First description of a novel Weissella species as an opportunistic pathogen for rainbow trout Oncorhynchus mykiss (Walbaum) in China

Six strains of Gram-positive, catalase-negative, non-motile, irregular short rod-shaped Weissella bacteria, with width and length of 0.5-0.6 and 1.2-2.7 mu m were isolated from diseased rainbow trout Oncorhynchus mykiss (Walbaum) in winter of 2007 at a commercial fishery in Jingmen, Hubei province, China. The diseased rainbow trout exhibited hemorrhage in eyes, anal region, intestine and abdomen wall, petechia of liver, some fish with hydrocele in stomach. Six isolates had identical biochemical reactions, phylogenetic analysis of 16S rDNA sequences, amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA), enzymatic profile analysis and antimicrobial susceptibility results, indicating as a single clonal outbreak. But all were different from any other validated twelve Weissella species in the term of physiological and biochemical characters. It is indicated that isolates are phylogenetically closer to Weissella halotolerans, Weissella viridescens and Weissella minor on 16S rDNA phylogenetic analysis result, than to W halotolerans and W viridescens on the result of ARDRA study and enzymatic profile analysis. Antimicrobial susceptibility testing was used to scan effective drugs for the therapy of this disease. Experimental infection assays with one isolate were conducted and pathogenicity (by intraperitoneal injection) was demonstrated in rainbow trout O. mykiss (Walbaum) and crucian carp (Carassius auratus gibelio) fingerlings. Because no Weissella was detected in fish feedstuffs and pond water, the source of this pathogen remains unknown, and Weissella isolates were regarded as an opportunistic pathogen for rainbow trout. This is the first report of Weissella strains which can cause disease of cultured fish in the world. (C) 2009 Elsevier B.V. All rights reserved.

Aspergillusterricola角蛋白酶高产菌株选育及酶学性质研究

根据非对称原生质体融合原理，建立了非营养缺陷型原生质体融合模型，丰富了原生质体育种方法.利用此模型进行栖土曲霉（Aspergillusterricola）不同菌株的种内融合，选育出高活性角蛋白酶生产菌.通过生长速度、分生孢子体积、孢子DNA含量的测定，并利用RAPD-PCRDNA指纹分析技术，确定其为杂合二倍体.连续传接12代后，菌株产酶性能稳定.发酵试验表明，其产角蛋白酶活性达到2840Ug<'-1>，分别比双亲的产酶能力提高了42%和30%.构建了栖土曲霉染色体基因组文库，并从文库中筛选出角蛋白酶生物合成基因的阳性克隆，为进一步在分子水平上深入研究角蛋白酶奠定了基础.

重离子辐照普通小麦间接效应的研究

应用不同能量、不同剂量的碳离子和氧离子加照普通小麦，研究其M1代和M2代的生物学（形态）性状、染色体畸变率及微核率、生理生化和DNA分子等方面的变化。并对这些变化的生物学机理进行了探讨，结果如下：1.75MeV/u~(16)O~(8+)离子经过适当降能后注入小麦种子的不同部位和贯穿整个种子，对其M1代幼苗的可溶性蛋白质组分以及电脉中不同区段蛋白质组分相对含量加以分析，结果表明：1）同对照相比，随着辐照剂量的增加，所有辐照材料（包括贯穿和注入）第二区段（分子量较高区段）蛋白质组分的相对含量下降；而第五区段（分子量最小区段）蛋白质组分的相对含量升高。2）种子的贯穿处理，同时也引起第一区段（分子量最高区段）和第三区段蛋白质组分相对含量的下降以及第四区段的升高；其中第三、四区段的变化明显区别于注入效应。3）注入胚和胚乳的区别在于后者第一区段蛋白质组分相对含量的较大下降和第五区段的较大提高。4）小剂量辐照的材料，可溶性蛋白质组分的变化异常，可能与低剂量辐射兴奋效应有关。2.碳离子注入胚乳引起胚的后代发生变异，是典型的重离子诱变产生间接效应的结果。主要表现为：1）M1代的生物学性状、幼苗的抗氧化酶活性、MDA含量、蛋白质含量和染色体畸变率及微核率等发生了较大的变化。2）对其矮杆变异株和紫色茎杆突变体（M2）和RAPD和AFLP分子鉴定等研究，结果显示了矮杆变异体和紫色茎杆突变体的DNA序列发生了改变，而非仅仅产生生理损伤；同一种变异体或突变体，在M2代单株间也存在着明显的差异，表明它们可能还处于分离状态。于是，将M2代以上高代再种，以观察遗传能否稳定。3.重离子辐照普通小麦种子的M1代正常（它们可以完成生长发育的过程）植株同对照材料做正、反交，获得染色体组等来源不同的材料。接着对对照、M2代和正、反交材料DNA进行RAPD和AFLP多态性研究，并将实验结果作统计分析，结果表明：在细胞结构层次上，染色体组作为靶物质，产生的直接效应主要引起随机突变；而非染色体组的细胞组成的间接效应主要引起非随机突变。

