Recent origin of a hominoid-specific splice form of neuropsin, a gene involved in learning and memory

Neuropsin is a secreted-type serine protease involved in learning and memory. The type II splice form of neuropsin is abundantly expressed in the human brain but not in the mouse brain. We sequenced the type II-spliced region of neuropsin gene in humans and representative nonhuman primate species. Our comparative sequence analysis showed that only the hominoid species (humans and apes) have the intact open reading frame of the type II splice form, indicating that the type II neuropsin originated recently in the primate lineage about 18 MYA. Expression analysis using RT-PCR detected abundant expression of the type II form in the frontal lobe of the adult human brain, but no expression was detected in the brains of lesser apes and Old World monkeys, indicating that the type II form of neuropsin only became functional in recent time, and it might contribute to the progressive change of cognitive abilities during primate evolution.

树鼩IL-2Rα(CD25)基因的分离、鉴定及表达分析

3%～66.4%.RT-PCR检测发现,tsCD25 mRNA分布于树鼩的外周血、脾脏和肺,并受PMA 和 ionomycin 刺激的调节.我们的结果为下一步制备tsCD25单克隆抗体,抑制CD4+CD25+Tregs功能以及开展有关的研究工作奠定了基础.

竹叶青蛇毒凝血酶样酶氨基酸序列报道

利用逆转录与聚合酶链反应相结合的RT-PCR法,扩增出竹叶青蛇毒凝血酶样酶(TSV-TEL1)的cDNA;将扩增的cDNA片段克隆入pGEM-T载体中,经末端终止法测定核苷酸序列,推导出竹叶青蛇毒凝血酶样酶的全序列。竹叶青毒凝血酶样酶由234个氨基酸组成并含有1个位于Asn~(20)的N-型糖基结合位点。竹叶青蛇毒凝血酶样酶序列与其它蛇种来源凝血酶样酶具有较大相似性,其与黄绿烙铁头蛇毒凝血酶样酶序列相似度为84%,与美洲矛头蝮蛇毒凝血酶样酶序列相似度为68%,而与牛凝血酶B链序列相似度仅为25%。

竹叶青蛇毒丝氨酸蛋白酶的分子克隆和序列比较

利用逆转录酶与聚合酶链反应相结合的 RT-PCR 法, 扩增出5个竹叶青(Trimeresurus stejnegeri)蛇毒丝氨酸蛋白酶的 cDNAs; 将扩增的 cDNA 片段克隆入 pGEM-T 载体中, 筛选得到它们的基因, 分别命名为TSSP-1、TSSP-2、TSSP-3、TSSP-4 和 TSSP-5. 经末端终止法测定核苷酸序列, 推导出5个丝氨酸蛋白酶的全序列; 结合纯化的蛋白酶N-末端序列测定结果, 推导 TSSP 2、3和4分别编码凝血酶样酶 stejnobin、纤溶酶 stejnefibrase 1和2. 5个丝氨酸蛋白酶分别含有1～6个N-型糖基结合位点, 表明它们的计算分子量与纯化蛋白表观分子量之间的差异是由糖含量的不同造成, 而其氨基酸序列相似度在60%-90%, TSSP-1 和-2编码的成熟蛋白酶山236个氨基酸残基组成, TSSP-3, -4 和 -5的则山234个氨基酸残基组成, TSSP-1编码的蛋白酶在组成丝氨酸蛋白酶三联体催化活性中心产生了 His~(41)-Arg~(41)的在然突变, 这与其他自然界发现的丝氨酸蛋白酶明显不同。

菜花烙铁头蛇毒C－型凝集素基因的克隆与序列分析

从菜花烙铁头蛇(Trimeresurus jerdonii)的毒腺中提取mRNA,采用RT－PCR技术进行体外扩增，将扩增产物克隆到PMD18－T载体中，最后筛选出一个编码凝集素的基因，命名为TJL。由TJL基因序列推导的氨基酸序列中包含分别由23和135个氨基酸残基组成的信号肽和成熟肽。氨基酸序列比较分析表明，TJL含有半乳糖结合位点和钙离子结合位点，与蝰科蛇互凝集素TSL、PAL、APL和RSL的同源性较高(87.4%～90.4%)，与眼镜蛇科蛇互凝集素BML的同源性较低(61.5%)。

