship between bacteria and toxicity of nassariid gastropod. The toxicity of the gastropod sample was 2 x 10(2) mouse unit (MU) Per gram Of tissue (wet weight). High concentration of tetrodotoxin (TTX) and its analogues (TTXs) were found in the digestive gland and muscle of the gastropod, using high performance liquid chromatography coupled with mass chromatography (LC-MS). Bacterial strains isolated from the digestive gland were cultured and screened for TTX with a competitive ELISA method. Tetrodotoxin was detected in a proportion of bacterial strains, but the toxin content was low. Partial 16S ribosomal DNA (rDNA) of the TTX-producing strains was then sequenced and compared with those published in the GenBank to tentatively identify the toxic strains. It was found that most of the toxic strains were closely affiliated with genus Vibrio, and the others were related to genus Shewanella, Marinomonas, Tenacibaculum and Aeromonas. These findings suggest that tetrodotoxin-producing bacteria might play an important role in tetrodotoxin accumulation/production in N. semiplicatus. (C) 2008 Elsevier Ltd. All rights reserved.

PCR-DGGE analysis of intestinal bacteria and effect of Bacillus spp. on intestinal microbial diversity in kuruma shrimp (Marsupenaeus japonicus)

In this study, the intestinal microbiota of kuruma shrimp (Marsupenaeus japonicus) was examined by molecular analysis of the 16S rDNA to identify the dominant intestinal bacteria and to investigate the effects of Bacillus spp. on intestinal microbial diversity. Samples of the intestines of kuruma shrimp fed normal feed and Bacillus spp. amended feed. PCR and denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) analyses were then performed on DNA extracted directly from the guts. Population fingerprints of the predominant organisms were generated by DGGE analysis of the universal V3 16S rDNA amplicons, and distinct bands in the gels were sequenced. The results suggested that the gut of kuruma shrimp was dominated by Vibrio sp. and uncultured gamma proteobacterium. Overall, the results of this study suggest that PCR-DGGE is a possible method of studying the intestinal microbial diversity of shrimp.

Synthesis and Bioactivity of Novel Benzisothiazolone Derivatives as Potential Microbiocides

Novel microbiocides 2-(hydroxymethyl)benzo[d)isothiazol-3(2H)-one (7) and (3-oxobenzo[d]isothiazol-2(3H)-yl)methyl benzencarboxylates (11a-c) were synthesized in good yields, and their structures were characterized by means of H-1 NMR, MS, and elemental analysis. The new compounds were tested preliminarily in laboratory assays against the aquicolous bacteria including Escherichia coli, Staphyloccus aurueus, Vibrio alginolyticus, Aeromonas hydrophila, and Bacillus subtilis. The results show all the synthesized compounds have good antimicrobial activity. The antimicrobial activity of all the tested compounds against all test bacteria is >96.6% at the concentration of 10(-2) mg mL(-1). These compounds can be further developed for effective microbiocides in the future.