非营养缺陷型原生质体融合选育角蛋白酶生产菌

以两性霉素B抗性作为标记 ,通过单株灭活 ,进行栖土曲霉种内非营养缺陷型原生质体融合 .在 40 %的PEG(Mr=6 0 0 0 )促融下 ,融合频率为 1.6 2× 10 -5.连续传接 10代后 ,获得稳定的融合子 .对孢子体积、核DNA含量、生长速度进行了测定 ,并利用RAPD技术分析比较了亲本及融合子的基因组DNA指纹多态性 ,证明融合子为杂合二倍体 ,产角蛋白酶活力较亲本显著提高 .图 3表 4参 17

云南尼泊尔桤木遗传多样性研究

分别在云南省来凤山、高黎贡山、鸡足山、苍山和无量山,采集58个尼泊尔桤木Alnus nepalensis叶样品,提取总DNA,对它们进行RAPD-PCR分析。3个随机引物共扫描到DNA位点85个,其中多态性位点64个,样品内的多态性为75.30%;用非加权组法(UPGMA)聚类分析,建立尼泊尔桤木分子聚类树状图,以相似系数0.68为标准分为6类;用POPGENE软件分析Nei’s遗传多样性指数和Shannon遗传多样性指数。结果表明:云南尼泊尔桤木遗传多样性丰富,其中,鸡足山尼泊尔桤木居群多样性指数最高,无量山居群中,分布在南坡的尼泊尔桤木多样性指数高于分布于北坡的样品。尼泊尔桤木的分布及遗传结构与环境区域有密切的关系,区域特点是决定尼泊尔桤木遗传多样性水平的重要因子之一。该结果对于研究尼泊尔桤木遗传多样性以及它与共生固氮弗兰克氏菌Frankia的协同进化有一定的利用价值。