四个烙铁头蛇毒凝集素样蛋白基因的克隆与序列分析

从烙铁头蛇（Trimeresurus mucrosquamatus）的毒腺中提取mRNA，利用RT-PCR进行体外扩增，获得凝集素样蛋白基因，克隆至PMD18-T载体中，筛选出4种凝集素样蛋白基因（命名为TML-1、TML-2、TML-3和TML-4）。由基因序列推导出的氨基酸序列表明：TML-1，2，3，4序列中均有CRD结构。序列同源性比较和Cys位点分析推测：TML-1和TML-2可能分别是类似于flavocetin-A的蛇毒凝集素样蛋白的#alpha#亚基和#beta#亚基；TML-3可能类似于GPIb-bp的蛇毒凝集素样蛋白的#alpha#亚基，TML-4则可能是类似于IX/X-bp的蛇毒凝集素样蛋白的β亚基。

不同地区舟山种和孟加拉种眼镜蛇的神经毒素

先前的工作发现，眼镜蛇孟加拉种的神经毒分布存在明显的地理差异，但是导致这种现象的原因还不是很清楚。该工作首先采集夏季的眼镜蛇种，进行分类学的鉴定，以排除因为种属分类、季节和年龄而导致的不确定因素对蛇毒成分产生影响。再从鉴定好的成年浙江舟山种和云南孟加拉种眼镜蛇蛇毒中分离获得短链神经毒素;同时采用RT PCR方法得到相应 的基因。结果从浙江舟山种眼镜蛇蛇毒中分离到两个神经毒素;从云南孟加拉种蛇毒中得到三个神经毒素。这些神经毒素都是短链神经毒素。说明该两个蛇种与已经报道的台湾及浙江的舟山种眼镜蛇很相似，蛇毒中都以短链神经毒素为主。另外泰国孟加拉种眼镜蛇蛇毒中则以长链神经毒素为主。这种现象很难用种群发生的前后或者地理距离的长短来解释，而可能与地区间的气候、地理环境或者眼镜蛇的食物差别相关。实验统计表明在云南、浙江和台湾这些条件基本相似，而泰国就有很大的不同。

Temporal and Spatial Expression Patterns of Sox1 Gene in Xenopus laevis

克隆了非洲爪蟾的Sox1基因并研究了它在非洲爪蟾早期发育过程中的时空表达图式,比较了Sox1-3基因在发育的脑和眼中的表达图式.序列比对分析显示Sox1-3蛋白在其HMG框结构域具有高度的保守性.通过RT-PCR方法分析了Sox1基因在爪蟾早期不同发育时段的表达情况,结果显示Sox1基因从未受精卵到尾芽期均有表达,但表达强度有所差异.原位杂交结果显示,在早期卵裂阶段和囊胚期,Sox1基因主要在动物极表达;从神经板期开始,Sox1基因主要在中枢神经系统和眼原基中表达.在蝌蚪期,Sox1与Sox2、Sox3在脑部和眼睛的表达区域有所不同.对于爪蟾Sox1基因时空表达图式的研究将有助于阐明SoxB1基因家族在脊椎动物神经系统发生过程中的作用.