牙鲆群体遗传多样性及鲽形目鱼类分子系统学初步研究

本文以山东近海野生和养殖牙鲆Paralichthys olivaceus(T．& S.)为研究对象，采用同工酶电泳和随机扩增多态性DNA(RAPD)两种方法，进行了群体遗传学研究；另外，用PCR扩增了牙鲆、桂皮斑鲆Pseudorhombus cinnamomeus(T．& S.)、石鲽Kareius bicoloratus，Basilewsky和大菱鲆Psetta maxima 4种鲽形目鱼类mtDNA 16s rRNA基因区的部分片段，采用生物信息、学方法构建了鲽形目分子系统树。主要结果如下：1．首先建立了适于牙鲆同工酶分析的水平淀粉凝胶和垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳系统；对获得的牙鲆15种同工酶基本酶谱进行了生化遗传分析，进而对自然和养殖群体的生化遗传结构进行了分析，共记录了29个基因座位，发现了9个多态座位。2．野生群体的生化遗传参数多态基因座位比例(31．O％)、等位基因平均数(1．38)和群体平均杂合度(0．0802)都明显高于养殖群体(24．1％，1．28，O．0788)；在野生群体中有9个多态基因座位，而养殖群体仅7个多态基因座位；其中，除了Cat和Idhp-1(仅养殖群体)(P < 0．05)有显著差异、Ldh-C(P < O．01)完全偏离Hardy-Weinberg定律外，其余多态座位基因频率均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。野生和养殖群体的遗传相似性系数(I)为0．9877，它们的遗传距离(D)是0．0124；两群体间的遗传分化系数G_(st)为0．0681，D_m为0．01，表明总变异中的6．8％的遗传变异产生于群体间的基因差异。3．采用11个随机引物对20个野生个体和24个养殖个体进行了RAPD群体遗传多样性分析，分别扩增出88条和86条DNA带，片段大小在200-2500bp之间，平均每个引物扩增的带数是7．8-8．0。两个群体的多态座位比例分别是43．2％和34．9％，平均杂合度是0．2739和0．2255，而Shannon遗传多样性指数表明两群体的遗传变异中有88．12％的遗传变异来自种群内，只有11．88％的变异来自群体间。遗传分化指数G_(st)的结果也验证了Shannon遗传多样性指数的结果：总群体的遗传变异中约有12％是由两群体间的基因差异产生的。4．本文对牙鲆两个群体的同一批样品分别采用经典的同工酶方法和RAPD方法进行了较系统的比较分析。发现，RAPD所显示的多态性要比同工酶的高得多，因为大部分RAPD的变异是源于非编码区和重复DNA，可以遍布整个基因组，而同工酶仅是功能基因的产物，只表现编码区的变异。因此，自然选择在同工酶编码区的作用要多于RAPD标记。在遗传相似性系数(I)和遗传距离(D)上，RAPD的分析结果与同工酶的分析结果也是有差异的，用同工酶分析两个群体遗传距离只有0．0124，而用RAPD研究可达0．0508。遗传分化指数的差异也很大，同工酶为0．0681，RAPD为0．1237。5．RAPD和同工酶的分析结果是类似的，即自然群体的多态座位比例和平均杂合度要比养殖群体高，降低幅度在同工酶中界于1．7～22．3％之间，在RAPD中则界于15．9～19．2％之间。这充分证明了养殖群体的遗传多样性水平已有明显的丧失，值得我们注意。6．构建了鲽形目鱼类mtDNA 16S rRNA基因的分子系统树。通过分子克隆法将牙鲆、桂皮斑鲆、大菱鲆和石鲽mtDNA 16S rRNA目的基因片段连接到质粒载体上，经MegaBACE测序仪测序，分别获得了590、595、582和590bp序列，通过生物信息学方法对其进行了序列分析和核酸变异比较，结合NCBI上6种鲽形目鱼类的同源序列探讨了这4种鱼类在鲽形目中的遗传分化和分子系统进化，构建了系统树，其中，桂皮斑鲆的16S rRNA基因在系统树中的位置与物种形态资料的系统演化不相符，而其它三种很好地呈现了它们在鲽形目中的系统位置。同时，可以看出mtDNA 16S rRNA基因片段可以构建一个相对准确的树，特别是NJ树和ML树比较接近，更为客观一些。由比对序列获得的物种之间的遗传距离也基本可以反映种、属、科间的不同变异水平。

牙鲆雌核发育分析鉴定与性别决定机制研究

本研究应用同工酶和随机扩增多态性DNA（RAPD）方法，分析了牙鲆野生种群和雌核发育群体的遗传多样性和遗传分化水平；应用RAPD方法对比分析了雌核发育牙鲆的亲鱼和子代DNA样品；采用PCR扩增牙鲆SRY同源片段并进行了序列分析；将RAPD扩增产物中性别连锁DNA片克隆与测序。主要结果有：1.牙鲆雌核发育群体同工酶的Ldh-C，Cat两个基因座位发生了重组，基因座位与着丝点之间的重组率分别为52.6％和29.8％；雌核发育群体RAPD分析发现136个DNA片段中有22个发生基因分离，但由于研究方法的局限，不能确定是否发生基因重组。2.牙鲆雌核发育群体的同工酶多态座位比例和平均杂合度分别为6.90%和0.0350；研究中提出了RAPD遗传多样参数修正算法；野生种群RAPD多态片段比例37.57％，多态座位比例20.88％，平均杂合度0.0852；雌核发育群体RAPD多态片段比例16.18％，多态座位比例8.98％，平均杂合度0.03898。同工酶与RAPD方法得出结果基本一致。3.牙鲆雌核发育群体与野生群体之间的RAPD遗传相似度I＝0.9036，遗传距离D＝0.1014，已超过一般鱼类地理种群之间的遗传距离值。雌核发育群体的遗传多样性指数（H＿O＝7.1982）远低于野生群体（H＿O＝28.0986）。雌核发育与野生群体H_(pop)／H_(sp)＝0.9716，（H_(sp)－H_(pop)）／H_(sp)＝0.0284，表明97.16％的遗传多样性是由群体内不同个体间的差异造成的，只有2.84％遗传多样性与群体间分化有关。4.分析过同工酶多态座位比例、同工酶平均杂合度、RAPD多态片段比例、RAPD多态座位比例、RAPD平均杂合度、群体遗传多样性指数H＿O等遗传多样性参数，牙鲆雌核发育群体各参数比野生群体减少55.39％－77.74％，说明它的遗传多样性严重损失。5.采用RAPD对照分析亲本与雌核发育子代胚胎的DNA样品。结果表明，雌鱼有、雄鱼无的基因，雌核发育子代表达；雌鱼无、雄鱼有的基因，雌核发育子代不表达，正常受精二倍体对照组表达正常。证明牙鲆雌核发育子代的遗传物质来自母本，雌核发育诱导使用的精子经过紫外线灭活后，遗传物质已被破坏，其携带的遗传信息没有传给子代，在DNA水平证明了雌核发育诱导方法和结果的可靠性。6.进行了牙鲆性别决定机制研究。PCR分析了哺乳动物性别决定基因SRY同源片段在牙鲆的表达情况。扩产物均无个体差异，也没有性别差异。将扩增产物中信号最强的sry-2片段测序，其648bp序列与人SRY基因相应的419bp片段进行了同源性分析，两者同源性为35％，同源性很低，只有随机的碱基重合。由于牙鲆SRY PCR 扩增带没有全部分析，不能肯定牙鲆没有SRY同源片段。RAPD分析确定3个引物的4条扩增片段与性别相关，分别克隆、测序，S134和S145－S两个片段得到了完整序列。