人、黑猩猩和叶猴FKN全基因的克隆及体外表达的比较研究

下载PDF阅读器目的:克隆人、黑猩猩和叶猴FKN全基因及体外表达,比较研究FKN在进化过程中基因组水平和蛋白表达水平的差异.方法:应用基因重叠延伸拼接PCR法(Gene splicing by overlapping extension PCR,SOE-PCR)将FKN的3个外显子编码序列依次进行前后拼接,然后插入pcDNA3.1/myc-His(-)A真核表达载体中,经酶切、测序鉴定后转染CHO细胞体外表达,RT-PCR、SDS-PAGE和Western blot检测其表达产物.结果:酶切、测序鉴定证实插入的基因片段为完整的FKN,RT-PCR可从转染的CHO细胞中扩增出一条与目的基因大小一致的DNA片段,其表达蛋白能分泌至胞外,SDS-PAGE显示其分子量约为95 000,抗c-myc抗体可与载体上的c-myc蛋白特异性结合.测序显示人、黑猩猩和叶猴相比,FKN基因除了有散在的点突变外,还发现有一明显的30 bp的缺失,但此缺失对FKN蛋白的表达并不影响.结论:成功克隆人、黑猩猩和叶猴FKN全基因,基因组水平和蛋白表达水平的比较研究为后续探讨FKN在高级灵长类物种进化过程中免疫学功能的演变奠定基础.

S-DABO 类衍生物及AZT-氟喹喏酮类偶联物体外抗HIV 活性及机制研究

本论文由2 个相对独立的部分组成: S-DABO 类衍生物体外抗HIV 活性及 其机制研究和AZT－氟喹喏酮类偶联物体外抗HIV-1 活性及其机制研究。 HIV 逆转录酶抑制剂一直是抗HIV 药物研发的热点。该类抑制剂靶定在病 毒复制周期早期，为HAART 疗法提供了很多新的药物组合。目前FDA 批准上 市的逆转录酶抑制剂虽然有很多，但由于较严重的毒副作用、HIV 病毒易变异、 耐药性的出现等问题还需要开发更多的新的逆转录酶抑制剂。本论文对23 个 S-DABO 类化合物和8 个AZT－氟喹喏酮类偶联物的体外抗HIV 活性进行检 测，并对其中活性较高的化合物进行靶点和机制研究。 23 个S-DABO 类化合物采用对C8166 细胞的毒性试验，对HIV-1ⅢB 诱导的 合胞体形成的抑制试验和对HIV-1ⅢB 急性感染的MT-4 细胞的保护试验进行抗 HIV-1 活性初步筛选。试验结果发现所有化合物均对多种HIV 宿主细胞毒性小， 其中22 个化合物具有抗HIV-1 活性，特别是化合物RZK-4 和RZK-5，其对 HIV-1ⅢB 诱导的合胞体形成的SI 值（Selective index）分别为>16666 和>38462； RZK-4 和RZK-5 对HIV-1ⅢB 急性感染的MT-4 细胞的保护的SI 值分别为2666.67 和2150.54，与相应的阳性对照药品NVP（Nevirapine）的SI 值相接近。以p24 抗原水平为指标，对其中20 个化合物的抗HIV-1 活性进行确证，发现这20 个 化合物均能抑制 HIV-1ⅢB p24 抗原的产生，其中RZK-4 和RZK-5 的EC50 值分 别为5.93 和5.74ng/ml，比相应的阳性对照药品NVP（Nevirapine）的EC50 值 要低（27.3ng/ml）。这些化合物对试验株HIV-1MN、临床分离株HIV-1KM018、非 核苷类抑制剂耐药株HIV-1ⅢB A17 也有较好的抑制效果。但这23 个S-DABO 类化合物对HIV-2 病毒株均无抑制作用。通过检测化合物对感染与未感染细胞的 融合的抑制、对HIV-1 逆转录酶和蛋白酶活性的抑制、对慢性感染H9 细胞 （H9/HIV-1ⅢB）中病毒复制的抑制等试验来探讨化合物的抗HIV-1 机制。结果 显示：有20 个化合物对HIV-1 蛋白酶（PR）有抑制作用，其中有17 个化合物 对HIV-1 逆转录酶（RT）有抑制作用；但所有化合物均不能抑制感染与未感染 细胞的融合，也不能抑制慢性感染H9 细胞中病毒的复制。试验结果表明，这 23 个S-DABO 类化合物主要通过抑制HIV-1 逆转录酶来发挥作用，它们是典型 的非核苷类RT 抑制剂。 8 个AZT－氟喹喏酮类偶联物采用对C8166 细胞的毒性试验，对HIV-1ⅢB 诱导的合胞体形成的抑制试验和对HIV-1ⅢB急性感染的MT-4 细胞的保护试验 进行抗HIV-1 活性初步筛选。试验结果发现其中2 个化合物SRLZ 和SROZ 有 较显著的抗HIV-1 活性，其对HIV-1ⅢB诱导的合胞体形成抑制的SI 值分别为 >41667 和>105263；对HIV-1ⅢB 急性感染的MT-4 细胞的保护的SI 值分别为 30162 和 6368，与AZT（Zidothymidine）的SI 值相近似。以p24 抗原水平为 指标，对其抗HIV-1活性进行确证，发现化合物SRLZ和SROZ均能抑制HIV-1ⅢB p24 抗原的产生，其EC50 值分别为 0.71 和2.1ng/ml,比相应的阳性对照药品AZT 的EC50 值要低（3.5ng/ml）。化合物SRLZ 和SROZ 对临床分离株HIV-1KM018 也有较好的抑制活性，其EC50 值分别为1.4 和22ng/ml。通过检测化合物对慢 性感染H9 细胞（H9/HIV-1ⅢB）中病毒复制的抑制试验来探讨化合物的抗HIV-1 机制，结果表明化合物SRLZ 和SROZ 均不能抑制慢性感染H9 细胞中病毒的 复制。通过检测化合物对金黄色葡萄球菌的抑制作用来检测其抗菌活性，化合 物SRLZ 和SROZ 对金黄色葡萄球菌有较好的抑制作用，其MIC（Minimum inhibitory concentration）值分别为14.65 和7.32μg/ml，与其相应的阳性对照药 物的MIC 值相类似。试验结果表明：药物—药物偶连这种化学修饰方法并没有 改变AZT－氟喹喏酮类偶联物的抗HIV 作用靶点，但也没有较大地影响到其体 外抗病毒活性和抗微生物活性。

恒河猴CD1d基因的克隆及其组织表达差异性分析

目的:克隆非人灵长类疾病动物模型-恒河猴的CD1d基因并检测其在不同组织中的表达差异情况.方法:提取恒河猴血液及各组织的RNA, 以反转录得到的cDNA为模板, 用特异性引物扩增CD1d;以管家基因GAPDH为内参, 用半定量RT-PCR的方法对CD1d的组织表达差异性进行分析.结果:成功扩增了恒河猴CD1d基因的编码区序列;首次用半定量RT-PCR的方法检测了CD1d mRNA在恒河猴部分组织中的表达情况, 发现其表达水平存在明显的组织差异性, 其中, 在肝脏、脾脏和心脏中的表达水平较高, 在血液、小肠和肺中次之, 在脑中表达最少.结论:研究结果为今后表达恒河猴CD1d蛋白并制备其四聚体进而研究恒河猴NKT细胞在众多疾病中的作用奠定了基础;组织表达差异的研究结果提示其在相关疾病的发生发展过程中可能扮演着重要的角色, 具体作用还有待深入研究.

稳定表达HIV-1辅助蛋白Rev的THP-1细胞模型的建立和鉴定

Human immunodeficiency virus-1(HIV-1)辅助蛋白在其感染和艾滋病发病过程中起着非常重要的作用.Regulator of expression of virion proteins(Rev)作为HIV-1辅助蛋白之一,可以调节病毒结构蛋白mRNA出核转运和蛋白表达,对于病毒的复制至关重要.为研究Rev蛋白对靶细胞表犁和功能的影响,本实验采用电穿孔的方法,将HIV-1的rev基因导入THP-1细胞,通过流式分选结合G418筛选的方法建立稳定表达Rev蛋白的细胞模型;并通过RT-PCR、荧光观察及流式检测的方法,在mRNA和蛋白两个水平对所建立的细胞模犁进行鉴定.结果证实rev基凶成功导入了THP-1细胞并稳定表达,为后续rev基因产物与细胞相互作用的研究提供了平台.