山东沿海养殖栉孔扇贝大批死亡原因的初步研究

栉孔扇贝（Chlamysfarreri）是中国北方三种主要养殖扇贝中唯一的土著扇贝科种类,在中国主要分布在黄海北部和渤海海峡,过去一直是中国干贝的产出贝.该研究主要从养殖密度、病原、遗传三方面入手,研究和探讨造成养殖栉孔扇贝大批死亡的原因.2000年5月～9月,按高、中、低三种密度在山东胶南、蓬莱、烟台筏式挂养栉孔扇贝苗,分别在大规模死亡前、死亡高峰时和死亡后统计死亡率分别样本.对死亡期间的瞬时生长率研究发现,随着时间的推移,栉孔扇贝壳高增长率趋于减小,而扇贝全湿重的增长率却在T0-T1时间段呈现一个高峰,说明栉孔扇贝在大规模死亡前经历过一个块速增重的阶段.采用7条随机引物,对大连野生野体、韩国野生群体、中国日本杂交群体在胶南、蓬莱放养采样得到的养殖群体,总共5群体140个个体的全基因组DNA进行RAPD扩增,共扩增出37条谱带,其中30条具有多态性.

海水鱼细胞系FG、SPH和RSBF的特性分析及其在典型海洋污染物毒性检测上的应用

鱼类细胞培养已成为鱼类病毒学、肿瘤学、毒理学、遗传学和免疫学等研究的重要手段。本文首先从形态、蛋白质（同工酶）和DNA（RAPD分析）三个层次水平对牙鲆鳃细胞系FG、鲈鱼心脏细胞系SPH和真鲷鳍细胞系RSBF的特性进行了分析，并分别与其所对应的原代培养组织作了比较。形态、蛋白质和DNA分析的结果表明：(1) 三株海水鱼细胞系的乳酸脱氢酶(LDH)酶谱彼此明显不同，可作为对它们进行种属鉴定和交叉污染鉴别的有效遗传标记；(2)与所对应的原代培养组织的LDH酶谱相比，细胞系FG的LDH酶谱维持不变，而细胞系SPH和FRSBF的LFH酶酶谱变化较大；(3)与所对应的原代培养细胞的形态相比，细胞系FG的细胞形态没有明显改变，而细胞系SPH和RSBF的细胞形态则发生了明显改变；(4)60个DNA随机引物对三株细胞系及其原代培养组织的RAPD分析表明，有35－48％的引物在细胞系及其原代培养组织之间产生完全相同的RAPD指纹，为这三株细胞系种属来源的鉴别奠定了基础，另有27－32％的引物在细胞系及其原代培养组织之间产生不同的RAPD指纹，表明这三株细胞系中发生了遗传变异；(5)FG、SPH和RSBF三株细胞系与其所来源鱼类个体间的总遗传相似性指数大小为0.825-0.851，这表明了它们之间的同源性，同时为我们采用RAPD技术对其它细胞系进行种属鉴定提供了可供参考的实验数据；(6)筛选得到四个随机引物S－91、S－223、S－228和S－237，分别可参在这三株海水鱼细胞系中扩增得到特异性的彼此明显不同的RAPD指纹，这些特异性RAPD指纹在各细胞系与其原代培养组织之间，以及在细胞系的传代培养过程中是稳定的，因而这四个引物对于这三株细胞系的种属鉴定、交叉污染检测以及监测它们与其来源鱼类个体之间的遗传变异将非常有用。其次，170代以后的FG细胞发生了自发性肿瘤转化，具有了在细胞单层上聚集生长和堆积生长的能力，本文对转化前后细胞的形态、贴壁依赖性(软琼脂克隆形成实验)和遗传物质稳定性(RAPD分析)进行分析的结果表明：FG细胞失去接触抑制和生长的密主抑制，获得在细胞单层上聚集生长和堆积生长能力的同时，也获得了在软琼脂中生的能力(8－14个克隆/10~6个接种细胞)；RAPD分析表明，转化前后FG细胞的RAPD指纹发生了明显的变异。因此，FG细胞的自发性肿瘤转化也如哺乳动物细胞一样，包括一系列不断进行的细胞学和遗传学变化，并最终导致其基因组DNA的遗传变异。最后，本文分析了聚乙烯亚胺(PEI)和氯化镍在RSBF细胞中的细胞毒性和基因毒性，结果表明：鱼类细胞系RSBF可作为一个有效的检测水环境中污染的细胞毒性和基因性效应的效应的筛选系统；RAPD分析可作为一个灵敏的非专一性的基因毒性检测终点；PEI对RSBF细胞的高细胞毒性和基因毒性表明，我们在利用PEI作基因载体进行人类基因冶疗和进行鱼类转基因实验时要格外慎重；镍及其化合物可能是导致鱼类肿瘤性疾病的原因之一。