人胎脑NT-4基因的体外构建

目的 体外构建人神经生长因子-4(neumtrophin-4,NT-4)与质粒载体pEGFP-N1(卡那霉素抗性)的重组体,为后续的转基因移植治疗脊髓损伤创造条件.方法 用Trizol法提取人胎脑组织总RNA,经RT-PCR扩增,EorR I和BamH I核酸内切酶酶切电泳纯化获得人神经营养因子-4(NT-4)DNA.用含质粒载体pEGFP-N1DNA的大肠杆菌接种经划板,挑选菌落、振荡培养,并用碱裂解法提取质粒载体pEGFP-N1DNA,经酶切、电泳纯化后,通过连接、转化感受态细胞,DNA小量提取法获得NT-4目的基因与质粒载体pEGFP-N1 DNA的重组体,经DNA测序证实.结果 用上述方法成功获得NT-4-pEGFP-N1重组体.结论 此方法是一种体外构建人胎脑NT-4基因的成熟、稳定而有效的方法,可为后续的神经干细胞转染NT-4基因移植治疗神经系统损伤创造条件.

恒河猴TRIM5α的组织分布及不同刺激促进PBMC中TRIM5α转录水平的上调

TRIM5α(tripartite motif protein 5-alpha)蛋白是恒河猴体内一种非常重要的限制因子,能抑制人免疫缺陷病毒(HIV-1,human immunodeficiency virus type 1)、马感染性贫血病毒(EIAV, equine infectious anemia virus)和猫免疫缺陷病毒(FIV, feline immunodeficiencyvirus)等逆转录病毒的复制.恒河猴TRIM5α的组织分布以及在受到外界刺激时TRIM5α mRNA表达量的变化研究还未见报道.本研究从中国恒河猴的各组织中提取总RNA,以β-actin基因作为内参照,通过半定量RT-PCR检测各组织中TRIMSα mRNA的表达.选择HIV-GFP-VSVG假病毒感染外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),非特异性刺激剂--佛波脂(Phorbol myfismte acetate,PMA)+离子霉素(ionomycin,Ion)及CD28抗体+CD49d抗体分别共刺激恒河猴PBMC,研究不同刺激对恒河猴TRIM5α mRNA表达水平的影响.结果表明:TRIM5α mRNA表达于所研究的恒河猴21种组织中,免疫系统和泌尿生殖系统组织中表达量最高,而神经系统组织,如大脑、脊髓中表达较少,其他组织中未见明显的表达差异;HIV-GFP-VSVG感染和用PMA+Ion、CD28抗体+CD49d抗体分别共刺激PBMC能促进PBMC中TRIM5α mRNA的转录水平的上调.

四个小檗碱类化合物的体外抗HIV-1活性

目的:研究小檗碱和巴马汀母核上己基的引入对化合物抗HIV-1活性的影响,并比较结构相似的小檗碱和巴马汀抗HIV-1活性的差异.方法:考察4个化合物对重组HIV-1 RT活性、HIV-1复制和细胞毒性的影响.结果:小檗碱和巴马汀有较强的体外抑制HIV-1重组逆转录酶活性, EC50分别是63.1和44.52 μg·mL-1;己基巴马汀有一定的抗HIV-1活性,合胞体抑制的EC50是0.08 μg·mL-1,治疗指数为11.38;巴马汀对各种细胞系的细胞毒性较其他3种化合物小.结论:己基巴马汀有一定的抗HIV-1活性,己基的引入可能改变了其作用机制,提示构效关系的研究将为寻找高效低毒的天然化合物提供实验依据.