ISSR analysis of genetic diversity of the Qinghai-Tibet Plateau endemic, Rhodiola chrysanthemifolia (Crassulaceae)

Inter-simple sequence repeat markers (ISSR) were used to estimate genetic diversity within and among 10 populations of Rhodiola chrysanthemifolia along Nianqingtangula Mountains and Brahmaputra, a species endemic to the Qinghai-Tibet Plateau and an endangered medicinal plant. Of the 100 primers screened, 13 produced highly polymorphic DNA fragments. Using these primers, 116 discernible DNA fragments were generated of which 104 (89.7%) were polymorphic, indicating substantial genetic diversity at the species level. Genetic diversity measured by the percentage of polymorphic bands (PPB) at the population level ranged from 21.97% to 48.8%. Analysis of molecular variance (AMOVA) showed that the genetic variation was found mainly among populations (77.3%), but no regional differentiation was discernible. Variance within populations was only 22.7%. The main factor responsible for this high level of differentiation among populations is probably the historical geographical and genetic isolation of populations in a harsh mountainous environment. Concerning the management of R. chrysanthemifolia, the high genetic differentiation of populations indicates the necessity of conserving the maximum possible number of populations. (c) 2006 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Study on DNA Damage Induced by Neon Beam Irradiation in Saccharomyces Cerevisiae

Yeast strain Saccharornyces cerevisiae was irradiated with different doses of 85 MeV/u Ne-20(10+) to investigate DNA damage induced by heavy ion beam in eukaryotic microorganism. The survival rate, DNA double strand breaks (DSBs) and DNA polymorphic were tested after irradiation. The results showed that there were substantial differences in DNA between the control and irradiated samples. At the dose of 40 Cy, the yeast cell survival rate approached 50%, DNA double-strand breaks were barely detectable, and significant DNA polymorphism was observed. The alcohol dehydrogenase II gene was amplified and sequenced. It was observed that base changes in the mutant were mainly transversions of T-->G and T-->C. It can be concluded that heavy ion beam irradiation can lead to change in single gene and may be an effective way to induce mutation.

Development of polymorphic EST markers in Penaeus monodon: applications in penaeid genetics

The objective of this study was to develop type I markers for genome mapping and other genetic studies of Penaeus monodon. Primers were designed based on expressed sequence tags (ESTs) from a P monodon cephalothorax cDNA library to amplify 100-300 bp products. 34 of the primer pairs successfully amplified PCR products from genomic DNA. Single-strand conformation polymorphism analysis showed that similar to 30% of the ESTs tested exhibit polymorphism in a test panel of P monodon individuals. Mendelian inheritance of the EST-derived markers has been established in two international reference mapping families of P monodon, and mapping of these markers is in progress. Some ESTs were successfully amplified from other Penaeus species (P. chinensis, P japonicus and P vannamei), indicating that the markers are applicable in cross-species comparison. Two populations of P. japonicus could be differentiated using one of the ESTS. In conclusion, the polymorphic EST markers developed in this study are applicable in genome mapping and population genetic studies of penaeid shrimp. (C) 2002 Elsevier Science B.V. All rights reserved.